Thrombusprofiling-Assay: Eine auf Mikrofluidik basierende Plattform zur umfassenden Charakterisierung biomechanischer Thrombogenese

Summary

Diese Arbeit beschreibt einen mikrofluidischen Assay, der Scherspannung nutzt, um die Thrombusbildung im Blut auszulösen, und charakterisiert den Thrombus anhand mehrerer Auswertungsdimensionen. Der Test kann die prothrombotische Tendenz von Blutproben messen und ist daher nützlich für die Krankheitsdiagnose, Arzneimittelentwicklung sowie grundlegende mechanistische Studien im Zusammenhang mit Thrombose.

Abstract

Thrombose ist eine pathologische Erkrankung, die die abnormale Ansammlung von Blutplättchen und Gerinnungsfaktoren in einem Blutgefäß beschreibt. Während viele Arbeiten sich auf die Thrombozytenaktivierung durch lösliche Agonisten als zugrunde liegenden Mechanismus der Thrombose konzentrierten, wurde oft übersehen, dass der Blutfluss auch die Thrombusbildung fördert. Insbesondere in den Arterien ist Thrombose im Allgemeinen mit einer arteriellen Stenose verbunden, die den Scherdruck im Blutfluss erhöht und den Prozess der Thrombogenese erleichtert, ein Phänomen, das als biomechanische Thrombogenese bezeichnet wird. Lange Zeit stand kein Bioassay zur Verfügung, um umfassende und detaillierte Einblicke in den Prozess der biomechanischen Thrombogenese zu liefern. Um dies zu beheben, wurde ein Thrombusprofiling-Test entwickelt, der Mikrofluidik mit mehrfarbiger Fluoreszenzbildgebung kombiniert, was eine umfassende Charakterisierung der biomechanischen Thrombogenese mit sieben Anzeigen ermöglicht, die Größe und Zusammensetzung des Thrombus sowie das Aktivierungsniveau der Blutplättchen abdecken. Dieser Thrombusprofil-Test kann verwendet werden, um die prothrombotische Tendenz beim Menschen und die Wirksamkeit antithrombotischer Mittel zu bewerten, und ist auch nützlich, um die Mechanismen hinter arterieller Thrombose besser zu verstehen.

Introduction

Thrombose ist eine Hauptursache für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und verursacht weltweit jedes Jahr Millionen von Todesfällen¹. Derzeit ist in den regulären klinischen Einrichtungen kein Bioassay zur Bewertung des Thrombosenrisikos verfügbar. Unter den kommerzialisierten Labor- und Point-of-Care-Hämatologie-Funktionstests haben sich konventionelle Gerinnungstests und Aggregometrie als unzuverlässig bei der Vorhersage von Thrombosen oder schwerwiegenden kardiovaskulären Ereignissen erwiesen ^2,3,4. Der globale Thrombosent....

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien und wurde vom Human Research Ethics Committee der University of Texas Medical Branch genehmigt. Das experimentelle Hardware-Setup besteht aus einem mikrofluidischen Bauteil, Perfusionskomponenten (Steckverbinder, Schläuche, Spritze und Spritzenpumpe) sowie einem invertierten Mikroskop mit optischen Komponenten, die Hellfeld- und Mehrfarb-Fluoreszenzbildgebung ermöglichen. Im Mikroskop werden ein Mehrfach-LED-Leuchtturm und ein Mehrfach-Filterwürfel verwendet, um 4 Leuchtstoffröhrenkanäle mit minimalem gegenseitigem Durchblingen zu spalten: Anregung: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31 und Emission: 43....

Results

Der Thrombusprofil-Test perfundiert das Blut durch einen stenotischen Kanal, um die Thrombusbildung durch Scherantrieb zu ermöglichen, und führt eine Echtzeit-Mehrfarb-Fluoreszenzbildgebung durch, um multidimensionale Informationen über den gebildeten Thrombus zu sammeln. Durch Durchführung von Experimenten mit sowohl Set 1 als auch Set 2 Sensoren sollte man den Thrombus in Aspekten wie Größe, Anreicherung der vernetzenden Proteine (von-Willebrand-Faktor, Fibrinogen) sowie Thrombozytenak.......

Discussion

Durch die Kombination des mikrofluidischen Stenose-Tests mit mehrfarbiger Fluoreszenzbildgebung bietet der Thrombusprofil-Test einen bequemen und leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der biomechanischen Thrombogenese und der Thrombozytenmechanobiologie. Gleichzeitig ist der Assay in einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Beispielsweise kann es verwendet werden, um antithrombotische Wirkstoffe zu screenen, die speziell die biomechanische Blutplättchenaggregation hemmen, wobei das mo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-mL-Spritzen	Henke Sass Wolf	5100-X00V0	Blutprobenentnahme
15-mL Falkenrohre	Genesee Scientific	28-101	Lagerung von Blutproben
1-mL gasdichte Glasspritze	Hamilton	81331	Hardware-Montage
2.2.9	MERU VasImmune		Thrombusverfärbung
20 x1/2 Sondennadeln	McMaster-Carr	M919	Herstellung von PDMS-Geräten
20-mL-Spritzen	Henke Sass Wolf	5200-X00V0	Blutprobenentnahme
70 % Ethanol	Sigma-Aldrich	EX0281-1	Desinfektion gasdichter Spritzen und Reinigung von Glasträgern
AK4-Alexa Fluor 647	BioLegend	304918	Thrombusverfärbung
Alexa Fluor 405 NHS Ester	Invitrogen	A30000	Fibrinogen-Markierung
Alexa fluor 555 Antikörper-Kennzeichnungsset	Invitrogen	A88065	MBC 370.2 und 2.2.9 Kennzeichnung
Annexin V-Pacific Blue	Invitrogen	501121505	Thrombusverfärbung
Reinigungsstaubwegem	Bürodepot	911245	Herstellung von PDMS-Geräten
Bastelmesser-Set mit Holzkiste	Excel Blades	44282	Herstellung von PDMS-Geräten
Deionisiertes Wasser	ThermoFisher Scientific	751-628	Waschen gasdichter Spritzen
Desiccator	Bel Art	F420270000	Entgasung von PDMS
Einweg-Mehrzweck-Labor-Spatel	LevGo	17211	Mischung der Silikon-Elastomerbasis und des Aushärtungsmittels
Farbstoff- und Biotinentfernungs-Spin-Säule	Zeba	A44296S	Fibrinogen-Markierung
Fibrinogen	Innovative Forschung	IHUFBG25MG	Thrombusverfärbung
Fusion 200-X Spritzenpumpe	Chemyx Inc.	0720X	Hardware-Montage
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	Blutprobe-Antikoagulation
Hochfrequenzgenerator	Electro-technic product Inc.	BD-20	Herstellung von PDMS-Geräten
Menschliches VWF-Monomer	Sino Biological Inc.	10973-H08C	Mikrofuidische Bauteilbeschichtung
Image J v1.53 Software	Fidschi, Nationales Gesundheitsinstitut		Datenanalyse
Invertiertes Mikroskop	Leica	DM IL LEITETE; Filterwürfel: Leica DFT51010; Leuchtturm: LED5	Hardware-Montage
Kimwipes	Kimberly – Clark Profi	34120	Reinigung von Glasrutschen
Luer-Schlosskappen	International Medical Industries, Inc.	57100B	Blutprobenentnahme
MBC 370.2	Kerafast	EBW104	Thrombusverfärbung
Mikroskopabdeckungsgläser	Paul Marienfeld GmbH & Kompanie KG	ES0107222	Herstellung von PDMS-Geräten
Mini-Rasierklingen-Schaber	Stanley	28-100	Herstellung von PDMS-Geräten
NanoDrop 2000 UV-Vis-Spektrophotometer	Thermowissenschaftlich	ND-2000	Proteinkonzentration und F/P-Verhältnis Messen
Ofen	Lab-Line Instrumente	3512	Herstellung von PDMS-Geräten
PAC-1-Alexa Fluor 647	BioLegend	362806	Thrombusverfärbung
Plastikbecher	ThermoFisher Scientific	S04589	Mischung der Silikon-Elastomerbasis und des Aushärtungsmittels
SU-8 Photoresist-Master  Schimmel	UC San Diego Nano3 Nanofabrikation Reinraum-Einrichtung		Herstellung von PDMS-Geräten
Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit	Krayden Dow	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC	Beckman Coulter	IM 1756U	Thrombusverfärbung
Röhren	Cole-Palmer Instrument Co.	06422-01	Hardware-Montage