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Echtzeitprobenentnahme der arterioovenösen adventitialen Zwischenflüssigkeit der Rattenfemoral durch Platzierung einer Mikrodialysesonde

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DOI:

10.3791/69551

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30. Dezember 2025

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1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie führt eine Mikrodialysetechnik ein, die eine Echtzeit-anatomisch präzise Probenahme von adventitialer interstitieller Flüssigkeit (AISF) bei narkosierten Ratten ermöglicht, wodurch unterschiedliche metabolische Variationen offenbart und ihre einzigartige physiologische Bedeutung bestätigt wird. Im Vergleich zu bestehenden Interstitialfluid-(ISF)-Probenahmemethoden bietet dieser Ansatz eine verbesserte molekulare Auflösung und Stabilität der Probenahme.

Zusammenfassung

Interstitielle Flüssigkeit (ISF) ist ein wesentlicher Bestandteil der extrazellulären Mikroumgebung, der den metabolischen Austausch und die interzelluläre Kommunikation ermöglicht. Dennoch machen die anatomische Tiefe und die Nähe zu Gefäßstrukturen das adventitielle ISF (AISF) besonders schwer zu beproben, ohne Kontaminationen einzuführen oder Gewebestörungen zu verursachen. In dieser Studie stellen wir eine Echtzeit-minimalinvasive Methode zur AISF-Sammlung durch Mikrodialyse bei narkosierten Ratten vor. Duale 20-kDa-Cutoff-Sonden wurden chirurgisch in der femoralarteriovenösen Adventitia und der Vena Jugularis implantiert, um eine kontinuierliche Probenahme von ISF bzw. Blut zu ermöglichen. Die Perfusion mit künstlicher extrazellulärer Flüssigkeit ermöglichte die selektive Diffusion von Metaboliten mit niedrigem Molekulargewicht. Durch die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die orthogonale partielle Kleinste-Quadrat-Diskriminantenanalyse (OPLS-DA) wurde eine deutliche metabolische Divergenz zwischen AISF und Blut beobachtet, die 146 signifikant unterschiedliche Metaboliten identifizierte. Die Anreicherungsmuster von Laktat und Serotonin bestätigten die anatomische Spezifität und funktionelle Zuverlässigkeit der Methode. Wichtig ist, dass AISF mit lokal synthetisierten Metaboliten angereichert war, die im Plasma fehlten, was seine einzigartige physiologische Bedeutung unterstreicht. Im Vergleich zu aktuellen Methoden zur Probenahme von interstitieller Flüssigkeit (ISF), wie Mikronadeln, Saugblasen und umgekehrter Iontophorese, bietet die Mikrodialyse eine verbesserte molekulare Auflösung, eine höhere Stabilität der Probenahme und eine geringere Invasivität. Diese Technik stellt eine verlässliche Grundlage für die in-vivo-Analyse von Analyten in interstitieller Flüssigkeit (AISF) dar und zeigt erhebliches Potenzial für die Weiterentwicklung der Biomarker-Entdeckung und Forschung in der vaskulären Pathophysiologie.

Einleitung

Gewebeflüssigkeit, oder Zwischenflüssigkeit (ISF), stellt ein zentrales Element der zellulären Mikroumgebung dar, wobei wissenschaftliche Untersuchungen bis ins späte 19. Jahrhundert zurückreichen. 1896 führte Starling die Kapillarfiltrations-Reabsorptionstheorie ein, die ISF zunächst als homogene Flüssigkeit charakterisierte, die durch Plasmaultrafiltration entsteht und eine entscheidende Rolle beim Transport von Nährstoffen und der Entfernung von metabolischen Abfällenspielt. In den letzten zwei Jahrzehnten haben Fortschritte in der mikroskopischen Bildgebungstechnologie und Molekularbiologie das Verständnis der Forscher für die beträchtliche Vielfalt in der anatomischen Verteilung, Zusammensetzung und Funktion von ISF2 verbessert.

Die Forschung zur interstitiellen Flüssigkeit (ISF) an verschiedenen anatomischen Stellen hat ihre unterschiedlichen Funktionen in verschiedenen Geweben aufgeklärt. Zum Beispiel erleichtert ISF im Gehirngewebe die Entfernung neurotoxischer Metaboliten wie β-Amyloid während des Schlafs über das Glymphatikum. Umgekehrt trägt die Tumor-Interstitielle Flüssigkeit (TIF) zur Tumorinvasion und zur Immunumgehung bei, indem sie durch die Ansammlung von Milchsäure eine saure Mikroumgebungfördert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ISF nicht nur als Vermittler des metabolischen Austauschs fungiert, sondern auch als aktiver Regulator gewebespezifischer pathophysiologischer Prozesse. In diesem Zusammenhang stellt Adventitial Interstitial Fluid (AISF) aufgrund seiner spezifischen anatomischen Lokalisierung und funktionellen Komplexität eine einzigartige Forschungsherausforderung dar. AISF befindet sich an der Schnittstelle zwischen der Adventitia und dem umliegenden Gewebe5 und spielt eine entscheidende Rolle bei der Wechselwirkung zwischen der Gefäßwand und dem Nerven- und Immunsystem. Seine tiefe anatomische Lage und die Nähe zu Blut und Lymphflüssigkeiten haben jedoch erhebliche technische Herausforderungen für die In-situ-Probenahme und Zusammensetzungsanalyse dargestellt.

Traditionelle Techniken zur ISF-Probenahme, einschließlich der Dochtmethode und chirurgischer Entwässerung, haben erhebliche Herausforderungen bei der Beschaffung hochreiner AISF-Proben aufgrund des Risikos von Blutkontamination und Gewebeschädigungen. Beispielsweise kann die chirurgische Entfernung des Gefäßepithels Schäden an peripheren Nerven oder Lymphgefäßen verursachen, was zur Vermischung von nicht-Zielbiomolekülen6 führt. Darüber hinaus sind diese Methoden durch niedrige Abtastraten, Instabilität, Anfälligkeit für Interferenzen und schlechte Reproduzierbarkeit eingeschränkt, die oft auf Entzündungen durch subkutane Dochteinführung7 und Zellschäden während der Muskelimplantation zurückzuführen ist. Die Entwicklung der Mikrodialyse bietet einen effektiveren Ansatz für ISF-Studien. Diese Technik ermöglicht die in situ und dynamische Aufnahme kleiner Moleküle wie Metaboliten und Zytokine im ISF, ohne die Gefäßstruktur durch die Verwendung einer halbdurchlässigen Membransonde zu beeinträchtigen. Die Sonde kann präzise im Gefäßepithelraum positioniert werden, wodurch das Risiko einer Kontamination durch Blut oder Lymphflüssigkeiten reduziert wird. Darüber hinaus ermöglicht es kontinuierliche Probenahmen, was eine Echtzeitüberwachung dynamischer Veränderungen im ISF-Stoffwechsel unter verschiedenen Bedingungen ermöglicht. Sorgen Sie für eine kontinuierliche und stabile Überwachung dieser Stoffwechselprozesse während des Experiments.

Protokoll

Die Tierversuche wurden nach Zustimmung des Tierethikausschusses des Peking Union Medical College durchgeführt. Alle Verfahren hielten sich strikt an festgelegte Protokolle. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Experimentelle Vorbereitung

  1. Illustrieren Sie das Mikrodialyse-Probenahmesystem und die zugehörigen chirurgischen Instrumente, wie in Abbildung 1 dargestellt.
  2. Bereite künstliche extrazelluläre Flüssigkeit (aECF) mit 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl und 1,25 mM Glukose vor und passe den pH-Wert auf 7,4 an.
  3. Bereiten Sie zwei 20-kDa mD-Sonden vor und benennen Sie sie als Sonde 1 (Gewebeflüssigkeitssonde) und Sonde 2 (Blutsonde). Setzen Sie Sonde 1 in steriles, gefiltertes, deionisiertes Wasser (dH₂O) und Sonde 2 in 1 % Natriumheparin, wobei sichergestellt wird, dass die Sondenspitzen durchgehend feucht bleiben.
  4. Stellen Sie zwei Pfadpaare (Pfade 1 und 2) für "Einfluss" und "Abfluss" fest. Verbinden Sie zwei 1-m-FEP-Rohrsegmente mit PE50-Rohren, wodurch der Totraum minimiert wird. Befestigen Sie jedes Einflussrohr an eine 1-mL Exmire-Spritze: Füllen Sie Spritze 1 mit dH₂O und Spritze 2 mit 1 % Natriumheparin. Schließen Sie die Mikrospritzen an die Sonden an und bereiten Sie die AECF-Infusion vor, nachdem Sie die Sonden in die Halsvene gelegt haben.
  5. Aktiviere die mD-Pumpe und stelle die Durchflussrate auf 1,5 μL/min, bis die Flüssigkeit aus dem Ausflussrohr austritt. Verbinden Sie das Auslassrohr mit der Probenentnahmeleitung.
  6. Füllen Sie zwei Mikrospritzen mit gefiltertem AECF und beginnen Sie das Pumpen mit 1 μL/min.

2. Tiervorbereitung

  1. Ausgewählte erwachsene Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 280 ± 20 g (n = 6).
  2. Führen Sie eine Anästhesie mit 3 % Isofluran ein und halten Sie diese mit 1,8 %–2,2 % Isofluran in einem Luft-Sauerstoff-Gemisch aufrecht, während die Herzaktivität überwacht wird (nach institutionell genehmigten Protokollen). Tiefenanästhesie bestätigen, indem man das Fehlen einer Schmerzreaktion beurteilt und eine verringerte Herzfrequenz (340–390 Schläge pro Minute) feststellt. Lege die Ratte auf eine Thermostatdecke und immobilisiere die Gliedmaßen.
  3. Tragen Sie Haarentfernungscreme auf den Hals und die linke Vorderseite auf, die sich bis zum linken Unterbauch erstreckt. Desinfizieren Sie die enthaarten Stellen zweimal mit Iodophor und entfernen Sie Restjod mit 75 % medizinischem Alkohol.

3. Zweifache Sondenplatzierung (Femuradventitie und Jugularvene)

  1. Verwenden Sie eine Sonde mit einem 10-mm-aktiven Dialysefenster (CMA-20, 20 kDa Abschaltung, 0,5 mm Wellendurchmesser), wie in Abbildung 2A gezeigt.
  2. Bereiten Sie die Führungsnadel und das Abreißrohr vor (Abbildung 2B).
  3. Strecken Sie das Hintergliedmaß der Ratte so aus, dass die Linie, die das Kniegelenk mit der Mitte der Leistenfalte verbindet, senkrecht zur Längsachse des Körpers steht. Messen Sie ein 2 cm großes Segment entlang der Haut des Leistenbereich in Richtung der Hintergliedmaße, um das chirurgische Orientierungsgebiet zu definieren (Abbildung 2C). Identifizieren Sie den Mittelpunkt dieses leistenalen Bereichs als Mikrofenster-Positionierung. Markiere die Einstichstelle 2 cm seitlich zu diesem Positionierungspunkt (Abbildung 2D).
  4. Stellen Sie das Tier unter ein Stereomikroskop.
  5. Machen Sie einen Schnitt von 0,5 bis 0,8 cm in der Mitte der Leistenfalte, um die Visualisierung zu erleichtern und eine genaue Platzierung der Sonde innerhalb der perivaskulären Membran sicherzustellen. Das subkutane Gewebe stumpf zerlegen, um die Oberschenkelarterie und -vene, die Vena saphena und die oberflächliche Bauchwandvene freizulegen (Abbildung 2E).
  6. Umschließen Sie die äußere Schicht der Stichnadel in einem reißbaren Rohr, um eine Führungsnadel zu bilden.
  7. Bestätigen Sie, dass keine Blutgefäße unter der Haut an der Stichstelle vorhanden sind. Führen Sie die Nadel senkrecht durch die Haut ein und stellen Sie dann den Winkel auf 45° ein, um in den Geweberaum um die Vena saphena einzudringen.
  8. Führen Sie die Nadel in Richtung des Blutflusses in der Vene saphena und halten Sie während des gesamten Eingriffs einen engen Kontakt zur Gefäßwand. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Nadelposition in Echtzeit zu überwachen und Gefäßverletzungen oder Blutkontaminationen zu verhindern. Anschließend führen Sie die Nadel in die Adventitia der Femoralvene (Abbildung 2F).
  9. Ziehen Sie die Stichnadel heraus, während Sie das Abreißrohr im Gewebe belassen (Abbildung 2G).
  10. Führen Sie die Gewebeflüssigkeitssonde in den reißbaren Katheter ein und öffnen Sie vorsichtig den Katheter, um die Probestelle freizulegen und die Gewebeprobe zu entnehmen (Abbildung 2H). Stellen Sie sicher, dass die Sonde genau innerhalb der Adventitia der Oberschenkelarterie und der Vene positioniert ist (Abbildung 2I). Befestigen Sie die Sonde vor dem Nähen an der Haut (Abbildung 2J). Führen Sie alle Eingriffe unter strengen aseptischen Bedingungen durch, wobei Sie darauf achten, eine Störung der vaskulären Adventitie zu vermeiden und Gewebeentzündungen oder Fremdkörperreaktionen zu verhindern, die die Flüssigkeitsansammlung des Gewebes beeinträchtigen könnten.
  11. Verifizieren Sie die Position der Sonde, indem Sie ein chirurgisches Lineal zusammen mit der festen Sonde fotografieren, um die belichtete Länge zu dokumentieren, und präsentieren Sie dieses Bild wie in Abbildung 2I dargestellt.
  12. Mache einen 2 cm langen Hautschnitt etwa 0,5 cm lateral zur Halsmitte, beginnend 1 cm oberhalb der sternalen Kerbe.
  13. Stumpf durch den Musculus sternocleidomastoideus sezieren, um die Vena Jugularis freizulegen, die seitlich der Halsschlagader liegt und an ihrer dunkelblauen Färbung gekennzeichnet ist. Verwenden Sie einen feuchten Wattestäbchen, um die Faszie vorsichtig zu trennen, wobei Sie darauf achten, den Kontakt mit dem Vagusnerv zu vermeiden.
  14. Mit mikroskopischer Pinzette wird die äußere Membran der Jugularvene vorsichtig angehoben und das umliegende Bindegewebe sorgfältig entfernt, um mindestens 1 cm freie Gefäßlänge zu erreichen. Setzen Sie eine 4-0-Seidennaht proximal an, um als Backup-Ligatur zu dienen (Abbildung 2K).
  15. Bei venöser Punktion wird ein schräger Schnitt in einem Winkel von 45° gemacht, etwa ein Drittel des Gefäßdurchmessers. Verwenden Sie Mikropinzette, um den Schnitt vorsichtig zu öffnen und einen Eingang für das Einführen der Sonde zu schaffen.
  16. Führen Sie die Sondenspitze vorsichtig in die Vene ein und führen Sie sie langsam auf eine Tiefe von 3,5–4,0 cm vor, wobei Sie sicherstellen, dass die Spitze den Eingang des rechten Vorhofs erreicht (Abbildung 2L).
  17. Sichern Sie die Sonde, indem Sie die proximale Seidenligatur mit einem doppelten Knoten festziehen. Schließen Sie die Muskelschicht mit 4-0 Vicryl-Nähten und nähen Sie dann die Haut mit unterbrochenen Stichen. Befestigen Sie den äußeren Teil der Sonde an der Hautoberfläche, um eine Verschiebung zu verhindern.

4. Probenentnahme und Sondenbergung

  1. Probenentnahme: Bewerten Sie die Beziehung zwischen Gewebedialyse und Probentransfer in das Entnahmerohr. Halten Sie ein Gesamtvolumen von 20 μL zwischen Sonde und Kollektor aufrecht.
    1. Man sollte eine 20-minütige Phase einräumen, damit die Probe durch Sonde und Schlauch fliegt und das Ende des Rohrs zur Entnahme mit einer Durchflussrate von 1 μL/min erreicht. Sammeln Sie ein ausreichendes Volumen, um die erforderliche Konzentration für den Test zu erreichen. Sammeln Sie 30 μL Dialysat pro Sammelröhrchen.
  2. Probenlagerung: Vorkühlen 0,5 mL Polypropylen-Sammelrohre auf 4 °C. Unmittelbar nach der Entnahme die Tuben verschließen, sie 30 Sekunden lang in flüssigem Stickstoff einfrieren und innerhalb von 2 Minuten in einen -80 °C Gefrierfach übergeben.
  3. Basisprobe: Vollständige Gleichstellung der Proben vor Beginn der Probenentnahme. Nehmen Sie drei Proben pro Ratte unter Narkose, um eine stabile Messbasis zu etablieren.
  4. Sondenentfernung: Entfernen Sie die Sonde nach Abschluss der Probenentnahme vom Kopf des Tieres und geben Sie sie in ein Aufbewahrungsfläschchen mit 1 % Natriumheparin. Euthanasiere das Tier durch Einatmen von überschüssigem Isofluran.
  5. Sondenkonservierung: Spülen Sie die Sonde gründlich mit Kochsalzlösung ab und bewahren Sie sie in einem Fläschchen mit Kochsalzlösung auf. Spülen Sie die Eileiter mit Kochsalzlösung mit einer Spritze, um das Wachstum der Mikrobien zu verhindern. Verwenden Sie die Sonde nur wieder, wenn sie einen ausreichenden Durchfluss aufrechterhält und die Membran intakt bleibt.

5. Datenanalyse

  1. Führen Sie die Hauptkomponentenanalyse (PCA), die orthogonale partielle Kleinste-Quadrat-Diskriminantenanalyse (OPLS-DA) und zusätzliche statistische Analysen mit MetaboAnalyst 6.0 durch. Verwenden Sie OPLS-DA speziell, um die variable Bedeutung in der Projektion (VIP) zu bestimmen.
  2. Wenden Sie nichtparametrische Tests an, einschließlich P-Wert-Bewertungen und Faltungsänderungsanalysen, um differenzielle Metaboliten zu untersuchen. Setzen Sie kritische Schwellenwerte für das Screening unterschiedlicher Metaboliten auf VIP > 1, FC ≥ 2 oder FC ≤ 0,5 und P < 0,05.
  3. Annotieren Sie die identifizierten Metaboliten mit der KEGG Compound Database.

6. HPLC - MS/MS

  1. Durchführung der Metabolitenquantifizierung mit einem AB Sciex 6500+ Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer, das mit einer Elektrosprüh-Ionisationsquelle (ESI) im positiven Ionenmodus betrieben wird.
  2. Stellen Sie die Instrumentenparameter wie folgt ein: Vorhanggas, 40 psi; Kollisionsgas, 10 psi; Ionenquellengas 1 (GS1), 50 psi; Ionenquellengas 2 (GS2), 55 psi; Ionensprühspannung, 4500 V; und Quelltemperatur 550 °C.
  3. Betreiben Sie das System im Mehrfachreaktionsüberwachungsmodus (MRM). Optimieren Sie MRM-Übergänge, Declusterpotenziale und Kollisionsenergien einzeln für jeden Metaboliten. Führen Sie Datenerfassung mit der Software Analyst 1.7.1 durch und quantitative Analysen mit MultiQuant 3.0.3.
  4. Für die chromatographische Trennung verwenden Sie eine C18-Säule (2,1 × 100 mm, 1,7 μm), die bei 45 °C gehalten wird. Bereiten Sie die mobilen Phasen als (A) 0,1 % Ameisensäure in Wasser und (B) 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril vor. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,35 mL/min und das Einspritzvolumen auf 6 μL ein. Halten Sie die Temperatur des Autosamplers vor der Analyse bei 4 °C.
    HINWEIS: Für diese Studie dauerte jeder Lauf insgesamt etwa 25 Minuten.

Ergebnisse

Der Datensatz wurde durch Anwendung von Summations- und logarithmischen Transformationen normalisiert und durchlief anschließend eine umfassende Reihe statistischer Analysen. Die Principal Component Analysis (PCA) wurde durchgeführt (Abbildung 3A), die deutliche Trennungen aufzeigte und metabolische Unterschiede hervorhob. Anschließend wurde ein Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis (OPLS-DA)-Modell entwickelt, dessen resultierende Werte in Abbildung 3B dargestellt sind und die diskriminierende Wirksamkeit des Modells demonstrieren. Bei der Bewertung von 618 Metaboliten identifizierten Vulkandiagramme, die AISF- und Blutproben verglichen, 146 unterschiedliche Metaboliten, wobei Gewebeflüssigkeit sowohl herunterregulierte als auch hochregulierte Metaboliten aufweist (Abbildung 3C). Zusätzlich wurde eine Heatmap erstellt, um einen vergleichenden Überblick über die 50 wichtigsten Differentialmetaboliten zu geben (Abbildung 3D).

Um die Zuverlässigkeit der Probenahme zu bewerten, wurden Serotonin und Milchsäure als positive Kontrollen verwendet, die Gewebeflüssigkeitsbestandteile bzw. Blut repräsentieren. Die Ergebnisse stimmten mit den etablierten Verteilungsmustern dieser Komponenten über verschiedene Körperflüssigkeiten überein, wie in Abbildung 4 dargestellt. Ergänzende Abbildung 1 zeigt die Stabilität von Laktat und Serotonin in Mikrodialysat-Aliquoten, die bei -80 °C gelagert werden.

Die 146 differenziellen Metaboliten wurden systematisch in mehrere Kategorien eingeteilt: Nukleoside, Nukleotide und deren Analoga; Fettsäuren und deren Derivate; Aminosäuren, Peptiden und deren Analoga; Kohlenhydrate und Kohlenhydratkonjugate; organische Säuren und deren Derivate; biogene Amine; Purine und Pyrimidine; Vitamine und Steroide; sowie andere Verbindungen (Abbildung 5A). Ergänzende Tabelle 1 zeigt unterschiedliche Metabolite, die im Blut nachgewiesen wurden. Heatmap-Analysen erläutern weiter die Anreicherungsmuster biogener Amine und Aminosäuren, Peptide und deren Analoga in verschiedenen Körperflüssigkeiten (Abbildung 5B,C). Die Analyse der differentiellen Metabolitenanreicherung ist in Abbildung 6 dargestellt. Ergänzende Tabelle 2 listet den Variationskoeffizienten (CV) für fünfzehn zufällig ausgewählte Metaboliten in drei aufeinanderfolgenden perivaskulären Gewebe-Flüssigkeitsproben auf.

Abbildung 1
Abbildung 1: Bilder des Versuchsapparats. (A) Gekühlter Fraktionssammler. (B) Spritzenpumpe. (C) Mikrospritzen. (D) Chirurgische Instrumente, einschließlich Gefäßscheren und Pinzetten usw. (E) Anästhesiemaschine. (F) Mikrodialyse-Sonden. (G) Mikrodialysesonden, Gewebeführungsnadel und ein reißbares Rohr. (H) Nadeln für Gewebeführung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2
Abbildung 2: Die wichtigsten Schritte in der Studie. (A) Eine schematische Darstellung, die ein Diagramm zeigt, das die Position des Operationsorts und die Ausrichtung der Sonde darstellt. (B) Identifikation kritisch gefäßlicher Verbindungen zur genauen Beobachtung der Sondenplatzierungsstellen. (C) Einsetzen der Führungsnadel, die die Haut durchdringt und in den Geweberaum vordringt. (D) Das Zurückziehen der Führungsnadeln wird zurückgezogen, sodass das reißbare Rohr im Gewebe verbleibt. (E) Die Mikrodialysesonde wird über den etablierten Kanal ins Gewebe eingeführt. (F) Sanftes Einziehen des reißbaren Rohrs. Das reißbare Rohr wird nach dem Fixieren der Sonde vorsichtig zurückgezogen. (G) Visualisierung von Sonden, die im Epithel der femoralisen arteriellen und venösen Gefäße positioniert sind. (H) Trennung des Gewebes von der Halsvene. (I) Platzierung der Sonde in der Halsvene. (J) Die Mikrodialysesonde wird auf der Hautoberfläche befestigt. (K) Isolierung der Halsvene. (L) Einsetzen der Sonde in die Halsvene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Multivariate statistische Analyse von Interstitieller Flüssigkeit (ISF) und Blut. (A) Die Daten wurden herunterskaliert, um signifikante Trennungen hervorzuheben und deutliche Unterschiede zwischen ISF- und Blutkomponenten zu zeigen. (B) Die orthogonalen partiellen Kleinste-Quadrat-Diskriminantenanalysen (OPLS-DA) Modellwerte zeigen R2Y- bzw. Q2-Werte von 0,925 bzw. 0,811. (C) Das Vulkandiagramm zeigt 146 unterschiedliche Metaboliten, wobei 85 Metaboliten herunterreguliert und 61 hochreguliert im ISF sind. (D) Dementsprechend zeigen Heatmaps, die die 30 wichtigsten Metaboliten in ISF und Blut gegenüberstellen, eine klare Unterscheidung zwischen den beiden Komponentengruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Die Präsentation einer Reihe von Box-Plots erläuterte die Anreicherungswerte von Laktat und Serotonin in ISF und Blut. Alle Datenpunkte repräsentieren den Mittelwert ± SEM; Fehlerbalken werden für alle quantitativen Panels angezeigt. Panel (A) zeigt, dass ISF-Proben eine signifikant höhere Laktatanreicherung im Vergleich zu Blutproben aufweisen. Im Gegensatz dazu zeigt Panel (B), dass Serotonin in Blutproben stärker angereichert ist, die gleichzeitig niedrigere Laktatwerte aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Das Klassifikationsringdiagramm der differentiellen Metaboliten und die Wärmekarte von Aminosäuren, Peptiden und Analoga sowie biogenen Aminen sind dargestellt. (A) Jeder Farbblock entspricht einer bestimmten Klasse von Metaboliten. Aminosäuren, Peptide und Analoga stellen die größte Kategorie dar und machen 19,29 % des Gesamtbetrags aus, gefolgt von Nukleosiden, Nukleotiden und Analoga (15 %), Fettsäuren und Derivate (12,86 %), Kohlenhydrate und Kohlenhydratkonjugate (7,86 %), organische Säuren und Derivate (10 %), biogene Amine (7,14 %), Purine/Pyrimidine (5,71 %), Vitamine und Steroide (8,57 %) sowie weitere Verbindungen wie Indole, Azepine, Pyridine und Bengene mit 13,57 %. (B) In der Zwischenflüssigkeit (ISF) sind die Anreicherungswerte von Verbindungen wie Deoxycarnitin und Spermidin innerhalb der biogenen Amine-Kategorie im Vergleich zu denen im Blut signifikant erhöht, während die Spiegel von Serotonin (D4), Serotonin, Tryptamin und verwandten Verbindungen deutlich reduziert sind. (C) Bei ISF sind die meisten Metaboliten, die mit Aminosäuren, Peptiden und Analoga assoziiert sind, deutlich niedriger als die im Blut beobachteten Stoffwechsel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6
Abbildung 6: Die Analyse der Metabolitenanreicherung (MSEA) normaler Interstitieller Flüssigkeit zeigte, dass die Stoffwechselaktivität überwiegend über Wege verteilt ist, die mit Energieproduktion, Redoxhomöostase und Aminosäureumsatz zusammenhängen. Die wichtigsten angereicherten Signalwege umfassen den Butanoatstoffwechsel, den Purinstoffwechsel und den Glutathionstoffwechsel, was die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Energieversorgung und der antioxidativen Kapazität unter physiologischen Bedingungen widerspiegelt. Darüber hinaus sind mehrere aminosäurebezogene Wege vertreten, wie Arginin- und Prolinstoffwechsel, Tryptophanstoffwechsel sowie Cystein- und Methioninstoffwechsel, was auf aktive Aminosäure-Interkonversion und Regulierung des Stickstoffgleichgewichts im extrazellulären Mikroumfeld hinweist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das normale interstitielle Metabolom ein dynamisches Gleichgewicht zwischen bioenergetischen Prozessen, oxidativer Abwehr und Aminosäurestoffwechsel aufrechterhält, was die Gewebehomöostase und die Mikrozirkulationsstabilität unterstützt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Stabilität von Laktat und Serotonin in Mikrodialysat-Aliquoten, die bei -80 °C gelagert werden. Die Daten sind im Mittelwert ± SEM (n = 6 Replikate pro Zeitpunkt). Kein Analyt wich >5 % vom Ausgangsstand über 72 Stunden ab. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Unterschiedliche Metaboliten, die im Blut und im adventitiellen Interstitialflüssigkeitsmikrodialysat nachgewiesen wurden. Dazu gehören der Name des Metaboliten, Fold-Change (FC), der T-Test P-Wert des Schülers und VIP (OPLS-DA). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Variationskoeffizient (CV) für fünfzehn zufällig ausgewählte Metaboliten in drei aufeinanderfolgenden perivaskulären Gewebe-Flüssigkeitsproben. Alle Lebensläufe liegen bei <20%. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Interstitielle Flüssigkeit (ISF) ist die wässrige Mikroumgebung, die jede Gewebezelle umhüllt und etwa 75 % des extrazellulären Flüssigkeitskompartiments 8,9 ausmacht. ISF wird durch Kapillarfiltration des Plasmas erzeugt und besitzt nicht den zellulären und hohen Proteingehalt im Blut, behält jedoch Elektrolyte, kleine gelöste Stoffe und Wasser9. Diese Zusammensetzung positioniert ISF als zentrale Schnittstelle zwischen der vaskulären und zellulären Welt. Funktional ist ISF ein dynamisches Transportmedium. Es transportiert Sauerstoff, Glukose, Aminosäuren und Mikronährstoffe aus dem Blutkreislauf zu den Zellen, während es gleichzeitig Kohlendioxid, Harnstoff und andere Stoffwechselabfälle sammelt, um es inden Kreislauf zurückzuführen. Die Flüssigkeit dient außerdem als Schmiermittel und Puffer und stabilisiert den zwischensteitiellen osmotischen Druck, den pH-Wert und das ionischeGleichgewicht 11. Über den Stoffwechsel hinaus unterstützt ISF die Immunüberwachung, indem es Leukozyten, Antikörper und Zytokine durch Geweberäume transportiert und als Kommunikationsautobahn für Hormone und Parakrinsignalefungiert 12,13. Im Vergleich zum Blut ist ISF im Wesentlichen ein zellfreies, proteinarmes Filtrat14. Blut, das auf den Gefäßbaum beschränkt ist, enthält rote und weiße Blutkörperchen, Blutplättchen sowie hohe Konzentrationen von Albumin und Gerinnungsfaktoren. Sauerstoff- und Nährstoffwerte sind im Blut am höchsten und im ISF aufgrund der zellulären Aufnahme zunehmend niedriger, während sich Abfallprodukte im ISF ansammeln, bevor sie in den lymphatischen oder venösen Rückfluss10 gelangen. Das Fehlen großer Proteine und Zellen im normalen ISF minimiert den onkotischen Druck und ermöglicht eine schnelle Diffusion, aber entzündliche Zustände können dieses Profil vorübergehend verändern15.

Die Untersuchung von ISF bleibt jedoch eingeschränkt, da es an einfachen, schnellen und zuverlässigen Stichprobenmethoden mangelt. Aktuelle Methoden umfassen Mikronadelpflaster (MN), Saugblasen, umgekehrte Iontophorese, thermische Ablation und Mikrodialyse. MN-Pflaster erzeugen Mikrokanäle für die ISF-Extraktion durch die Haut, wobei Kernschalenvarianten ISF in weniger als 30 Sekunden und osmotische Hydrogel-MNs in etwa 3 Minuten extrahieren. Diese können mit Sensoren für die On-Patch-Analyse kombiniert werden, sind jedoch durch das Volumen begrenzt und erfordern ein Gleichgewicht zwischen Festigkeit und Schwellung. Saugblasen liefern reines ISF mit minimaler Blutverunreinigung, sind aber invasiv, schmerzhaft und langsam 16,17,18. Die umgekehrte Iontophorese (RI) nutzt niedrige elektrische Ströme, um geladene Analyte wie Glukose- und Lithiumionen zur Hautoberfläche zur nicht-invasiven Überwachung zu transportieren. Allerdings stehen Herausforderungen wie geringer Durchsatz, Variabilität zwischen Individuen und mögliche Hautreizungen 19,20. Transdermale Gabe (TA) stört das Stratum corneum mit lokaler Erhitzung, sodass ISF passiv in hydrophile Mikrokanäle eindringen kann. Obwohl im Bauelement einfacher, sammelt er weniger als 5 μL Flüssigkeit, was eine hochempfindliche Detektion und sorgfältiges Wärmemanagement erfordert, um Verbrennungenzu vermeiden. Im Gegensatz dazu bietet die Mikrodialyse (MD), die auf Diffusion über implantierte halbdurchlässige Sonden basiert, eine einzigartige molekulare Selektivität durch verstellbare Molekulargewichts-Cut-off-Membranen (MWCO), wie etwa 10 kDa für Glukose und 100 kDa für Proteine undZytokine 23,24. Diese Technik unterstützt kontinuierliche und minimalinvasive Probenahmen. MD ist jedoch operationell komplex, erfordert eine Kalibrierung in vivo und zeigt variable Erholungsraten für hydrophobe Arten. Bemerkenswert ist, dass MD die einzige Technik ist, die eine größenselektive Isolierung großer Biomoleküle25 ermöglicht. Vergleichende Studien von Dialysat, das in der Nähe der vaskulären Adventitia versus Blut gesammelt wurde, zeigen unterschiedliche Laktat- und Serotoninprofile und bestätigen damit die Stabilität und Spezifität des MD-Ansatzes.

Tierstudien haben gezeigt, dass die ISF, synergetisch reguliert durch Herz und Lunge, in den Adventitien fließen kann, die mit großen Arterien, Venen und peripheren Nervenverbunden sind. In der Regel enthält ISF Metaboliten, die direkt aus dem Plasma gewonnen und lokal in den Geweben 26,27,28 synthetisiert werden. Es ist daher plausibel, dass die identifizierten Überschneidungen und Unterschiede der Metaboliten in AISF und Plasma die Beteiligung des ISF-Kreislaufsystems am Transport und der Räumung von Nährstoffen und Metaboliten in Geweben entlang der Gefäße darstellen. Die hier eingeführte mikrodialysebasierte Methode zur Probenahme des AISF wird die Studien zur systemischen ISF-Zirkulation zur Regulierung des Stoffwechsels in mehreren Organen und Geweben im ganzen Körper erheblich verbessern.

Die in dieser Studie verwendete 20-kDa-Molecular-Weight-Cut-off-(MWCO)-Membran ist optimal für die quantitative Rückgewinnung kleiner Metaboliten, darunter Glukose, Laktat, Pyruvat und Aminosäuren, konzipiert. Allerdings werden zahlreiche biologisch wichtige Makromoleküle wie Zytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Enzyme konsequent unterbestückt oder vollständig ausgeschlossen. Klinische und methodologische Übersichten haben hervorgehoben, dass Standard-20-kDa-Katheter wirksam bei der Erfassung kleiner hydrophiler Metaboliten sind, jedoch niedrige Erholungsraten für Proteine und entzündliche Mediatorenzeigen 29. Daher sind Membranen mit höheren MWCOs (z. B. 100 kDa) oder alternativen Probenahmestrategien für eine genaue Zytokinquantifizierung30,31 notwendig. Daher werden zukünftige Forschungen unserer Gruppe Membranen mit größeren MWCOs verwenden, um die makromolekulare Zusammensetzung peripherer interstitieller Flüssigkeit zu charakterisieren. In dieser Studie wurden Dialysate unter Vollnarkose entnommen. Die Mikrodialyse wurde bereits bei wachen, frei bewegenden Tieren validiert, und mehrere "Open-Flow"-Mikroperfusionstechniken wurden für den Einsatz in bewussten Modellen32 angepasst. Die Anpassung unseres Sondendesigns und Implantationsprotokolls für den Einsatz bei wachen Tieren erfordert jedoch, Herausforderungen im Zusammenhang mit Tethering, Tierstress, Sondenstabilität, Bewegungsartefakten und langfristiger Patenz anzugehen. Wir sind derzeit dabei, ein leichtes Tether-Swivel-System zu entwickeln und planen, in unserer nächsten Studie bewusste Probenahmen durchzuführen.

Offenlegungen

Es gibt keine finanziellen Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Nationalen Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas (2025YFC3507601) und den Grundlagenforschungsfonds für die zentralen Forschungsinstitute für öffentliche Wohlfahrt (Nr. ZZ-YC2023007).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EKG-ÜberwachungssystemAD Instruments, AustralienPowerLabAusrüstung
PinzetteF.S.T. (Fine Science Tools) Deutschland11252-00Chirurgische Instrumente
HeparinnatriumSigma-Aldrich, USA9041-08-1Material
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometer (HPLC-MS/MS)SCIEX, USAExionLC-20ACAusrüstung
IRIS-StandardschereF.S.T. (Fine Science Tools) Deutschland14060-09Chirurgische Instrumente
IsofluraneRWD Life Science, PRCR510-22-10Material
Niedrigdurchfluss-AnästhesiesystemKent Scientific, USASomnoSuiteAusrüstung
Mikrodialyse-Perfusionsflüssigkeit T1CMA-Mikrodialyse, SchwedenP000034Material
Mikrodialysesonde, 20 EliteCMA-Mikrodialyse, Schweden8010436Material
Mikrodialyse-Spritzen 1 ml gasdichtCMA-Mikrodialyse, Schweden8309020Material
Gekühlter FraktionssammlerCMA-Mikrodialyse, Schweden470Ausrüstung
Split-Tubing für CMA 20-SondenCMA-Mikrodialyse, Schweden8309019Material
Stereoskopisches MikroskopOlympus, JapanSZ61Ausrüstung
SpritzenpumpeCMA MD AB, Schweden800310Ausrüstung

Referenzen

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