Thrombusprofiling-Assay: Eine auf Mikrofluidik basierende Plattform zur umfassenden Charakterisierung biomechanischer Thrombogenese

Summary

Diese Arbeit beschreibt einen mikrofluidischen Assay, der Scherspannung nutzt, um die Thrombusbildung im Blut auszulösen, und charakterisiert den Thrombus anhand mehrerer Auswertungsdimensionen. Der Test kann die prothrombotische Tendenz von Blutproben messen und ist daher nützlich für die Krankheitsdiagnose, Arzneimittelentwicklung sowie grundlegende mechanistische Studien im Zusammenhang mit Thrombose.

Abstract

Thrombose ist eine pathologische Erkrankung, die die abnormale Ansammlung von Blutplättchen und Gerinnungsfaktoren in einem Blutgefäß beschreibt. Während viele Arbeiten sich auf die Thrombozytenaktivierung durch lösliche Agonisten als zugrunde liegenden Mechanismus der Thrombose konzentrierten, wurde oft übersehen, dass der Blutfluss auch die Thrombusbildung fördert. Insbesondere in den Arterien ist Thrombose im Allgemeinen mit einer arteriellen Stenose verbunden, die den Scherdruck im Blutfluss erhöht und den Prozess der Thrombogenese erleichtert, ein Phänomen, das als biomechanische Thrombogenese bezeichnet wird. Lange Zeit stand kein Bioassay zur Verfügung, um umfassende und detaillierte Einblicke in den Prozess der biomechanischen Thrombogenese zu liefern. Um dies zu beheben, wurde ein Thrombusprofiling-Test entwickelt, der Mikrofluidik mit mehrfarbiger Fluoreszenzbildgebung kombiniert, was eine umfassende Charakterisierung der biomechanischen Thrombogenese mit sieben Anzeigen ermöglicht, die Größe und Zusammensetzung des Thrombus sowie das Aktivierungsniveau der Blutplättchen abdecken. Dieser Thrombusprofil-Test kann verwendet werden, um die prothrombotische Tendenz beim Menschen und die Wirksamkeit antithrombotischer Mittel zu bewerten, und ist auch nützlich, um die Mechanismen hinter arterieller Thrombose besser zu verstehen.

Introduction

Thrombose ist eine Hauptursache für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und verursacht weltweit jedes Jahr Millionen von Todesfällen¹. Derzeit ist in den regulären klinischen Einrichtungen kein Bioassay zur Bewertung des Thrombosenrisikos verfügbar. Unter den kommerzialisierten Labor- und Point-of-Care-Hämatologie-Funktionstests haben sich konventionelle Gerinnungstests und Aggregometrie als unzuverlässig bei der Vorhersage von Thrombosen oder schwerwiegenden kardiovaskulären Ereignissen erwiesen ^2,3,4. Der globale Thrombosentest⁵, PFA-100/200⁶ und die globalen Koagulationstests ^7,8,9,10,11 enthalten ebenfalls begrenzte Daten, die ihre Leistung unterstützen.

Nach dem aktuellen Verständnis wird der Prozess der Thrombogenese hauptsächlich durch drei Mechanismen verursacht. Neben den beiden konventionell anerkannten Mechanismen, nämlich der biochemischen Thrombozytenaggregation und -gerinnung, ist ein dritter Mechanismus, der wenig untersucht und oft unterschätzt wird: die schergetriebene Thrombozytenaggregation, die auch als "biomechanische Thrombozytenaggregation" bezeichnet ^wurde12,13. Bei der biomechanischen Thrombozytenaggregation dienen hohe Scherspannungen und Schergradienten als Hauptantrieb für die Thrombozytenvernetzung über den GPIbα-von-Willebrand-Faktor (VWF), Integrin α_IIbβ_3-VWF und Integrin α_IIbβ_{3-Fibrinogen-Wechselwirkungen}. Bei arterieller Thrombose dient die biomechanische Thrombozytenaggregation wahrscheinlich als wesentlichster Mechanismus, da sie durch den hohen Scherfluss durch arterielle Stenose stark verstärkt wird. Daher wurde die durch biomechanische Blutplättchenaggregation ausgelöste Thrombogenese als 'biomechanische Thrombogenese^{' bezeichnet.}

In früheren Arbeiten ist eine gängige Methode zur experimentellen Beobachtung der biomechanischen Thrombozytenaggregation der mikrofluidische Stenose-Assay, bei dem eine Stelle schwerer Stenose in einen geraden Kanal eingebettet wird. Wenn Blut unter physiologischer Wandscherspannung über den Kanal perfundiert wird, entsteht um die stenotische Stelle pathologisch hohe Scherspannung, was die Ansammlung von Thrombozyten zur Bildung eines Thrombos fördert. Frühere Arbeiten verwendeten jedoch nur eine (für Thrombozyten, entsprechend der Thrombusgröße) 15,16,17,18,19 oder höchstens zwei (eine für Thrombozyten und eine für einen weiteren Biomarker)^13,20, die daher keine vollständige Charakterisierung des Thrombus erreichen.

Kürzlich wurde ein Thrombusprofiling-Assay entwickelt, der eine mehrfarbige Fluoreszenzbildgebung im mikrofluidischen Stenose-Test integriert und eine Echtzeitverfolgung von 7 Biomarkern erreicht (Thrombozyten, Fibrinogenniveau, von-Willebrand-Faktorniveau, P-Selektin-Expressionsniveau, Phosphatidylserin-Expositionsniveau, erweitertes_{Integrin-α IIb}- β 3-Expressionsniveau, vollständig aktives Integrin α_IIbβ₃ Expressionsniveau) in einem Thrombus, was die Grundlage für eine umfassende Charakterisierung der biomechanischen Thrombogenese²¹ bildet. In dieser Arbeit werden detaillierte Protokolle zur Vorbereitung und Durchführung des Thrombus-Profiling-Assays sowie zur zugehörigen Datenanalyse bereitgestellt. Die für den Test erforderliche Hardware umfasst ein invertiertes, mehrfarbiges Fluoreszenzmikroskop und ein mikrofluidisches System. Der Test verwendet eine relativ geringe Menge menschliches Vollblut (weniger als 2 ml), hat eine hohe Kosteneffizienz (~12 $ pro Probe) und liefert Ergebnisse innerhalb von 30 Minuten. Der Test kann die multidimensionalen prothrombotischen Anomalien von Personen genau nachweisen und die Wirkung von antithrombotischen Mitteln bei der Veränderung von Größe, Zusammensetzung und Thrombozytenaktivierungsstatus bewerten, womit seine breite Anwendung sowohl für Forschungs- als auch für klinische Zwecke in der Zukunft unterstützt^wird. Bemerkenswert ist, dass der Test frisch entnommenes heparinisiertes Blut verwenden muss. Die Lagerung des Blutes bei 4 °C oder über 6 Stunden oder die Verwendung von Antikoagulanzien, die andere als Heparin verwenden, verhindert entweder die Bildung von Thromben oder führt zu ungenauen Ergebnissen.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien und wurde vom Human Research Ethics Committee der University of Texas Medical Branch genehmigt. Das experimentelle Hardware-Setup besteht aus einem mikrofluidischen Bauteil, Perfusionskomponenten (Steckverbinder, Schläuche, Spritze und Spritzenpumpe) sowie einem invertierten Mikroskop mit optischen Komponenten, die Hellfeld- und Mehrfarb-Fluoreszenzbildgebung ermöglichen. Im Mikroskop werden ein Mehrfach-LED-Leuchtturm und ein Mehrfach-Filterwürfel verwendet, um 4 Leuchtstoffröhrenkanäle mit minimalem gegenseitigem Durchblingen zu spalten: Anregung: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31 und Emission: 435/30, 519/25, 594/32, 695/58. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Augenschutz und eine Laborjacke, für alle experimentellen Verfahren. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von mikrofluidischen Geräten

1. Entwerfen Sie eine Hauptform, die rechteckige Kanäle (200 μm breit × 50 μm hoch) enthält, die eine Stelle mit 80 % luminaler Verengung enthalten. Jeder Kanal verfügt über eigene Einlässe und Auslässe für Rohranschlüsse (Abbildung 1; siehe Supplementary File 1 für die ursprüngliche Designdatei).
2. Basierend auf dem Design wird ein Siliziumwafer verwendet, um eine SU-8-Photoresist-Masterform mittels Standardphotolithographie herzustellen. Klebe die Form am Boden einer 15 cm langen Petrischale (Abbildung 2A) fest.
3. Bereiten Sie die PDMS-Mischung vor, indem Sie die Präpolymerbasis und das Aushärtungsmittel im Silikon-Elastomer-Kit bei einem Gewichtsverhältnis von 10:1 mischen. Gieße die Mischung auf die Hauptform (Abbildung 2B).
4. Platzieren Sie die Platte mit dem PDMS-Gemisch in einen Vakuum-Desikator, um zu entfetten und eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
   HINWEIS: Halten Sie die Platte mindestens 2 Stunden unter Vakuum, bis die Blasen vollständig entfernt sind.
5. Die PDMS-Mischung thermisch aushärten, indem Sie sie 2 Stunden lang bei 75 °C inkubieren.
6. Schneiden Sie vorsichtig das ausgehärtete PDMS aus der Hauptform (Abbildung 2C, D) und teilen Sie es in einzelne Chip-Einheiten.
7. Erzeugen Sie Ein- und Auslass, indem Sie Löcher an den vorgesehenen Stellen mit einer Sondennadel stechen (Abbildung 2E).
   HINWEIS: Verwenden Sie einen Druckluft-Duster, um eventuelle Rückstände aus den gestanzten Löchern zu entfernen. Um Oberflächenkontaminationen zu minimieren, reinigen Sie die PDMS-Geräte vor dem Klebeband mit Klebeband.
8. In einer chemischen Haube sprühen Sie 75 % Ethanol auf ein Task-Tuch und verwenden Sie das befeuchtete Task-Tuch, um Glasfolien abzuwischen und zu reinigen. Lass die Glasscheiben trocknen.
9. In einer chemischen Haube behandeln Sie die Glasträger und PDMS-Chips mit einem Hochfrequenzgenerator für 30 Sekunden bzw. 20 Sekunden und richten Sie dann jeden Chip mit einem Glasverkleidungsstück aus. Drücken Sie den Chip vorsichtig auf die Glasfolie, damit er gebunden werden kann.
   HINWEIS: Dieser Schritt muss in einer chemischen Haube durchgeführt werden, da der Hochfrequenzgenerator während der Nutzung Ozon erzeugt, was gesundheitsschädlich ist.
10. Wärmeverbinden Sie die Geräte, indem Sie sie 15 Minuten lang bei 150 °C inkubieren. Nach dem Abkühlen sind die Geräte einsatzbereit (Abbildung 2F).
11. Lagern Sie die Geräte bei Raumtemperatur unter staubfreien Bedingungen.
12. Verwenden Sie eine Zange, um den Kunststoffteil der Sondennadeln zu entfernen, und biegen Sie die Metallrohre auf 90°. Diese gebogenen Röhren werden als Steckverbinder für die mikrofluidischen Bauelemente verwendet.

2. Fluoreszierende Sensorvorbereitung

HINWEIS: Das Experiment verwendet insgesamt 7 fluoreszierende Sensoren: SZ22-FITC, Fibrinogen-Alexa Fluor 405, 2.2.9-Alexa Fluor 555, AK4-Alexa Fluor 647, Annexin V-Pacific Blue, MBC 370.2-Alexa Fluor 555, PAC-1-Alexa Fluor 647. Darunter sind Fibrinogen, 2.2.9 und MBC 370.2 kommerziell nur in unkonjugierter Form erhältlich und müssen im Labor fluoreszierend konjugiert werden.

1. Um Fibrinogen mit Alexa Fluor 405 zu konjugieren:
   1. Stellen Sie einen frischen 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer mit pH 8,5 her.
   2. Verdünne Fibrinogen-Lager auf 1 mg/mL in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4).
   3. Gib 1/10 Volumen Natriumbicarbonat-Puffer zur Fibrinogenlösung hinzu.
   4. Mische 1 ml Fibrinogen mit 1 mg Alexa Fluor 405 NHS-Ester und inkubiere 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Vor Licht schützen.
   5. Entfernen Sie den Speicherpuffer aus einer Reinigungssäule, indem Sie die Säule für 2 Minuten bei 1.100 × g zentrifugieren und den Durchfluss entsorgen. Füllen Sie die Reaktionslösung auf die Säule, montieren Sie die Säule auf ein kompatibles Sammelfläschchen und zentrifugieren Sie mit 1.100 × g für 5 Minuten, um das Fibrinogen-Alexa Fluor 405 zu gewinnen.
   6. Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Absorption bei 280 nm (A₂₈₀; Proteinsignal) und 405 nm (A₄₀₅; Farbstoffsignal) Wellenlänge zu messen. Berechnen Sie die Proteinkonzentration und das F/P-Verhältnis (Fluoreszenz: Protein-molares Verhältnis).
      HINWEIS: Das F/P-Verhältnis sollte im Bereich von 8 bis 10 liegen.
   7. Fibrinogen-Alexa-Fluor 405 bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren.
2. Zur Konjugation von 2.2.9- und MBC 370.2-Antikörpern mit Alexa Fluor 555:
   1. Stellen Sie einen frischen 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer mit pH 8,5 her.
   2. Antikörper auf 1 mg/mL in einem aminfreien Puffer verdünnen.
   3. Gib 1/10 Volumen Natriumbicarbonatpuffer zur Antikörperlösung hinzu.
   4. Mische 100 μL Antikörper mit einer Phiole (100 μg) Alexa Fluor 555 NHS-Ester und inkubiere sie 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Vor Licht schützen.
   5. Entfernen Sie den Speicherpuffer aus einer Reinigungssäule, indem Sie die Säule für 2 Minuten bei 1.100 × g zentrifugieren und den Durchfluss entsorgen. Laden Sie die Reaktionslösung auf die Säule, montieren Sie die Säule auf ein kompatibles Sammelfläschchen und zentrifugieren Sie mit 1.100 × g für 5 Minuten, um das 2.2.9- oder MBC 370.2-Alexa Fluor 555 zu entnehmen.
   6. Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Absorption bei 280 nm (A₂₈₀; Proteinsignal) und 555 nm (A₅₅₅; Farbstoffsignal) zu messen. Berechnen Sie die Antikörperkonzentration und das F/P-Verhältnis (Fluoreszenz: Antikörper-Molarverhältnis).
      HINWEIS: Das F/P-Verhältnis sollte im Bereich von 1 bis 1,5 liegen.
   7. Lagere 2.2.9- und MBC 370.2-Alexa Fluor 555 bei 4 °C im Dunkeln.
      HINWEIS: Überetikettierung vermeiden Sie – ein hohes F/P-Verhältnis kann die biologische Funktion beeinträchtigen.

3. Blutentnahme von menschlichen Probanden

HINWEIS: Dieser Eingriff muss von qualifiziertem medizinischem Personal durchgeführt werden (z. B. lizenzierte Pflegekräfte, zertifizierte Phlebotomisten). Holen Sie außerdem eine schriftliche informierte Zustimmung der an der Studie teilnehmenden Personen ein.

1. Bereiten Sie die Spritze vor, indem Sie 500 μL Tyrode-Puffer (12 mM NaHCO₃, 10 mM Hepes, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5,5 mM D-Glukose, 0,5 % Rinderserumalbumin, pH 7,4) mit 0,32 U/mL Heparin pro 10 mL zu entnommenem Blut aspirieren.
2. Sammeln Sie Blut durch Venenpunktion . Benutze eine leere Spritze, um die ersten 2 ml Blut zu entsorgen. Dann wechselt man auf die Heparin-haltige Spritze, um die Blutprobe zu entnehmen. Ziehen Sie die Spritze langsam, um die Thrombozytenaktivierung zu minimieren.
3. Das gesammelte Blut wird in ein 15-mL-Zentrifugenrohr übertragen und unter 37 °C gehalten.
   HINWEIS: Blutproben sollten für Experimente innerhalb von 6 Stunden nach der Entnahme verwendet werden.

4. Thrombusprofiling-Assay

HINWEIS: Es wird empfohlen, alle Verfahren zur Blutbehandlung wann immer möglich in einem Biosicherheitsschrank durchzuführen, um Blutvergießungen beim Experimentator zu vermeiden. Wenn das nicht möglich ist, verwenden Sie einen Splash-Schild auf der Werkbank.

1. Verdünne VWF-Monomer in PBS auf 2 μg/mL. Vorschichten Sie die mikrofluidischen Geräte mit VWF-Monomer und inkubieren Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur.
2. Inkubieren Sie die Blutprobe mit einem fluoreszierenden Sensor Set 1 oder 2 für 10 Minuten bei Raumtemperatur:
   1. Set 1: SZ22-FITC (0,5 μg/mL), Fibrinogen-Alexa Fluor 405 (60 μg/mL), 2.2,9-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), AK4-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
   2. Set 2: SZ22-FITC (0,5 μg/mL), Annexin V-Pacific Blue (1 μg/mL), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), PAC-1-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
      HINWEIS: Da zwei Sensorsätze getrennt verwendet werden müssen, muss jede Blutprobe mindestens zweimal getestet werden (einmal mit Sensorsatz 1 und einmal mit Sensorsatz 2), um einen vollständigen Datensatz zu erhalten.
3. Schließen Sie ein mikrofluidisches Gerät mit Ein- und Auslassanschlüssen sowie Rohren an. Verbinden Sie das andere Ende des Einlassanschlusses mit einem Rohr mit PBS und das andere Ende des Auslassanschlusses mit einer Spritze. Befestige die Spritze an einer Spritzpumpe. Installieren Sie das mikrofluidische Gerät auf ein umgekehrtes Mikroskop und manövrieren Sie die Stufe manuell, um die Stenosestelle unter dem Mikroskop zu finden (Abbildung 3A).
4. Füllen Sie den mikrofluidischen Kanal und den Schlauch mit PBS mit der Spritzenpumpe bei einer Durchflussrate von 0,5 mL/min. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen an der Stelle der Stenose vorhanden sind.
5. Verbinden Sie den Einlassschlauch mit der Blutprobe und perfundieren Sie die Blutprobe durch den mikrofluidischen Kanal mit der Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 0,018 mL/min (Abbildung 3A).
6. Stellen Sie die Belichtungszeit und die Verstärkung jedes Fluoreszenzkanals ein. Führen Sie eine Echtzeit-Mehrfarb-Fluoreszenzbildgebung durch, indem Sie zwischen den 4 Kanälen wechseln und jeweils eine Art von Fluorophor anregen. Finden Sie in der Zwischenzeit die Fokusebene des Thrombus und zeichnen Sie Signale an der Stelle der Stenose auf, die typischerweise 15–30 Minuten dauern (Abbildung 4).
   HINWEIS: Die Belichtungszeit jedes Kanals muss so angepasst werden, dass das fluoreszierende Signal leicht zu erkennen ist und eine Sättigung vermieden wird (Abbildung 4). Im vorliegenden System zeigen die Blutproben gesunder Probanden typischerweise den folgenden Signalintensitätsbereich innerhalb des gebildeten Thrombus: SZ22-FITC, 70-110; Fibrinogen-Alexa Fluor 405, 60-100; 2.2.9-Alexa Fluor 555, 70-110; AK4-Alexa Fluor 647, 45-75; Annexin V-Pacific Blue, 35-65; MBC 370.2-Alexa Fluor 555, 45-85; PAC-1-Alexa Fluor 647, 10-30. Bemerkenswert ist jedoch, dass ein kleiner Anteil gesunder Probanden eine untypische Anzeige liefern würde. Daher wird empfohlen, mindestens 5 Blutproben gesunder Personen zu testen, um sicherzustellen, dass die Expositionszeit für jeden Kanal korrekt gewählt ist.

5. Datenanalyse

1. Öffnen Sie die Datendatei mit ImageJ 1.53 (Fiji, National Institutes of Health).
   HINWEIS: Jede Datei sollte insgesamt 4 Videos von 4 verschiedenen Kanälen enthalten. Das folgende Verfahren gilt im Allgemeinen für jeden Zeitpunkt, den der Nutzer analysieren möchte.
2. Verwenden Sie den SZ22-FITC-Kanal, um die Kontur des Thrombus zu identifizieren, und verwenden Sie 'Polygon-Auswahlen', um die Fläche des Thrombus grob zu bestimmen (Abbildung 5A,B).
3. Für jeden Kanal verwenden Sie Image -> Adjust -> Threshold , um den Hintergrund zu eliminieren (Abbildung 5C), und verwenden Sie dann Analyze -> Measure , um die Fläche und durchschnittliche Intensität des Signals im Thrombus zu messen.
   HINWEIS: SZ22-FITC färbt Thrombozyten und spiegelt somit die Thrombusgröße wider. In Set 1 spiegelt Fibrinogen-Alexa Fluor 405 das Fibrinogen-Anreicherungsniveau wider, 2,2,9-Alexa Fluor 555 das von-Willebrand-Faktor (VWF)-Anreicherungsniveau und AK4-Alexa Fluor 647 spiegelt die P-Selektionsexpression wider. In Set 2 spiegelt Annexin V-Pacific Blue die Phosphatidylserin-(PS)-Exposition wider, MBC 370.2-Alexa Fluor 555 reflektiert Integrin α_IIbβ_{3-Aktivierung} der erweiterten Konformation (E⁺ α_IIbβ₃), und PAC-1-Alexa Fluor 647 spiegelt Integrin α_IIbβ₃ vollständige Aktivierung wider (Act. α_IIbβ₃)²¹.

Results

Der Thrombusprofil-Test perfundiert das Blut durch einen stenotischen Kanal, um die Thrombusbildung durch Scherantrieb zu ermöglichen, und führt eine Echtzeit-Mehrfarb-Fluoreszenzbildgebung durch, um multidimensionale Informationen über den gebildeten Thrombus zu sammeln. Durch Durchführung von Experimenten mit sowohl Set 1 als auch Set 2 Sensoren sollte man den Thrombus in Aspekten wie Größe, Anreicherung der vernetzenden Proteine (von-Willebrand-Faktor, Fibrinogen) sowie Thrombozytenak...

Discussion

Durch die Kombination des mikrofluidischen Stenose-Tests mit mehrfarbiger Fluoreszenzbildgebung bietet der Thrombusprofil-Test einen bequemen und leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der biomechanischen Thrombogenese und der Thrombozytenmechanobiologie. Gleichzeitig ist der Assay in einer Vielzahl von Anwendungen nützlich. Beispielsweise kann es verwendet werden, um antithrombotische Wirkstoffe zu screenen, die speziell die biomechanische Blutplättchenaggregation hemmen, wobei das mo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-mL-Spritzen	Henke Sass Wolf	5100-X00V0	Blutprobenentnahme
15-mL Falkenrohre	Genesee Scientific	28-101	Lagerung von Blutproben
1-mL gasdichte Glasspritze	Hamilton	81331	Hardware-Montage
2.2.9	MERU VasImmune		Thrombusverfärbung
20 x1/2 Sondennadeln	McMaster-Carr	M919	Herstellung von PDMS-Geräten
20-mL-Spritzen	Henke Sass Wolf	5200-X00V0	Blutprobenentnahme
70 % Ethanol	Sigma-Aldrich	EX0281-1	Desinfektion gasdichter Spritzen und Reinigung von Glasträgern
AK4-Alexa Fluor 647	BioLegend	304918	Thrombusverfärbung
Alexa Fluor 405 NHS Ester	Invitrogen	A30000	Fibrinogen-Markierung
Alexa fluor 555 Antikörper-Kennzeichnungsset	Invitrogen	A88065	MBC 370.2 und 2.2.9 Kennzeichnung
Annexin V-Pacific Blue	Invitrogen	501121505	Thrombusverfärbung
Reinigungsstaubwegem	Bürodepot	911245	Herstellung von PDMS-Geräten
Bastelmesser-Set mit Holzkiste	Excel Blades	44282	Herstellung von PDMS-Geräten
Deionisiertes Wasser	ThermoFisher Scientific	751-628	Waschen gasdichter Spritzen
Desiccator	Bel Art	F420270000	Entgasung von PDMS
Einweg-Mehrzweck-Labor-Spatel	LevGo	17211	Mischung der Silikon-Elastomerbasis und des Aushärtungsmittels
Farbstoff- und Biotinentfernungs-Spin-Säule	Zeba	A44296S	Fibrinogen-Markierung
Fibrinogen	Innovative Forschung	IHUFBG25MG	Thrombusverfärbung
Fusion 200-X Spritzenpumpe	Chemyx Inc.	0720X	Hardware-Montage
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	Blutprobe-Antikoagulation
Hochfrequenzgenerator	Electro-technic product Inc.	BD-20	Herstellung von PDMS-Geräten
Menschliches VWF-Monomer	Sino Biological Inc.	10973-H08C	Mikrofuidische Bauteilbeschichtung
Image J v1.53 Software	Fidschi, Nationales Gesundheitsinstitut		Datenanalyse
Invertiertes Mikroskop	Leica	DM IL LEITETE; Filterwürfel: Leica DFT51010; Leuchtturm: LED5	Hardware-Montage
Kimwipes	Kimberly – Clark Profi	34120	Reinigung von Glasrutschen
Luer-Schlosskappen	International Medical Industries, Inc.	57100B	Blutprobenentnahme
MBC 370.2	Kerafast	EBW104	Thrombusverfärbung
Mikroskopabdeckungsgläser	Paul Marienfeld GmbH & Kompanie KG	ES0107222	Herstellung von PDMS-Geräten
Mini-Rasierklingen-Schaber	Stanley	28-100	Herstellung von PDMS-Geräten
NanoDrop 2000 UV-Vis-Spektrophotometer	Thermowissenschaftlich	ND-2000	Proteinkonzentration und F/P-Verhältnis Messen
Ofen	Lab-Line Instrumente	3512	Herstellung von PDMS-Geräten
PAC-1-Alexa Fluor 647	BioLegend	362806	Thrombusverfärbung
Plastikbecher	ThermoFisher Scientific	S04589	Mischung der Silikon-Elastomerbasis und des Aushärtungsmittels
SU-8 Photoresist-Master  Schimmel	UC San Diego Nano3 Nanofabrikation Reinraum-Einrichtung		Herstellung von PDMS-Geräten
Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit	Krayden Dow	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC	Beckman Coulter	IM 1756U	Thrombusverfärbung
Röhren	Cole-Palmer Instrument Co.	06422-01	Hardware-Montage