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Methodenartikel

Präparation von neovaskulären Geweben aus humanen Gliomgeweben für quantitative proteomische Analyse der Tumorangiogenese

496 Aufrufe

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DOI:

10.3791/69547

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20. März 2026

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1Shandong Provincial Key Laboratory of Precision Oncology, Shandong Cancer Hospital and Institute, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 2Shandong Provincial Key Medical and Health Laboratory of Ovarian Cancer Multiomics, & Jinan Key Laboratory of Cancer Multiomics, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 3School of Medicine, Wayne State University, 4Department of Pathology, The Second Xiangya Hospital, Central South University, 5Hunan Clinical Medical Research Center for Cancer Pathogenic Genes Testing and Diagnosis,, 6Department of The 1st General Surgery, The Third Xiangya Hospital, Central South University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bereitete erfolgreich ausreichend hochwertiges neovaskuläres Gewebe aus Gliomproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion für eine quantitative proteomische Analyse der Tumorangiogenese vor, überwand die Einschränkungen von Studien, die traditionell hauptsächlich auf angiogene Faktoren fokussiert sind, und lieferte ein großflächiges proteomisches Profil der Gliomangiogenese.

Zusammenfassung

Gliom stellt primäre bösartige Tumore des zentralen Nervensystems mit signifikanter Häufigkeit und Mortalität dar. Die Tumorangiogenese ist das Markenzeichen der Gliompathophysiologie und ein wichtiges Ereignis im Tumorumfeld. Die abnormale Struktur der Tumor-Neovaskularisation erfüllt zwei Funktionen: eine Nährstoffquelle und ein metastasiertes Portal, das die Invasion von Tumorzellen in den Blutkreislauf ermöglicht. Die Anti-Angiogenese-Therapie ist ein heißes Thema im Bereich Krebs. Die meisten früheren Studien konzentrieren sich auf die aktivierenden und hemmenden Faktoren der Tumorangiogenese; Dies klärt jedoch nur die Tumorangiogenese in einem sehr begrenzten Bereich. Abnormale Proteinexpression oder posttranslationale Veränderungen tragen zur abnormen Morphologie der Blutgefäße im Gliom bei. Dieses Protokoll verwendete Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM), um eine ausreichende Menge neovaskulärer Gewebe aus Gliomgeweben zu isolieren und zu reinigen, was für isotopenmarkierte quantitative Proteomik-Analysen verwendet wurde, um differenziell exprimierte Proteine in neovaskulären Gliomgeweben im Vergleich zu Kontrollen zu identifizieren. Diese Daten bilden eine entscheidende wissenschaftliche Grundlage zur Aufklärung der pathologischen Mechanismen der Tumorangiogenese, zur Entdeckung antiangiogener therapeutischer Ziele und zur Entwicklung tumorangiogenesebasierter Biomarker.

Einleitung

Gliome sind hoch heterogene Tumoren des zentralen Nervensystems (ZNS), die von Gliazellen stammen, strukturelle und metabolische Unterstützung für Neuronen1 bieten und histologisch in Subtypen eingeteilt werden: Astrozytome, Oligodendrogliome und Ependymome2. Nach dem WHO-Bewertungssystem sind die Gliomgrade I und II die niedriggradigen Gliome (LGG), die typischerweise durch langsame Wachstumsraten und potenzielle langfristige Stabilität gekennzeichnet sind und oft aufgrund der anatomischen Lage chirurgisch resektioniert werden können. Im Gegensatz dazu sind die Grade III und IV die hochgradigen Gliome (HGG), überwiegend undifferenziert und bösartig mit hochinvasivem Verhalten und schlechter Prognose3. Die aktuellen Behandlungen bleiben begrenzt und weitgehend wirkungslos; Während maximale sichere Resektion in Kombination mit postoperativer Strahlentherapie/Chemotherapie die Prognose mäßig verbessert, bestehen erhebliche Einschränkungen und Toxizitäten aufgrund des diffusen infiltrativen Wachstums der Tumore und undeutlicher Grenzen, die eine radikale Resektion verhindern 4,5. Humane Gliome, insbesondere hochgradige Gliome, sind hoch vaskuläre bösartige Tumore, deren Wachstum, Proliferation und Invasion stark von ihrer abnormen Neovaskularisation abhängen, was ein kritisches Merkmal der Gliommalignität 6,7 ist. Die gezielte Studie zur Tumorangiogenese hat bedeutende wissenschaftliche Qualitäten für therapeutische Durchbrüche.

Angiogenese umfasst im Wesentlichen die Proliferation, Migration und Differenzierung von Endothelzellen unter spezifischen Reizen, wobei sich die Forschung auf Regulatoren konzentriert: (i) Induktoren, darunter der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF)8, Vasorin (VASN)9, hypoxie-induzierender Faktor 1 (HIF1)10, transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β)11, Endocan12, thrombozytenabgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF)13 und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)14; und (ii) Inhibitoren, darunter Angiostatin15, Endostatin16, plättchenaktivierende Faktor-Rezeptor-1 (TSP-1)17 und Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs)18. In klinischen Studien zu Hirntumoren in Phase I/II/III zielen die meisten antiangiogenen Medikamente auf die VEGF-Signalübertragung ab, da sie eine zentrale Rolle bei der Angiogenese spielt, veranschaulicht durch Bevacizumab, einen monoklonalen Antikörper, der die Neovaskularisation durch die VEGF-Blockadehemmt. Allerdings zeigten neuere Phase-II/III-Studien keinen signifikanten Gesamtüberlebensvorteil für fortgeschrittene Glioblastom-Patienten, die Bevacizumab plus Lomustin erhielten, im Vergleich zu Lomustin allein 19,20,21,22. Entscheidend ist, dass die Anti-VEGF-Therapie die Gefäßauffälligkeiten verbessert, aber nur die Angiogenese ohne direkte Tumorzytotoxizität unterdrückt und eine Therapieresistenz hervorrufen kann. Folglich führt das Angreifen eines einzelnen oder weniger angiogenen Regulatoren nicht zu einer radikalen Heilung; Wirksame Strategien erfordern eine gleichzeitige Unterdrückung der Angiogenese sowie die Blockade von Tumorinvasion und Metastasen durch Gefäßwege. Der diagnostische und prognostische Wert von Proteinen bei Gliomen ist gut belegt, doch die Behandlung von bösartigen Gliomen hat über Jahrzehnte nur begrenzte Fortschritte erzielt.

Die Proteomik kann weltweit alle Proteine in biologischen Proben analysieren, einschließlich Expressionsprofile, posttranslationaler Modifikationen (PTMs) und Interaktionen, mit massenspektrometriebasierten (MS)-basierten Techniken, einschließlich Top-down- (TDP) und Bottom-up-(BUP)-Ansätzen. Hochdurchsatz-MS ermöglicht die Identifizierung von Zehntausenden von Proteinen pro Durchlauf, was sie für die Untersuchung von Tumormechanismen und die Identifizierung therapeutischer Ziele unerlässlich macht. Die Proteinhäufigkeit und ihre PTMs können in Gliomgeweben und Flüssigkeitsbiopsien wie Blut und dessen Derivaten23, 24, 25, Libramarkalflüssigkeit26 und Urin27 identifiziert werden. Bei der Tumorgefäße treiben abnormale Proteinexpressionen und PTMs pathologische Gefäßveränderungen voran. Die Proteinveränderungen bei der Neovaskularisation des Glioms können mit der Proteomik identifiziert werden, die die Entwicklung des Protokolls für eine zuverlässige proteomische Profilierung der Gliom-Neovaskularisation vorantreibt.

Neovaskuläre Gewebe sind jedoch nur eine der Komponenten des gesamten Gliomgewebes. Die Isolierung und Reinigung neovaskulärer Gewebe aus dem gesamten Gliomgewebe ist der entscheidende Schritt für eine genaue quantitative proteomische Analyse der Gliomangiogenese. Die Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM)28,29,30,31 ist ein effektiver Ansatz, um neovaskuläres Gewebe aus vollständigen Gliomgeweben zu isolieren und zu reinigen. Es ist sehr schwierig, eine ausreichende Menge neovaskulärer Gewebeproteine für quantitative Proteomik zu erhalten. Im Jahr 2007 versuchte ein Forschungsteam, LCM zu verwenden, um neovaskuläres Gewebe von Grad-IV-Gliom für eine proteomische Analyse zu trennen, wobei nur vier Proteine mit MS32 identifiziert wurden. Anschließend wurde 2012 kontinuierlich LCM eingesetzt, um neovaskuläres Gewebe mit Grad-IV-Gliomen für quantitative Proteomik-Analysen anzureichern, wobei nur 29 Proteine mit MS33 identifiziert wurden. Diese beiden Proteom-Studien zur Proteomenese zeigen einen sehr niedrigen proteomischen Durchsatz bei der Gliomangiogenese, was die komplexe proteomische Landschaft der Gliomangiogenese nicht widerspiegeln kann.

Dieses Protokoll entwickelte ein Verfahren, das die Gewinnung ausreichender Mengen neovaskulärer Proteine für die quantitative proteomische Analyse der Gliomangiogenese ermöglicht und so eine großflächige proteomische Landschaft der Tumorangiogenese aufbaut. Dies hat erheblichen wissenschaftlichen Wert für die Entdeckung wirksamer, angiogenesebasierter Biomarker und therapeutischer Ziele/Medikamente gegen Angiogenese.

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Protokoll

Dieses Protokoll mit menschlichen Gewebeproben wurde vom Medical Ethics Review Committee der Shandong First Medical University genehmigt (Genehmigung Nr. R202211090133), und die informierte Zustimmung wurde von Patienten und deren Familien eingeholt. Die in dieser Studie verwendeten Gliomproben wurden alle aus neurochirurgisch resezierten Proben der Neurochirurgie-Abteilung des Xiangya Hospital der Central South University gewonnen, darunter 7 Fälle von Astrozytom-Gewebe der Stufe III. Die normalen Kontrollgefäße (n = 3) wurden aus Mikrogefäßen im beschädigten Hirngewebe entnommen, das aufgrund eines zerebralen Traumas entfernt wurde. Alle Patienten waren Erstbesucher ohne vorherige Strahlen- oder Chemotherapie vor der Operation und wurden alle von der Pathologieabteilung des Xiangya Hospital der Central South University diagnostiziert. Drei normale kontrollierte Gefäßgewebe werden durch eine neurochirurgische Resektion sehr winziger Blutgefäße aus normalen, durch äußere Kraft (ohne Gliom) geschädigten Gehirn im Xiangya-Krankenhaus gewonnen. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Verwendung von LCM zur Isolierung neovaskulärer Gewebe aus menschlichen Gliomgeweben

  1. LCM-Objektträger vorbereiten: Polyethylen-Naphthalatmembran (PEN) manuell auf wiederverwendbare Metallobjekte beschichten und beschichtete Objektträger bei -80 °C aufbewahren.
    HINWEIS: Vorbeschichtete Metallobjektträger werden verwendet, um die gefrorenen Gewebeabschnitte direkt anzubringen.
  2. Bereite eine Toluidinblau-Färbungslösung vor (0,5 %). Löse 0,25 g Toluidinblau in 40 mL ddH₂O. Gib eine Proteaseinhibitor-Tablette hinzu und rühre, bis sie vollständig gelöst ist. Lautstärke auf 50 mL mit ddH₂O einstellen, filtern und auf Eis lagern.
  3. Prozessgewebe: Kryostat bei Betriebstemperatur (-25 °C Kammer/Probekopf) aufrechterhalten. Gliomgewebe aus -80 °C Speicher entnehmen, auf Eis übertragen, Blut mit Filterpapier entfernen und geeignete Gewebeblöcke für das Einbetten auswählen.
  4. Gewebeprotokoll einbetten: Probenscheibe vor dem Abkühlen. Trage das Einbettmedium auf und setze den Gewebeblock schnell ein. Friere den gesamten Block für 10 Minuten bei -25 °C zum Aushärten ein.
  5. Schnittgewebe und Screen-Gefäße: Schnittgewebe mit einer Dicke von 8 μm. Gewebeschnitte auf Standard-Objektträgern montieren, Gewebe mit einer Toluidinblau-Färbungslösung färben und neovaskuläre Gefäße unter optischer Mikroskopie abschirmen.
    HINWEIS: Wenn keine Gefäße festgestellt werden, entsorgen Sie 3–5 Gewebeschnitte und wiederholen Sie den Färbungszyklus, bis neovaskuläre Gefäßregionen auftreten.
  6. Montage von gefäßpositivem Gewebeschnitt auf dem vorbereiteten LCM-Objektträger: Gefäßpositive Schnitte auf PEN-beschichtete LCM-Objektträger übertragen, versiegeln, beschriften und bei -80 °C aufbewahren.
  7. Fixieren Sie LCM-Folienschnitte in vorgekühltem 70%igen Ethanol (4 °C, 1–2 Min); abtropfen und beizen in 0,5 % Toluidinblau (4 °C, 30 s); Färbe ablassen, zweimal in ddH₂O (4 °C; zwei separate Waschbäder) abspülen, abtropfen, in Proteaseinhibitorlösung (30 s) inkubieren und bei -80 °C lagern.
  8. Starten Sie das LCM-Instrument im Voraus, vorheizen Sie 30 Minuten, verwenden Sie einen Festkörper-Infrarotlaser zum Vorheizen für weitere 30 Minuten und installieren Sie anschließend ein 500 μL Mikrozentrifugenröhrensammelgerät.
  9. Laden Sie die an der Gewebeprobe montierten LCM-Schnitte (gelagert bei -80 °C) auf das vorbereitete LCM-Instrument und passen Sie mit Unterstützung der kompatiblen Software den Fokus auf die neovaskulären Gefäße im Gliomgewebe an.
  10. Ziehen Sie die Lasermarkierungslinie entlang des äußeren Randes des neovaskulären Gefäßes präzise ab (vermeiden Sie die Gefäßwand), verwenden Sie den Laser, um die neovaskulären Gefäße zu verbrennen und zu trennen, und sammeln Sie sie dann in der EP-Röhrenkappe.
    HINWEIS: Verwenden Sie die zweite Laserverbrennung, um sicherzustellen, dass die neovaskulären Gefäße vollständig abgelöst sind.
  11. Wenden Sie das gesammelte neovaskuläre Gefäßprobenrohr um und versiegeln Sie es und lagern Sie es in einem -80 °C Gefrierfach.

2. Extraktion von Proteinen aus LCM-isolierten neovaskulären Gliomgeweben und Quantifizierung des Proteingehalts

  1. Bereiten Sie einen Proteinextraktionspuffer vor, der 4 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 150 mM Tris-HCl (pH 8,0) enthält.
    HINWEIS: SDS ist ein gefährlicher Staub, der Augen, Haut und die Atemwege stark reizt und in einer Abzughaube gewogen werden muss; und DTT ist ein Reizstoff, der in einer Abzugshaube gewogen werden muss.
  2. Suspendieren Sie das von LCM gesammelte neovaskuläre Gefäßgewebe des Glioms in einem Extraktionspuffer. Sonikieren Sie 1 Minute lang in einem Eiswasserbad für eine vollständige Lyse.
  3. Zentrifugiere mit 16.000 x g für 10 Minuten und übertrage Supernatant auf neue Mikrozentrifugenröhren.
  4. Aliquot minimaler Supernatant zur Proteinquantifizierung. Fügen Sie DTT zum verbleibenden Supernatant hinzu (Endkonzentration: 1 mM DTT), mischen Sie vorsichtig durch Pipetten, um Blasen zu vermeiden. Aliquot und bei -80 °C lagern.
  5. Führen Sie einen Protein-Test mit Bicinconinsäure (BCA) und folgen Sie den folgenden Schritten:
    1. Bereite eine funktionierende Lösung vor (Reagenz A:B = 50:1).
    2. Stellen Sie Rinderserumalbumin (BSA) standardmäßig (0,5 mg/mL) her.
    3. Fügen Sie die entsprechenden Lösungen gemäß Tabelle 1 hinzu.
    4. Mische Proben/Standards mit der Arbeitslösung und übertrage sie auf eine 96-Well-Platte.
    5. Inkubiere bei 37 °C für 30 Minuten.
    6. Misse die Absorption bei 562 nm.
    7. Berechnen Sie die Konzentrationen gegen die Standardkurve.

3. Verwendung quantitativer Proteomik zur Analyse der präparierten neovaskulären Proteine

  1. Bereite tryptische Peptidproben der extrahierten neovaskulären Proteine vor.
    1. Geben Sie eiskaltes Aceton zu jeder extrahierten Proteinprobe (Tumor; Kontroll) (Probe: Aceton = 1:5, v/v), mischen Sie gründlich und inkubieren Sie bei -20 °C für 1 Stunde. Zentrifugiere bei 12.000 x g (4 °C) für 15 Minuten. Entsorge Supernatant zur Entfernung von Proteinextraktionsreagenzien (SDS, DTT und Tris-HCL) und suspendiere Pellet in einem 20-μL-Auflösungspuffer mit 1 μL 1 % SDS.
      HINWEIS: Verwenden Sie Aceton mit ausreichender Belüftung und tragen Sie eine Schutzbrille, vermeiden Sie Zündquellen und entsorgen Sie Abfälle in einem speziellen, funkensicheren Behälter.
    2. Fügen Sie jeder Probe 2 μL Reduktionsreagenz (DTT) hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie bei 60 °C für 1 Stunde. 1 μL cysteinblockierendes Reagenz (Iodoacetamid) hinzufügen und dann 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Gib jeder Probe Trypsin (Protein: Trypsin = 20:1, v/v) hinzu. Wirbelmischung und Inkubation bei 37 °C über Nacht.
  2. Verwenden Sie isobare Targs für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) Reagenzien, um die präparierten tryptischen Peptide zu kennzeichnen.
    HINWEIS: In diesem Protokoll werden Sechs-Plex-iTRAQ-Reagenzien (Plex-Tags 113, 114, 115, 116, 117 und 118) verwendet, um tryptische Peptidproben zu kennzeichnen (Tumor; Kontroll), wobei jede Probeart dreimal markiert wird (Tabelle 2).
    1. Jedes iTRAQ-Reagenzrohr wird mit 50 μL Isopropanol neu zusammengesetzt.
    2. Tryptische Peptidproben zu den entsprechenden Reagenzröhrchen geben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Beenden Sie die Reaktionen, indem Sie 3× Volumen ultrareines Wasser hinzufügen und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Gleichermaßen die beschrifteten sechs Proben zusammenfassen, gründlich mischen und geliophilisieren.
  3. Verwenden Sie starken Kationenaustausch (SCX), um die iTRAQ-markierte tryptische Peptidprobe zu fraktionieren.
    1. Rekonstituierte lyophilisierte Peptide in 2 mL Lösung A (10 mM KH₂PO₄, 25 % ACN, pH 2,7). Laden Sie auf eine sulfoethylfunktionalisierte Kationenaustauschsäule (4,6 × 100 mm, 5 μm, 200 Å).
    2. Elutieren mit einer konstanten Durchflussrate von 1 mL/min unter Verwendung von Lösung B (500 mM KCl, 10 mM KH₂PO₄, 25 % ACN, pH 2,7): 0 %→10 % (2 Min) → 10 %→20 % (25 Min) → 20 %→45 % (5 Min) → 50 %→100 % (5 Min). Überwachen Sie während des gesamten Prozesses bei 214 nm, sammeln Sie jede Minute pro Röhre, insgesamt 30 Fraktionen.
    3. Jede Fraktion wird durch Vakuumzentrifugation konzentriert und anschließend mit 40 μL 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) rekonstituiert. Alle 30 Fraktionen werden in einem -80 °C Gefrierschrank aufbewahrt.
      HINWEIS: TFA ist hochgradig korrosiv und giftig, verursacht schwere Haut- und Augenschäden und reizt das Atmungssystem; sie muss in einer Abzugshaube mit geeigneter PSA behandelt werden, die säureresistente Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel umfasst, und Abfälle müssen als saure Abfälle gesammelt werden.
  4. Verwenden Sie LC-MS/MS, um jede fraktionierte Peptidprobe zu analysieren.
    1. Verwenden Sie eine C18-Umkehrphasen-Festphasen-Extraktionspatrone (Standarddichte, Bettidentifikation 7 mm, Volumen 3 mL) zum Entsalzen.
    2. Verwenden Sie eine C18-Umwärtsphasen-Flüssigkeitschromatographie (LC)-Säule (10 cm Länge, 75 μm I.D., 3 μm Harz), um 10 μL jeder Fraktion mit Lösung C (0,1 % Ameisensäure) und einem Gradienten der Lösung D (80 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure) mit einer Geschwindigkeit von 250 nL/min für 140 Minuten zu elutieren.
    3. Online werden die LC-separierten Peptide in ein hochauflösendes Massenspektrometer für die MS/MS-Analyse eingespeist.
    4. Konvertiere rohe Spektrumdateien (.raw), die von Q Exactive generiert werden, in das .mgf-Format mit Proteome Discoverer 1.4 und reiche diese .mgf-Dateien dann an den MASCOT 2.2-Server ein, das integrierte Modul der Software für die Datenbanksuche.
      HINWEIS: Die Uniprot-Datenbank (insgesamt 146.704 Sequenzen; am 20. Juli 2025 aus http://www.uniprot.org heruntergeladen) wird mit detaillierten Suchparametern verwendet (Tabelle 3).
    5. Rufen Sie die resultierenden Suchdateien (.dat) vom MASCOT-Server zurück in Proteome Discoverer 1.4 ab. Daten für die Filtration bei einer False Discovery Rate (FDR)-Schwelle von <0,01, um hochkonfidenzierte Identifikationen zu erhalten.
    6. Identifizieren Sie die Protein-Aminosäuresequenz mit MS/MS-Daten, quantifizieren Sie die Proteinhäufigkeit mit iTRAQ-Reporter-Ionenintensitäten.
    7. Berechnen Sie die experimentelle Reproduzierbarkeit zur Bestimmung des Grenzwerts von differenziell exprimierten Proteinen (DEPs) plus eine Signifikanz p<0,05.
      HINWEIS: In dieser Studie wird der Cut-off-Wert als Faltänderung (FC) > 1,4 bestimmt, was die systematischen Fehler effektiv entfernen kann.
  5. Analysieren Sie die funktionellen Eigenschaften der neovaskulären Gliom-DEPs.
    1. Greifen Sie auf die DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, Version 6.7; https://david.ncifcrf.gov/) Homepage auf und wählen Sie in der Menüleiste 'Analyse starten ', um die Analyse zu starten.
    2. Das linke Panel dient als Upload-Schnittstelle; Geben Sie Protein- oder Gen-IDs wie gewünscht in das Eingabefeld Step 1 ein (unter Verwendung der Copy-Paste-Funktionalität).
    3. Für Schritt 2 wählen Sie den Identifikationstyp, der zu den hochgeladenen Proteinen passt; diese Studie nutzte UniProt Accession.
    4. Für Schritt 3 wählen Sie Genliste oder Hintergrundeinstellungen: Die Genanreicherungsanalyse erfordert die Auswahl eines Hintergrundgensatzes. Das System greift standardmäßig auf das gesamte Genom der Spezies zurück, oder Nutzer können eine benutzerdefinierte Protein- oder Genliste als Hintergrund hochladen.
    5. Klicken Sie auf Absenden-Liste , um die Einträge einzureichen und die Analyse zu starten.
      HINWEIS: Die Analyseergebnisse werden auf der rechten Seite des Panels "Annotation Summary Results" angezeigt. Benutzer können Ausgaben nach analytischen Bedürfnissen auswählen; diese Studie nutzte speziell die GOTERM_BP_FAT List, um biologische Prozesse mit DEPs zu analysieren.
    6. Biologische Prozesse (BPs), zelluläre Komponenten (CCs), molekulare Funktionen (MFs) und KEGG-Signalwege für neovaskuläre Gliom-DEPs zu erhalten.

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Ergebnisse

Eine ausreichende Menge LCM-isolierter Proteinproben wurde für quantitative Proteomik gewonnen

Um zuverlässige proteomische Profile differenziell exprimierter Proteine in neovaskulären Geweben des Glioms zu erhalten, wählte diese Studie den am weitesten verbreiteten Gliom-Subtyp, Astrozytomum Grad III, aus und isolierte neovaskuläre Gewebe mittels LCM aufgrund der Verfügbarkeit angereicherter neovaskulärer Gefäße. Außerdem erfordert die quanti...

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Diskussion

LCM in Kombination mit der quantitativen Proteomik der Isotopenmarkierung identifizierte das erste großräumige proteomische Profil der Gliomangiogenese

Die Tumorangiogenese ist ein kritisches pathologisches Merkmal von Gliomen, das eng mit ihrer hohen Invasivität und therapeutischen Resistenz 6,7 verbunden ist. Traditionelle anti-angiogene Therapien (wie VEGF-Inhibitoren) zeigen aufgru...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von den China National Nature Scientific Funds (81272798 an X.Z. und 82203592 an N.L.), der Shandong Provincial Natural Science Foundation (ZR2022QH112 an N.L.), den Special Funds des Shandong Provincial Taishan Scholar Engineering Project (NO.tstp20221143 bis X.Z.), dem China National High-end Foreign Expert Talent Program (H20240743; Ausländischer Experte: X.Z.), und Shandong First Medical University Scientific Research Cultivation Project in Emerging Strategic Fields (202403).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96-Brunnen-PlatteThermo Fisher Scientific (USA)468667Verbrauchsgüter
AcetonNanJing-Reagenz (China)C0720114023Reagenz
AcetonitrilMerck (China)CN34892Reagenz
BCA-Protein-Assay-KitAbcam (Großbritannien)ab102536Reagenz
Rinderserumalbumin (BSA) StandardSolarbio (China)PC0001-1Reagenz
Zentrifugenröhre (50ML)Kirgen (China)KG2811Verbrauchsgüter
Kryostat-MikrotomLeica (Deutschland)Um 1900Ausrüstung
CysteinAladdin (China)C108238Reagenz
DL-Dithiothreitol (DTT)Amresco (USA)D8220Reagenz
EASY-Spray C18 HPLC-Säule mit umgekehrter PhaseThermo Scientific (USA)ES800AVerbrauchsgüter
Elektronische BilanzSartorius (USA)BSA224SAusrüstung
EinbettungsmediumLeica (Deutschland)39475237Verbrauchsgüter
Empore SPE-Patronen C18Sigma-Aldrich (USA)66872-UVerbrauchsgüter
Eppendorfer U-BahnKirgen (China)KG2211Verbrauchsgüter
FilterpapierCytiva (USA)Grade 42Verbrauchsgüter
AmeisensäureAladdin (China)F112032Reagenz
GlasbecherSHUBO (China)1015479Verbrauchsgüter
Glasgradierter ZylinderSHUBO (China)1601Verbrauchsgüter
‌ Hochauflösende Flüssigkeitschromatographie – MassenspektrometrieThermo Scientific (USA)Q-ExaktivAusrüstung
Isolierter BehälterFhefon (China)LCZYX-12Verbrauchsgüter
Invertiertes Mikroskop Leica (Deutschland)XDS-1Ausrüstung
IodoacetamidSolarbio (China)I8010Reagenz
IsopropanolAladdin (China)I112018Reagenz
iTRAQ-ReagenzienSigma-Aldrich (USA)4381663Reagenz
KClBeyotime (China)ST1596Reagenz
KH2PO4ShangHai YuanYe (China)S24278Reagenz
Laser-ErfassungsmikrodissektionLeica (Deutschland)LMD 6000Ausrüstung
Laser-Capture-MikrodissektionsverlittenträgerLeica (Deutschland)3800040Verbrauchsgüter
Leica hochprofilige EinwegklingenLeica (Deutschland)14035838926Verbrauchsgüter
FlüssigstickstoffbehälterKEYICRYO (China)YDS-3Ausrüstung
Magnetischer HeizplattenrührerShanghai SILE (China)LAB-0002-0068-SHSLAusrüstung
MikroplattenleserTECAN (Schweiz)INFNITE F200Ausrüstung
PEN  MembranLeica (Deutschland)11505189Verbrauchsgüter
pH-MeterSartorius (USA)PB-10Ausrüstung
PipetteEppendorf (Deutschland)3123000268Ausrüstung
PipetteEppendorf (Deutschland)3123000241Ausrüstung
PipetteEppendorf (Deutschland)3123000225Ausrüstung
PolySULFOETHYL APolyLC Inc (USA)104SE0303Verbrauchsgüter
ProteaseinhibitorRoche (Schweiz)05892791001Reagenz
Gekühlte ZentrifugeBeckman (USA)AllegraTM X-22RAusrüstung
KühlschrankMEILING (China)BCD-180KCTAusrüstung
Natriumdodecylsulfat (SDS)Amresco (USA)1027P033Reagenz
FleckenglasBeyotime (China)FG005Verbrauchsgüter
EdelstahlschaufelMuzixing (China)XYS-101Verbrauchsgüter
TippsKirgen (China)KG1313Verbrauchsgüter
Toluidinblau-FärbungslösungSigma-Aldrich (USA)198161-5G/198161-25GReagenz
TrifluoressigsäureAladdin (China)T103293Reagenz
Tris-HClAmresco (USA)T8230Reagenz
Trypsin-EDTA-LösungSolarbio (China)T1300Reagenz
Ultra-Niedrigtemperatur-GefrierschrankSanyo (Japan)MDF-382EAusrüstung
Ultrareiner WasserreinigerELGA (UK)PureLAB FlexAusrüstung
Ultraschallzell-DisruptorQSONICA (USA)Q500Ausrüstung
VakuumgefriertrocknerThermo (USA)SNL 315SVAusrüstung
Vortex-MixerKristalltechnologie & Industrien (USA)HYQ-3110Ausrüstung
WasserbadinkubatorShanghai Yiheng Technologieinstrument (China)HWS-26Ausrüstung
Papier wiegenCole-parmer (USA)133802Verbrauchsgüter

Referenzen

  1. Lapointe, S., Perry, A., Butowski, N. A. Primary brain tumours in adults. Lancet. 392 (10145), 432-446 (2018).
  2. Pienkowski, T., et al. Proteomic profiling reveals dynamic regulation of vesicle trafficking across glioma grades. J Neurooncol. 175 (2), 585-598 (2025).
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  4. Kan, L. K., et al. Potential biomarkers and challenges in glioma diagnosis, therapy and prognosis. BMJ Neurol Open. 2 (2), e000069(2020).
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