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Methodenartikel

Entwicklung und Validierung einer Methodik zur Etablierung von adipösen Rattenmodellen mit typischer Fettbauchspeicheldrüse

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DOI:

10.3791/69553

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11. November 2025

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1Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Department of Acupuncture and Moxibustion, Yangzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, 3Department of Specialty Medicine, Ohio University, 4Research Department, Swiss University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie bietet eine reproduzierbare und standardisierte Methode, um adipöse Rattenmodelle zu etablieren, die eine einfache Adipositas aufweisen, die häufig durch eine fettige Bauchspeicheldrüse gekennzeichnet ist. Es enthält auch detaillierte Protokolle für die Probenahme von Pankreasgewebe und die Immunhistochemie.

Zusammenfassung

Fettleibigkeit hat sich zu einer vorherrschenden globalen Gesundheitsepidemie entwickelt, wobei fast die Hälfte der Weltbevölkerung heute als übergewichtig oder fettleibig eingestuft wird. Ein wichtiges pathologisches Merkmal bei adipösen Personen ist die ektopische Lipidablagerung in nicht-fettigem Gewebe, einschließlich der Bauchspeicheldrüse - eine Erkrankung, die als Pankreassteatose oder Fettbauchspeicheldrüse bezeichnet wird. In Nagetiermodellen, die durch eine fettreiche Diät (HFD) induziert werden, geht die Pankreassteatose durchweg der Lebersteatose voraus, was die besondere Anfälligkeit der Bauchspeicheldrüse für eine Lipidakkumulation unterstreicht. Diese frühe Beteiligung positioniert die Bauchspeicheldrüse als kritisches Organ für das Verständnis der metabolischen Dysregulation bei Adipositas. Obwohl ernährungsinduzierte adipöse Ratten (DIO) Kernaspekte des menschlichen Krankheitsverlaufs rekapitulieren, sind gut charakterisierte Tiermodelle, die diesen Pankreas-Phänotyp zuverlässig aufweisen, in der Literatur rar.

Eine wichtige methodische Überlegung bei der Modellierung von Adipositas beim Menschen ist der Zeitpunkt der HFD-Einschleppung. Viele bestehende Modelle initiieren HFD während der Entwöhnungsphase, was zu verwirrenden entwicklungsbedingten metabolischen Programmierungseffekten führen kann, die die Fettleibigkeit beim Menschen, die sich hauptsächlich nach der Entwicklung entwickelt, nicht vollständig widerspiegeln. Im Gegensatz dazu etabliert die vorliegende Studie ein standardisiertes Protokoll, in dem HFD nach dem Absetzen eingeführt wird. Dieser Ansatz ahmt den üblichen menschlichen Verlauf des Auftretens von Fettleibigkeit im Erwachsenenalter genauer nach, vermeidet metabolische Anpassungen im frühen Leben und führt zu einem physiologisch relevanteren Fortschreiten zur Pankreassteatose.

Diese Forschung bietet einen detaillierten und reproduzierbaren Rahmen für die Generierung eines Rattenmodells für Adipositas, das durch eine ausgeprägte Fettbauchspeicheldrüsenpathologie gekennzeichnet ist. Die Methodik umfasst eine 1-wöchige Akklimatisierungsphase, eine 14-wöchige HFD-Induktionsphase ab der Entwöhnung und eine systematische Gewebeentnahme. Es werden zwei Gewebeverarbeitungswege beschrieben: das Snap-Freezing für molekulare Analysen (z.B. Western Blotting) und die Paraformaldehyd-Perfusionsfixierung für morphologische Bewertungen (z.B. IHC, H&E). Dieses Modell bietet eine robuste Plattform für mechanistische Untersuchungen der Adipositas-assoziierten metabolischen Dysfunktion der Bauchspeicheldrüse.

Einleitung

Einfache Adipositas ist definiert als Adipositas, die unabhängig ohne andere Komorbiditäten existiert und in erster Linie auf ein Energieungleichgewicht zurückzuführen ist, das auf einen ungesunden Lebensstil zurückzuführen ist, wie z. B. falsche Ernährungsmuster und unzureichende körperliche Aktivität1. Adipositas trägt erheblich zur steigenden Inzidenz nichtübertragbarer Krankheiten in der jüngeren Bevölkerung bei, die durch hohe Prävalenzraten, frühes Auftreten und Multisystemkomplikationen gekennzeichnet ist, was sie zu einer kritischen globalen Herausforderung für die öffentliche Gesundheit macht2. Die Fettbauchspeicheldrüse ist eine Erkrankung, die durch ektopische Lipidablagerungen in diesem nicht-fetten Organ während einer metabolischen Dysregulation gekennzeichnet ist. Die fettige Bauchspeicheldrüse spiegelt ein kritisches Zusammenspiel zwischen Fettgewebe und Pankreaspathophysiologie wider. Eine übermäßige Ansammlung von Bauchspeicheldrüsenfett verdrängt normales Azinus- und Inselgewebe, was zu doppelten Funktionsbeeinträchtigungen sowohl der exokrinen als auch der endokrinen Kapazitäten führt 3,4. Dieser pathologische Prozess stört das α/β-Zell-Verhältnis, fördert die β-Zell-Dedifferenzierung mit anschließendem Verlust der Insulinsekretionsfunktion5 und vermittelt direkte lipotoxische Schäden an β-Zellen6. Gleichzeitig verschlimmern die α-Zellproliferation und die dysregulierte Insulinfreisetzung die glykämische Instabilität und beschleunigen das Fortschreiten zu Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) und den damit verbundenen Komplikationen7.

Die Untersuchung der Pathogenese der Fettbauchspeicheldrüse offenbart neue Mechanismen, die dem Fortschreiten der Stoffwechselerkrankung zugrunde liegen8. Während sich frühere Adipositas-Forschungen auf Lebersteatosen konzentrierten, identifizieren neue Erkenntnisse die Lipidablagerung in der Bauchspeicheldrüse als ein früheres Ereignis bei metabolischer Dysregulation9. Dieser Paradigmenwechsel ermöglicht die Konstruktion eines dualen Organpathologiemodells für einfache Adipositas, das Pankreas- und Lebersteatose integriert10. Die Untersuchung ihrer Wechselwirkungen kann kritische Signalwege über das gesamte Krankheitsspektrum aufklären, das von Fettstoffwechselstörungen über Fettleibigkeit und Insulinresistenz bis hin zu Diabetes reicht, und neue Einblicke in die Krankheitsmechanismen bieten11. Im pathologischen Prozess der Bauchspeicheldrüse ist die erste Manifestation eine signifikante Ablagerung von Pankreasfett, begleitet von einer erheblichen Ausdehnung der Pankreasadipozyten. Dies wird hauptsächlich im ventralen Bereich des Kopfes, des Halses und des Körpers der Bauchspeicheldrüse beobachtet und befindet sich hauptsächlich in den interstitiellen Bereichen zwischen Azinus- und Inselzellen. Gleichzeitig liegt eine chronische niedriggradige Entzündung der Bauchspeicheldrüse vor, während sowohl die endokrine als auch die exokrine Funktion in diesem Stadium weitgehend intakt bleiben12,13. Eine ausgedehnte Fettinfiltration beeinträchtigt die Funktion der Bauchspeicheldrüse β Zellen durch Lipotoxizität weiter und unterdrückt die Insulinaktivität. Während dieser Phase werden Azinuszellen nach und nach durch Adipozyten ersetzt, wodurch sie zur Entwicklung von T2DMbeitragen 14,15. Obwohl Diabetes mellitus kein eigenständiger Risikofaktor für Bauchspeicheldrüsenkrebs ist, weisen Patienten mit akuter Pankreatitis und Diabetes in der Vorgeschichte ein signifikant erhöhtes Risiko auf, an Bauchspeicheldrüsenkrebs zuerkranken 16.

Makroskopische anatomische Analysen quantifizieren den Schweregrad der Pankreassteatose und die Infiltrationsmuster, während IHC-Auswertungen auf mikroskopischer Ebene die Morphologie der Azinuszelle, die Positionierung des Kerns, die Vakuolisierungshäufigkeit und die Dynamik der Zellpopulation charakterisieren17. Dieser multimodale Ansatz, der von der groben anatomischen Beobachtung bis zur zellaufgelösten IHC reicht, ermöglicht ein umfassendes Staging der Pankreaspathologie über den gesamten Krankheitsverlauf hinweg. Die vorliegende Studie beschreibt ein standardisiertes Protokoll, das eine 1-wöchige Akklimatisierung, eine 14-wöchige Adipositas-Induktion bei erwachsenen Ratten und eine optimierte Verarbeitung des Pankreasgewebes für die morphologische Analyse umfasst und damit einen robusten Rahmen für die Untersuchung von Steatose-assoziierten Stoffwechselstörungen schafft.

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Protokoll

Das Tierbehandlungsverfahren wurde von der Tierethikkommission der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Nanjing (202006A016) genehmigt und entsprach den ARRIVE-Richtlinien (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments), den ethischen Richtlinien, den Leitlinien für die Durchführung des Animals (Scientific Procedures) Act 1986 und den zugehörigen Richtlinien, der EU-Richtlinie 2010/63 zum Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden. Alle Versuchstiere wurden vor der Sektion in Übereinstimmung mit zugelassenen Nagetieranästhesieverfahren anästhesiert. Das Verfahren gliederte sich in drei verschiedene Komponenten.

1. Etablieren Sie ein adipöses Rattenmodell

  1. Versuchstiere und -gruppen
    1. Männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten im Alter von 4 Wochen (80-120 g) aus einem Stamm auswählen, der empfindlich auf fettreiche Ernährung (HFD) reagiert.
    2. Akklimatisieren Sie alle Ratten eine Woche lang an eine Erhaltungsdiät und teilen Sie sie dann nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen ein: die Kontrollgruppe und die Modellgruppe.
    3. Ersetzen Sie die Erhaltungsdiät durch HFD für die Modellgruppe nach einer Woche, während die Kontrollgruppe die ursprüngliche Diät beibehält. Halten Sie beide Gruppen 14 Wochen lang auf ihrer Diät. Die HFD-Zusammensetzung ist in Tabelle 1 und die Standardformulierung des Erhaltungsfutters in Tabelle 2 aufgeführt.
  2. Fütterungsbedingungen und Versuchsparameter
    1. Umgebungsparameter: Temperatur 22 ± 2 °C, Luftfeuchtigkeit 50 ± 10%, 12 h Hell-Dunkel-Zyklus und freier Zugang zu Wasser und Lebensmitteln.
  3. Indikatoren zur Überwachung
    1. Erfassen Sie das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme wöchentlich zu einer festen Zeit.
      HINWEIS: Wenn Sie es am Abend tun, kann dies Stress minimieren und sich an die täglichen / nächtlichen Aktivitätsmuster anpassen18.
    2. Zeichnen Sie eine Wachstumskurve für das Körpergewicht anhand der aufgezeichneten Daten.
    3. Definieren Sie eine erfolgreiche Adipositasmodellierung so, dass das Körpergewicht 20 % der altersgleichen Kontrollgruppe übersteigt.
BestandteilGehalt (g/kg)Wichtige Nährstoffe bereitgestellt
Gewöhnliches Pulverfutter365Grundversorgung mit Kohlenhydraten, pflanzlichen Proteinen, Fetten, Vitaminkomplexen, Mineralstoffen, etc
Schmalz310Gesättigte Fettsäuren, Ungesättigte Fettsäuren
Casein250Essentielle Aminosäuren
Cholesterin10Cholesterin
Zellulose- und Mineralstoffgemisch60Ballaststoffe, Kalzium, Phosphor, Natrium usw.
DL-Methionin, Methionin/Methionin-Aminosäuren3Essentielle Aminosäuren
Hefe1B-Vitamine, β-Glucan usw.
NaCl1NaCl

Tabelle 1: Spezielle HFD-Formulierung zur Etablierung von DIO in Rattenmodellen. Die Tabelle zeigt die spezifische Zusammensetzung des in dieser Studie verwendeten HFD für die Modellgruppe, die vom Ende der Akklimatisierungsphase bis zur Gewebeentnahme verabreicht wurde.

BestandteilInhaltEinheit
Feuchtigkeit12.196%
Rohprotein (CP%)18.272%
Verdauliche Energie (DE)3.186Mcal/kg
Umsetzbare Energie (ME)2.939Mcal/kg
Nettoenergie (NE)2.228Mcal/kg
Ether-Extrakt (EE%)4.417%
Rohfaser (CF%)3.677%
Kalzium (Ca%)0.991%
Gesamter Phosphor0.681%
(Gesamt in %)
Nicht-Phytat-Phosphor0.19%
Salz0.407%
Lysin1.118%
Verdauliches Lysin0.813%
Methionin0.53%
Threonin0.779%
Tryptophan0.221%
Kupfer (Cu)22.06mg/kg
Eisen (Fe)173.69mg/kg
Mangan (Mn)102.1176mg/kg
Zink (Zn)60.3687mg/kg

Tabelle 2: Standard-Erhaltungsfutternahrung bei Ratten. Die Tabelle zeigt die Formulierung des Standarderhaltungsfutters, das allen Ratten während der Akklimatisierungsphase und der Kontrollgruppe während der gesamten Studiendauer verabreicht wurde.

2. Gewebeentnahme

  1. Präoperative Vorbereitung
    1. Fastenbehandlung: 12 h Nahrungsrestriktion vor der Euthanasie, um die Beeinträchtigung des Darminhalts durch biochemische Analysen zu minimieren.
    2. Anästhesie: Verabreichen Sie Isofluran über Inhalation für eine tiefe Anästhesie (Induktionskonzentration 4%, Erhaltungskonzentration 1,5-2%). Das Anästhesiegerät war mit einem Verdampfer für Isofluran ausgestattet, und die Anästhesiekonzentration wurde bei 1,5-2 gehalten. Als Referenz für die Zubereitung betrug der physikalische Verbrauch von flüssigem Isofluran während des gesamten Verfahrens etwa 0,5 ml bis 0,8 ml pro Ratte.
    3. Überwachen Sie die Anästhesietiefe: Verfolgen Sie kontinuierlich die Atemfrequenz und die Hornhautreflexe. Halten Sie während des gesamten Eingriffs einen anhaltenden Anästhesiezustand aufrecht, um eine postmortale Pankreasautolyse zu verhindern.
    4. Behandeln Sie eine unzureichende Anästhesie: Wenn die Anästhesietiefe unzureichend ist oder das Bewusstsein erneut auftritt, verabreichen Sie sofort 20 % Urethan intraperitoneal für eine zusätzliche Anästhesie (50 mg/kg) und überprüfen Sie die Vitalfunktionen erneut, bevor Sie fortfahren. Bereiten Sie eine 20%ige Urethanlösung vor, indem Sie Urethanpulver in Kochsalzlösung auflösen.
      HINWEIS: Die Isofluran-Anästhesie ist die Methode, die den ethischen Anforderungen des Versuchstierzentrums der Nanjing University of Chinese Medicine entspricht. Für dieses terminale Verfahren kann eine intraperitoneale Injektion von 20 % Urethan als akzeptable Alternative verwendet werden. Die vorliegenden Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass Isofluran bei Nagetieren ein höheres Sicherheitsprofil als Ketamin bietenkann 19.
  2. Entnahme von frischem Gewebe
    1. Hautdesinfektion: Sprühen Sie 75% Ethanol schnell auf den gesamten Körper (1-2 s), um eine Kontamination der Bauchorgane durch die Haare zu verhindern.
    2. Positionsfixierung: Positionieren Sie die Ratte in Rückenlage auf dem Seziertisch und fixieren Sie alle vier Gliedmaßen sicher mit Großkopfstiften.
    3. Fassen Sie die Bauchhaut mit einer Pinzette in der linken Hand und schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie (vom Xiphoid bis zum Schambein) mit einer Schere in der rechten Hand ein. Präparieren Sie die subkutane Faszie stumpf, um das Bindegewebe zu trennen, und durchtrennen Sie den Musculus rectus abdominis und das Bauchfell entlang derselben Mittellinie.
    4. Identifizierung der Bauchspeicheldrüse: Verlagern Sie den Darm vorsichtig nach links, um Magen, Milz und Zwölffingerdarm sichtbar zu machen. Die Milz ist am Schwanz der Bauchspeicheldrüse befestigt, und der Magen befindet sich in der Nähe der Bauchspeicheldrüse.
    5. Schnelle Dissektion: Heben Sie die Milz vorsichtig mit einer Pinzette an und isolieren Sie die Bauchspeicheldrüse, indem Sie nach und nach die Befestigungen an Milz, Magen und Zwölffingerdarmmesenterium durchtrennen. Vermeiden Sie aufgrund seiner zerbrechlichen Textur ein direktes Einklemmen des Pankreasparenchyms und schonen Sie die Pankreasgänge/Blutgefäße, um ein Reißen des Gewebes zu verhindern.
    6. Gewebeerhaltung: Spülen Sie die präparierte Bauchspeicheldrüse schnell mit eiskalter PBS (1× phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PH 7,4) oder Kochsalzlösung, um Blutreste zu entfernen. Die Bauchspeicheldrüse sofort in ein 2-ml-Gefrierröhrchen überführen, innerhalb von 30 s in flüssigen Stickstoff eintauchen und langfristig bei -80 °C lagern.
    7. Euthanasie und Kadaverentsorgung Nach der Gewebeentnahme werden alle Versuchsratten durch Gebärmutterhalsdislokation eingeschläfert. Gemäß den Vorschriften des Experimental Animal Center der Nanjing University of Chinese Medicine werden Tierkadaver als pathologischer biomedizinischer Abfall eingestuft (Abfallcode: 831-003-01). Verschließen Sie alle Tierkadaver in luftdichten Beuteln gemäß den Vorschriften und lagern Sie sie einheitlich in den dafür vorgesehenen Gefrierschränken. Die zentrale und umweltgerechte Entsorgung erfolgt durch die Universität. Auf keinen Fall dürfen Schlachtkörper willkürlich zurückgeworfen werden.
      HINWEIS: Die Exposition bei Raumtemperatur ist zu vermeiden, um einen enzymatischen Abbau von Biomolekülenzu verhindern 20,21.
  3. Entnahme von Perfusionsgewebe (die restlichen Schritte sind die gleichen)
    1. Legen Sie das Herz frei: Heben Sie das Hautgewebe der Ratte mit der linken Hand an und öffnen Sie die Brusthöhle mit der rechten Hand, um das Herz vollständig freizulegen.
    2. Bereiten Sie den linken Ventrikel für die Perfusion vor: Machen Sie einen kleinen Schnitt am linken Ventrikel (Größe entspricht dem Durchmesser der Perfusionsnadel) und schneiden Sie die rechte Ohrmuschel ein, um den Blutabfluss zu ermöglichen.
    3. Perfusionskochsalzlösung: Führen Sie die Perfusionsnadel vorsichtig in den linken Ventrikel ein und perfundierten Sie langsam 100 mL Kochsalzlösung mit einer Flussrate von 10 mL/min, bis der rechtsatriale Ausfluss frei wird.
    4. Perfund-Fixiermittel: Umstellung auf 200 mL 4 % Paraformaldehyd-Fixiermittel, Durchflussrate: 5 mL/min. Perfundieren Sie jede Ratte mit 100 ml Kochsalzlösung, gefolgt von 200 ml 4% Paraformaldehyd. In dieser Studie wurde eine kommerziell hergestellte PFA-Lösung verwendet. Aufgrund der Instabilität von PFA in Lösung, die je nach Zubereitung und Frische ein erhebliches Variabilitätspotenzial aufweist, muss die flüssige Lösung vor Licht geschützt und bei 4 °C gelagert werden. Verwenden Sie umgehend ein geöffnetes Aliquot, um die Wirksamkeit sicherzustellen. Wenn die Lösung aus Pulver hergestellt wird, sollte sie unmittelbar vor der Verwendung frisch hergestellt werden.
      HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel. In einem Abzug durchführen, da Paraformaldehyd giftig ist. Gemäß den Vorschriften des Experimental Animal Center der Nanjing University of Chinese Medicine werden Paraformaldehyd-Abfälle als chemischer biomedizinischer Abfall eingestuft (Abfallcode: 831-004-01). Nach Gebrauch muss es in einem speziellen Abfallbehälter aufbewahrt werden, der mit dem Symbol der biologischen Gefährdung gekennzeichnet ist. Die zentrale Entsorgung erfolgt durch die Universität. Es darf unter keinen Umständen unsachgemäß entsorgt werden.
    5. Bestätigung des Perfusionserfolgs: Überprüfen Sie, ob die Gliedmaßen steif sind, was auf eine effektive Fixierung hinweist.
    6. Legen Sie die Bauchspeicheldrüse in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 30 ml 4%iger Paraformaldehydlösung. Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie den Schlauch 2-4 h lang stationär im Dunkeln lagern.
    7. Übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 30 ml 70%iger Ethanollösung. Halten Sie die Röhre für ca. 20-24 h22 stationär und lichtgeschützt.
    8. Paraffineinbettung: Betten Sie das Gewebe in Paraffinwachs ein. Lagern Sie das eingebettete Gewebe bei 4 °C oder -20 °C.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden Paraffinschnitte verwendet. Gefrorene Schnitte sind eine gültige Alternative, aber die Antikörperleistung muss zuvor für den jeweiligen Schnitttyp überprüft werden, um optimale Ergebnisse zu gewährleisten.

3. Immunhistochemische (IHC) Färbung der Bauchspeicheldrüse

  1. Schnitt- und Montageprotokoll
    1. Paraffinschnitte: Gewebeschnitte mit einem Mikrotom in einer Dicke von 6 μm schneiden und auf Objektträger aufkleben.
    2. Flotationsmethode: Lassen Sie die Abschnitte auf einem 40 °C warmen Gewebeflotationsbad schwimmen, um Falten zu glätten.
    3. Gewebeentnahme: Montieren Sie die Schnitte auf klebstoffbeschichtete Objektträger (2-3 pro Objektträger) und trocknen Sie sie auf einem 80 °C warmen Objektträgerwärmer.
    4. Objektträgertrocknung: Objektträger mit montierten Profilen nach dem Trennen über Nacht in einen 60 °C Ofen überführen.
  2. Entparaffinierungs- und Rehydrationsprotokoll
    1. Legen Sie die Dias in eine Diaablage und tauchen Sie nacheinander wie folgt ein: Xylol I, 7 min; Xylol II, 7 min; wasserfreies Ethanol, 5 min; 90% Ethanol, 5 min; 85% Ethanol, 5 min; 75% Ethanol, 5 min; destilliertes Wasser, 5 min; PBS, 5 min (dreimal).
      HINWEIS: Führen Sie Xylolschritte in einem Abzug mit Handschuhen und Schutzbrille durch. Xylolabfälle sind nach dem gleichen Protokoll zu entsorgen, das für Paraformaldehyd in Schritt 2.3.4 angegeben ist.
  3. Protokoll zur Antigen-Entnahme
    1. Zubereitung der Natriumcitratlösung: Bereiten Sie Natriumcitratpuffer (pH 6,0) vor. Wir verwendeten eine selbst hergestellte Natriumcitrat-Pufferlösung, indem wir ein Päckchen des Pulvers in 1 l Wasser auflösten.
    2. Nacheinander in die Mikrowelle stellen: Legen Sie die Objektträger in ein mit Natriumcitrat-Pufferlösung gefülltes Glasfärbeglas, um die Objektträger abzudecken, und stellen Sie das Glas dann in die Mikrowelle. Die Proben wurden einer Mikrowellenbehandlung in der folgenden Reihenfolge unterzogen: mittlere Hitze (600 W) für 8 Minuten, gefolgt von 8 Minuten stehendem Stand ohne Erhitzen und schließlich 7 Minuten lang niedrige Hitze (300 W).
    3. Auf natürliche Weise auf Raumtemperatur abkühlen lassen: Lassen Sie den Behälter auf natürliche Weise auf Raumtemperatur abkühlen.
    4. PBS: Spülen Sie die Objektträger zweimal 5 Minuten lang in PBS.
  4. Inkubation im Ofen
    1. H2O2: Tragen Sie 3% H2O2 10 Minuten lang auf die Gewebeschnitte auf, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Tragen Sie ca. 50 - 80 μl H2O2 auf jeden Objektträger auf.
    2. PBS: Waschen Sie die Objektträger dreimal 5 Minuten lang in PBS.
    3. Strept-Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (SABC): SABC tropfenweise auf das Gewebe auftragen und 30 min in einem 37 °C heißen Inkubator färben. Tragen Sie ca. 50 - 80 μl SABC auf jeden Objektträger auf.
    4. PBS: Waschen Sie die Objektträger dreimal 5 Minuten lang in PBS.
  5. Farbwiedergabe
    1. 3,3'-Diaminobenzidin (DAB): DAB chromogene Lösung auf die Gewebeschnitte auftragen und überwachen, bis sich eine bräunlich-gelbe Färbung entwickelt. Die Abschnitte ca. 1-5 min einfärben. Passen Sie die Färbedauer basierend auf der Gewebespezifität und der Umgebungstemperatur an. Für Pankreasgewebe wird eine Färbezeit von 2 min bei 22 °C empfohlen.
    2. Spülen: Spülen Sie die Objektträger sofort unter einem sanften Strahl destillierten Wassers, um die Reaktion zu stoppen.
    3. Eintauchen: Tauchen Sie Objektträger 5 Minuten lang in destilliertes Wasser, um Reagenzienreste zu entfernen.
  6. Hämatoxylin-Färbung
    1. Hämatoxylin: Tauchen Sie die Objektträger 1 Minute lang in das Hämatoxylin. Hämatoxylinlösung wird mit reinem Wasser in einem Verhältnis von 56 mg/ml hergestellt.
    2. Spülen: Spülen Sie die Objektträger zweimal in destilliertem Wasser (5 s pro Spülgang).
    3. Salzsäure-Alkohol-Differenzierung: Differenzieren Sie die Objektträger in der Salzsäure-Alkohol-Differenzierungslösung für 1 s.
    4. Eintauchen: Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in Leitungswasser, um eine stabile blaue Kernfärbung zu entwickeln.
  7. Dehydratisierung: Entwässern Sie die Objektträger nacheinander durch die folgenden Lösungen: 70 % Ethanol, 80 % Ethanol, 90 % Ethanol, wasserfreies Ethanol, Xylol I und Xylol II jeweils 3 Minuten lang in jeder Lösung.
    HINWEIS: Führen Sie Xylolschritte in einem Abzug mit Handschuhen und Schutzbrille durch.
  8. Versiegelung
    1. Montieren Sie die Abschnitte mit Neutralbalsam: Tragen Sie Neutralbalsam mit einer Gummipipette auf die Rutsche auf. Abdeckung mit Deckglas. Vermeiden Sie es, die Glühbirne gewaltsam zusammenzudrücken, um Blasenbildung zu vermeiden. Tragen Sie ca. 50 μl Neutralbalsam auf jeden Objektträger auf.
    2. Lufttrocknen: Legen Sie die Rutschen über Nacht in einen Abzug, damit das neutrale Harz vollständig trocknen kann.

4. Western-Blotting-Analyse (WB)

  1. Zersetzung von Geweben
    1. Nehmen Sie 200 mg Pankreasgewebe der Ratte und geben Sie es in ein 2-ml-Mahlröhrchen, das 1 ml Lysepuffer und 3 kleine Stahlkugeln enthält. Der Lysepuffer besteht aus einem vollständigen Proteaseinhibitor-Cocktail und einem RIPA-Lysepuffer. Das Mischungsverhältnis beträgt 1 Tablette Proteasehemmer: 50 ml RIPA-Lysepuffer.
    2. Die Vermahlung erfolgte mit einer Kugelmühle mit folgenden Parametern: Frequenz: 30/s; Zeit: 30 s; 10-15 mal. Bis mit bloßem Auge keine weißen Partikel mehr sichtbar sind.
    3. Den oberen Proteinüberstand in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen, keinen Schaum entnehmen. Zentrifugieren Sie es mit 16900 x g 30min, 4 °C.
      HINWEIS: Homogenate für die Western-Blotting-Analyse wurden aus der gesamten Bauchspeicheldrüse hergestellt.
  2. Proteinquantifizierung: Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das Mischungsverhältnis für BCA-Arbeitslösung ist Lösung A: Lösung B = 50:1.
  3. Protein-Elektrophorese:
    1. Die vorbereiteten Pankreasproteinproben (ein Volumen von 6 μl wurde in jede Spur geladen) werden zur Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Young PAGE, Bis-Tirs, 10 × 8 gegeben.
    2. Betrieb mit 70 V für 0,5 h und dann 1 Stunde lang mit 110 V Betrieb mit dem Mini-PROTEAN Tetra System. Verdünnen Sie die MOPS-Elektrophorese Running Buffer Flüssigkeit 20× mit reinem Wasser auf eine Konzentration von 1×.
  4. Membran-Transfer
    1. Das Transferkonzentrat eBlot L2 5× bis 1× Arbeitskonzentration mit reinem Wasser verdünnen. Dieser 1× Transferpuffer kann bis zu 3 Mal wiederverwendet werden. Das Balance-Konzentrat eBlot L2 5× bis 1× Arbeitskonzentration mit reinem Wasser verdünnen.
    2. Schneiden Sie eine PVDF-Membran (Immobilon-P Transfer Membrane) auf die entsprechende Größe zu (z. B. 7,5 cm × 5,5 cm). Die Porengröße beträgt 0,45 μm.
    3. Gießen Sie ca. 30 mL Methanol in eine Inkubationsbox mit 90 × 60 × 32 mm. Tauchen Sie die PVDF-Membran 5 s lang in das Methanol, um sie zu aktivieren.
    4. Gießen Sie ca. 30 mL der vorbereiteten 1x Balance-Lösung in eine weitere saubere Inkubationsbox. Entfernen Sie das Gel vorsichtig von den Elektrophoreseplatten und geben Sie es in die Waagenlösung.
    5. Übertragen Sie die aktivierte PVDF-Membran aus dem Methanol und legen Sie sie ebenfalls in die Inkubationsbox mit der Bilanzlösung. Stellen Sie sicher, dass die Membran für einen ordnungsgemäßen Kontakt unter dem Gel positioniert ist. Lassen Sie beide sich ausgleichen.
    6. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers des Löschgeräts, und legen Sie das Transfer-"Sandwich" in dieser Reihenfolge von oben nach unten: Schwamm, Gel, PVDF-Membran, Schwamm. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen den Schichten eingeschlossen sind. Setzen Sie den zusammengebauten Transferstapel korrekt in die Kammer des Löschgeräts ein. Schließen Sie das Netzteil an und lassen Sie die Übertragung 15 Minuten lang im Standardmodus laufen.
  5. Block
    1. Bereiten Sie zwei Inkubationsboxen vor, eine mit ca. 15 ml TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung-Tween20) und die andere mit etwa 15 ml 5%iger BSA-Blockierungslösung.
    2. Zubereitung der TBST-Lösung: Lösen Sie einen Beutel Tris gepuffertes Kochsalzpulver in 2 l reinem Wasser auf und fügen Sie dann 2 ml Tween 20 hinzu.
    3. Legen Sie die PVDF-Membran in die TBST-Lösung, wobei Sie sicherstellen, dass die Seite, die mit dem Gel in Kontakt war, nach oben zeigt.
    4. Waschen Sie die PVDF-Membran auf einem Shaker bei 40 U/min bei Raumtemperatur für 3-5 min.
    5. Übertragen Sie die PVDF-Membran in den Blockierungspuffer. Blockieren Sie es auf einem Shaker bei 20 U/min bei Raumtemperatur für 1 h.
  6. Inkubation von Primärantikörpern
    1. Waschen Sie die PVDF-Membran in einer Inkubationsbox, die TBST enthält, und waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 5 Minuten auf einem Shaker bei 40 U/min bei Raumtemperatur.
    2. Inkubieren Sie den Primärantikörper über Nacht (14-18 h) bei 4 °C (1:40000, Polyklonaler Vinculin-Antikörper) in einer anderen Antikörper-Inkubationsbox auf einem Schüttler bei 20 U/min.
    3. Es ist sicherzustellen, dass der Antikörper mit einer 5%igen BSA-Blockierungslösung verdünnt wird, die gemäß dem im Abschnitt angegebenen Verhältnis hergestellt wird.
  7. Inkubation von sekundären Antikörpern
    1. Legen Sie die PVDF-Membran in eine Inkubationsbox mit 15 ml TBST-Lösung. Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 5 Minuten auf einem Shaker bei Raumtemperatur und rühren Sie bei 40 U/min.
    2. Bereiten Sie den Sekundärantikörper vor, indem Sie Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper bei 1:2000 in 5 % BSA-Blockierungspuffer verdünnen.
    3. 1 h bei Raumtemperatur auf einem Shaker bei 20 U/mininkubieren 23.
    4. Waschen Sie die PVDF-Membran dreimal mit TBST-Lösung für jeweils 5 Minuten nach der oben beschriebenen Methode.
  8. Erkennung
    1. Bereiten Sie die Arbeitssubstratlösung vor, indem Sie AccuWest ECL Plus, Raegent A und AccuWest ECL Plus, Raegent B in einem Volumenverhältnis von 1:1 direkt in einer Inkubationsbox mischen. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte lichtgeschützt durch.
    2. Inkubieren Sie die PVDF-Membran 5-10 s lang in der Lösung und weisen Sie dann sofort immunreaktive Banden mit Reagenzien für verstärkte Chemilumineszenz (ECL) - Vilber Fusion FX6 MINI - nach. Die typische Belichtungszeit liegt zwischen 5 und 10 s.

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Ergebnisse

Wir beschreiben ein reproduzierbares Protokoll zur Etablierung eines einfachen Adipositasmodells, das zuverlässig eine fettige Bauchspeicheldrüse aufweist (Abbildung 1). Der gesamte Prozess, von der Tierfütterung über die Gewebeentnahme bis hin zur anschließenden molekularen Validierung, ist in Abbildung 1 schematisch zusammengefasst. Die wöchentlichen Gewichtsveränderungen der Modellgruppe (n = 5) und der Kontrollgruppe (n = 5)...

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Diskussion

Als Haupttreiber des metabolischen Syndroms stellt unkomplizierte Adipositas die erste Manifestation einer Dysregulation des systemischen Fettstoffwechsels dar. Ohne Intervention kann es zu T2DM und schweren diabetischen Komplikationen kommen, was die Notwendigkeit einer frühzeitigen metabolischen Korrektur unterstreicht30. Die Pankreassteatose (fettige Bauchspeicheldrüse), ein früher Marker für ektopische Lipidablagerungen bei Fettleibigkeit, definiert die Bauchs...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Projekt der Erben und Dozenten für die akademische Erfahrung des Erbes der siebten Gruppe von national renommierten Experten für traditionelle chinesische Medizin; Die National Natural Science Foundation of China, Young Scientists Fund Project [Fördernummer 82305376]; Projekt zur Unterstützung junger Talente in Wissenschaft und Technologie in der Provinz Jiangsu im Jahr 2024 [Fördernummer JSTJ-2024-380].

Die Flussdiagramme wurden mit FigDraw, Biorender, erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Material
1,5 mL MikrozentrifugenröhreBiosharp Bioengineering Co. LtdBS-15-MWB
2 ml GefrierröhrchenLABSELECTCV-002-200-EXWB
2 ml MahlröhrchenWuhan Servicebio Technology Co., LtdHT-200-MWB
3 % H2O2Booster Electronics Technology Co., Ltd.20A23CIHC
4 % ParaformaldehydBiosharp Bioengineering Co. LtdBL539APerfusions-Pankreas-Dissektionsoperation
5%-BSA-LösungBiofroxx4240GR100IHC
50 mL Zentrifugenrohr Biosharp Bioengineering Co. LtdBS-500-MGewebekonservierung
AccuWest ECL Plus, Raegent ANanjing Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
AccuWest ECL Plus, Raegent BNanjing Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
Wasserfreies EthanolShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.10009257IHC
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener AntikörperCell Signaling Technology.Inc.7074WB
cOmplete Protease-Inhibitor-CocktailHoffmann-La Roche Ltd 82256300WB
CoverslipCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD10212450CIHC
DAB-chromogene LösungBooster Electronics Technology Co., Ltd.AR2017-1IHC
PinzetteShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.SP0007-MSektion der SD-Ratte
Glas-Objektträger CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD188105IHC
Glasglas-Buntglas-GlasShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.FG010IHC
HämatoxylinShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST2067-20gIHC
Fettreiche DiätSuzhou Shuangshi Laboratory Animal Feed Technology Co., Ltd.Tabelle1Nahrung mit Versuchstieren
SalzsäurealkoholShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C0163MIHC
IsofluranShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10Betäubte Ratten
methanol Biofroxx67-56-1WB
MOPS läuft Buffer Liquid 20×Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C36842504WB
Neutraler BalsamPeking Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G8590IHC
Neutrales HarzShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.G8590IHC
PBS-LösungJiangsu Keygen Biotech Corp., Ltd.KGL2206-500Gewebekonservierung
Pierce BCA Protein-Assay Kit Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, USA.ZB382867
Pierce BCA Protein-Assay Kit hermo Fisher Scientific Inc, Waltham, USAZB382867WB
Protease-Inhibitor-CocktailHoffmann-La Roche Ltd 82256300
PVDF-Membran (Immobilon-P-Transfermembran, Millipore, 0000380346) Merck Millipore0000380346WB
RIPA-LysepufferBiosharp Bioengineering Co. LtdBL504A, 70096436WB
SABCBooster Electronics Technology Co., Ltd.20C03AIHC
KochsalzlösungSHANXI SHENGAO ANIMAL PHARMACEUTICAL CO., LTD. 270071460Gewebekonservierung
SD männliche RatsJiangsu GemPharmatech Co., Ltd. D000017Ratten
NatriumcitratMerck Life ScienceS1804IHC
Standard-WartungsfeedSuzhou Shuangshi Laboratory Animal Feed Technology Co., Ltd.Tabelle2Nahrung mit Versuchstieren
der Restkonzentrat eBlot L2 5&x;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97212410 WB
das Transferkonzentrat eBlot L2 5&x;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97211504WB
Tris gepufferte Kochsalzlösung, Pulver & NBSP;Biosharp Bioengineering Co. LtdBL602AWB
Tween 20BiofroxxEZ681A3EA8WB
UrethanSigma-Aldrich Co., Ltd.U2500-100GBetäubte Ratten
Vinculin Polyklonaler AntikörperProteintech Group, Inc.26520-1-APWB
XylenNanjing Reagenz-GesellschaftC0430530223IHC
Young PAGE, Bis-Tirs, 10& Mal; 8Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C33152505WB
Ausrüstung
AnästhesiemaschineShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.Modell R5805Betäubte Ratten
Kugelmühle;Retsch Technology GmbH – MicrotracMM400WB
ZentrifugenEppendorf SE5418RWB
computergestützter biologischer GewebetrocknerZhejiang Jinhua Kedi Instrument Co.SC2013-G-KITIHC
verbesserte Chemilumineszenz-(ECL)-Reagenzien  VILBER BIO-BILDGEBUNG00170961WB
Microtome Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, USA.HM325IHC
MikrowelleShanghai Boxun Industry Co., Ltd. 97000IHC
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories, Inc.1658004WB
OfenShanghai Jinghong Scientific Co., Ltd.DNP-9082IHC
Reines WasserSichuan UPT Ultra-Pure Technology Co., Ltd.ULUP-TEZIHC

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