Eine pflanzliche Einlaufformel, die Sanguisorba officinalis, Bletilla striata und Acacia catechu kombiniert, wurde mittels LC-MS/MS-Profiling, S100β-Andocken, einem DSS-Kolitismodell und LPS/IFN-γ-aktivierten enterischen Glia bewertet. Die Formel aktivierte S100β, unterdrückte die gliale Aktivierung und reduzierte die p-NF-κB/iNOS-Expression, was auf eine Verbesserung über die S100β-RAGE-NF-κB-Achse hinweist.
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Forschungsartikel
Eine pflanzliche Einlaufformel lindert die Colitis ulcerosa, indem sie die enterische Glialaktivierung über den S100β/RAGE/NF-κB-Weg hemmt.
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Aktivierung enterischer Gliazellen (EGCs) trägt zur Entstehung der Colitis ulcerosa (UC) bei. Diese Studie untersuchte, ob Dibai Enema Liquid (DBE) – ein pflanzliches Einlauf, das Sanguisorba officinalis, Bletilla striata und Acacia catechu kombiniert – durch EGC-bedingte Entzündungen moduliert. LC-MS/MS-Profile von DBE-Bestandteilen und priorisierten Verbindungen wurden an S100β angedockt. Die Wirksamkeit wurde bei von Dextransulfatnatrium (DSS)-induzierter Mauskolitis unter Verwendung von Körpergewicht, Dickdarmlänge, Histopathologie und Zytokinwerten (ELISA) bewertet. Die glialen Aktivierungsmarker wurden durch Immunhistochemie, Immunfluoreszenzkolokalisation, quantitative PCR (qPCR) und Immunblotting gemessen. Ein In-vitro-Modell verwendete CRL-2690 enterische Glia, aktiviert mit Lipopolysaccharid plus Interferon-γ, wobei DBE-haltiges Rattenserum (15 %) als Intervention diente. Das Andocken deutete auf eine starke vorhergesagte Bindung mehrerer DBE-Komponenten an S100β hin. DSS erhöhte TNF-α und IL-1β, störte enge Verbindungen und erhöhte S100β/GFAP sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinniveau, was mit glialer Hyperaktivierung übereinstimmt; DBE hat diese Änderungen erheblich rückgängig gemacht. In vitro reduzierte DBE S100β, RAGE, iNOS (NOS2) und phosphorylierte NF-κB p65. Insgesamt scheint DBE UC zu lindern, indem es die EGC-Aktivierung hemmt und die S100β/RAGE/NF-κB/iNOS-Achse herunterreguliert, wodurch die Schleimhautintegrität erhalten bleibt.
Einleitung
Colitis ulcerosa (UC) ist eine Hauptuntergruppe der entzündlichen Darmerkrankung (IBD), die durch eine chronische schleimhautentzündung des Dickdarms gekennzeichnet ist, mit einer weltweit steigenden Belastung seit 1990, wobei UC einen erheblichen Anteil der auftretenden IBD-Fälleausmacht 1,2. Typische Erscheinungsformen sind Bauchschmerzen und blutiger Durchfall, was zu erheblichen körperlichen und psychischen Belastungen sowie erheblichenBehandlungskosten führt. Obwohl die Behandlungsmöglichkeiten ausgeweitet wurden, ist die langfristige Exposition gegenüber Immunmodulatoren und Biologika, die die systemische Immunität unterdrücken, mit einem erhöhten Risiko für Lymphom und opportunistische Infektionen verbunden, und ein Teil der Patienten bleibt refraktär oder intolerant4. UC gilt weithin als immunvermittelte Erkrankung, bei der die Störung der schleimhautartigen Immunhomöostase zentral für die Pathophysiologieist. Allerdings zeigen sich die zunehmenden Belege, dass schleimhaut-Immunmechanismen allein nicht ausreichen, um alle Merkmale von IBD zu erklären; das enterische Nervensystem (ENS) trägt zur Darmentzündung bei und erweitert das Konzept der Krankheit auf Neuroinflammation bei IBD6.
Enterische Gliazellen (EGCs), die die enterischen Neuronen bei erwachsenen Säugetieren zahlenmäßig übertreffen, gelten heute als Schlüsselregulateure der intestinalen Homöostase und Entzündung 7,8. EGCs modulieren die Funktion der epithelialen Barriere, indem sie Mediatoren wie GDNF, TGF-β1, S100β und 15d-PGJ2 freisetzen und so Permeabilität und Mukoseintegrität9 beeinflussen. Unter diesen Mediatoren kann S100β nachgelagerte Kaskaden aktivieren – einschließlich des RAGE/NF-κB-Weges –, was zu Barriereschäden und Entzündungsamplifikation 10,11 führt. EGCs formen außerdem Immunantworten, indem sie den Makrophagenphänotyp und die viszerale Sensitivität über Connexin-43 und M-CSF regulieren und suppressive Effekte auf T-Zellen in vitro ausüben, wobei die EGC-Aktivierung als behandelbares therapeutisches Ziel in UC12,13 hervorgehoben wird.
Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) wird zunehmend an UC untersucht und zeigt vielversprechende Vorteile in klinischen und experimentellen Umgebungen14,15. Die klassische Kombination von Sanguisorba officinalis (Diyu) und Bletilla striata (Baiji) zusammen mit Acacia catechu (Ercha) ist seit langem für dysenterische Störungen in Materia medica-Quellen dokumentiert und wird in der chinesischen Arkibüchope für hämostatische, analgetische und wundheilende Indikationen aufgeführt. Zeitgenössische Studien berichten von antibakteriellen, entzündungshemmenden, antioxidativen und anti-ulkusiven Aktivitäten für diese Botanicals, während A. catechu auch neuroprotektive Eigenschaften mit Catechin als prominentem Bestandteil zeigt.16,17. Im Vergleich zur herkömmlichen systemischen Immunsuppression könnte eine Formulierung, die EGC-zentrierte neuroimmune Signalwege nutzt, komplementäre Wirksamkeit mit einem eigenen Mechanismus und potenziell weniger systemisch immunbezogenen Risikenbieten 18,19.
Diese Studie bewertet, ob die kombinierte Präparation aus Diyu, Baiji und Ercha (DBE) UC durch Unterdrückung der EGC-Aktivierung mildert. Es wird ein integrierter Ansatz verwendet: ungezieltes LC-MS/MS-Profiling zur Priorisierung der Bestandteile, molekulares Andocken mit S100β, Validierung in einem Dextransulfat-natrium-induzierten Kolitismodell und mechanistische Tests in EGCs. Die Arbeit betont einen neuroimmunen Mechanismus – S100β/RAGE/NF-κB/iNOS-los –, der in früheren UC-Therapien erforscht wurde, und skizziert praktische Implikationen für die Dosisauswahl, Formulierungsoptimierung und anschließende translationale Studien.
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Protokoll
Alle Tierverfahren wurden vom Tierethikkomitee der Beijing University of Chinese Medicine [BUCM-2023-0912] genehmigt und gemäß institutionellen und nationalen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt. Es waren keine menschlichen Versuchspersonen beteiligt.
Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Reagenzien und Materialien
Analytische Lösungsmittel und molekularbiologisch hochwertige Reagenzien wurden durchgehend verwendet. Alle kommerziellen Informationen, einschließlich Hersteller, Katalognummern und Softwarelizenzdetails, sind in der Materialtabelle (xlsx) bereitgestellt. Das Wasser für alle Vorbereitungen wurde deionisiert und gefiltert. Alle Puffer wurden frisch vorbereitet oder unter unten angegebenen Bedingungen gelagert.
2. Ausrüstung und Software-Einrichtung
Ein UPLC-MS/MS-System, das mit einem Quadrupol-Flugzeitspektrometer gekoppelt ist; eine gekühlte Zentrifuge mit Dreh-Eimer-Rotor; ein CO₂-Inkubator, der bei 37 °C, 5 % CO₂ und ≥95 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wird; ein Mikroplattenleser (450 nm); einen Echtzeit-PCR-Thermocycler; Elektrophorese und Blotting-Apparat; und ein Fluoreszenzmikroskop mit festen Anregungs-/Emissionsfiltern wurde verwendet. Instrumentensteuerung und Datenanalyse wurden in MassLynx v4.2 für chromatografische und massenspektrometrische Daten sowie in AutoDock 4.2 mit AutoDockTools 1.5.7 für das Andocken durchgeführt. Die Bildanalyse wurde in ImageJ/Fiji v1.53 durchgeführt.
3. Zubereitung der Dibai-Einlaufflüssigkeit (DBE)
Die Kräutermischung, bestehend aus Diyu (50 g), Baiji (50 g) und Ercha (20 g), wurde grob zerkleinert und 30 Minuten lang in 1.200 ml deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur eingeweicht, um eine vollständige Hydratation zu gewährleisten. Die eingeweichte Mischung wurde 30 Minuten lang kräftig gekocht und gelegentlich gerührt, um eine Haftung zu verhindern. Der heiße Abzug wurde durch steriles, mehrschichtiges medizinisches Gaze in sterile Glaswaren gefiltert, um unlösliches Material zu entfernen. Das Filtrat wurde in einem Wasserbad mit Vakuumkonzentration von maximal 45 °C konzentriert, bis ein Konzentrat mit einer Endkonzentration von 1,98 g/mL (Hochdosis-Lager) erreicht wurde. Mittel- und Niedrigdosis-Arbeitslösungen mit 0,99 g/mL und 0,50 g/mL wurden durch Verdünnung mit sterilem deionisiertem Wasser auf Endvolumina von jeweils 100 mL hergestellt. Jede Lösung wurde unter sterilen Bedingungen durch eine 0,22 μm Membran geleitet, in beschriftete sterile Behälter gegeben und bis zu sieben Tage bei 4 °C gelagert. Vor der Verwendung wurden die Lösungen vorsichtig gemischt; Ein akzeptables Aussehen war klar bis leicht opalisierend ohne sichtbare Partikel.
4. UPLC – MS/MS-Analyse der DBE
Das Pulver jeder medizinischen Komponente wurde mit 50 mg genau gewogen und mit 1,0 ml 80 % (v/v) Methanol durch Ultraschallbewegung 30 Minuten bei Umgebungstemperatur extrahiert. Die Extrakte wurden nach der Sonikation wieder auf Raumtemperatur gebracht, bei 15.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und Supernatanten wurden durch 0,22 μm-Membranen in Autosampler-Fläschchen gefiltert. Die chromatographische Trennung erfolgte an einer Umgekehrtphasensäule (2,1 × 100 mm, 1,8 μm; polar-endcaped C18-Typ), die bei 35 °C gehalten wurde; Spaltenmarke/Modell und Katalognummer sind in der Materialtabelle angegeben. Mobile Phase A: 0,1 % Ameisensäure im Wasser; Mobilphase B: Acetonitril. Durchflussrate: 0,30 mL/min; Injektionsvolumen: 10 μL. Gefälle: 5 % B für 0–2 Minuten; 5→95 % B von 2 bis 20 Minuten; 95 % B für 20–23 Minuten; 95→5 % B von 23,0 bis 23,1 Min; Gleichgewicht bei 5 % B bis 26 Minuten wieder aus (vollständige Gradiententabelle ist in Tabelle 1 angegeben).
Die Massenspektrometrie nutzte Elektrosprayionisation mit positiv/negativem Schalten und datenunabhängige Erfassung mit Nieder- und Hochenergiescans (). Massenbereich: m/z 100–1.500; Kapillarspannung: 2,0 kV; Stichprobenkegel: 20 V; Quelltemperatur: 120 °C; Desolvationstemperatur: 360 °C; Kegelgas: 50 L/h; Desolvationsgas: 600 L/h. Die Hochenergiefunktion verwendete eine gestufte Kollisionsenergie von 20–50 eV. Die Daten wurden in MassLynx v4.2 mit Lock-Mass-Korrektur und standardisierten Peak-Detektionsparametern verarbeitet. Eine umfassende Liste von 105 identifizierten Komponenten (Molekularformeln, beobachtete m/z, Retentionszeiten und Konfidenzwerte) ist in ergänzender Tabelle 1 bereitgestellt.
5. Molekulare Andockung
Das Andocken erfolgte in AutoDock 4.2 unter einem Induced-Fit-Protokoll. Die dreidimensionale Struktur von S100β (PDB 3HCM) wurde durch das Entfernen kristallographischer Wassermoleküle, das Hinzufügen polarer Wasserstoffe und das Zuweisen von Kollman-Ladungen hergestellt. Ligandenstrukturen, die charakteristische DBE-Bestandteile repräsentieren, wurden gebaut, mit physiologischem pH-Wert protoniert und energieminimiert. Die Bindungsstelle wurde durch die Native-Ligand-Koordinaten definiert; Aminosäurereste innerhalb von 6 Å des nativen Liganden wurden während des Andockens als flexibel behandelt. Gitterboxen umfassten die gesamte Tasche mit einem Rasterabstand von 0,375 Å. Lamarckianische genetische Algorithmusparameter waren: Populationsgröße 150; bis zu 2,5 × 10⁶ Energiebewertungen; 100 unabhängige Runs pro Ligand. Die finalen Posen wurden nach vorhergesagter freier Bindungsenergie bewertet und nach RMSD gruppiert; Wechselwirkungsmuster (Wasserstoffbrücken, hydrophobe Kontakte, π-π-Wechselwirkungen) wurden auf Konsistenz mit bekannten S100β-Komplexen visualisiert.
6. Tiermodell der durch DSS induzierten Kolitis und DBE-Behandlung
Männliche C57BL/6J-Mäuse (8 Wochen, 20–22 g) wurden mindestens 7 Tage bei 22 ± 2 °C, 50%–60% relativer Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus, mit Futter und Wasser ad libitum akklimatisiert. Die Tiere wurden zufällig in sechs Gruppen eingeteilt (n = 10/Gruppe): Kontrollgruppe, Dextransulfat-Natrium-(DSS)-Modell, Sulfasalazin (SASP)-Positivkontrolle sowie niedrig-, mittel- und hochdosierte DBE-Behandlungen. Verantwortliches Personal für die histologische Bewertung und Bildquantifizierung war für die Gruppenzuweisung blind.
Die experimentelle Kolitis wurde durch 2,0 % (w/v) DSS im Trinkwasser für 7 Tage ausgelöst, gefolgt von 1,0% DSS für 3 Tage und dann regelmäßiges Wasser für 4 Tage vor der Euthanasie. DBE wurde einmal täglich mit einem Einlauf von 10 ml/kg verabreicht, wobei ein flexibler Katheter 2,5 cm in den Rektum eingeführt wurde; Die Tiere wurden 30 Minuten lang vertikal gehalten, um das Auslaufen zu minimieren. Die täglichen DBE-Dosen betrugen 12,35, 27,4 und 49,4 g/kg pro Tag für die niedrigen, mittleren und hohen Gruppen; SASP wurde mit 0,5 g/kg/Tag als positive Kontrolle verabreicht. Körpergewicht, Stuhlkonsistenz und okkultes Blut im Stuhl wurden täglich erfasst, um den Krankheitsaktivitätsindex zu berechnen. Am Endpunkt wurden die Mäuse mit Pentobarbitalnatrium 50 mg/kg i.p. betäubt; Blut wurde aus dem retro-orbitalen Sinus mittels heparinisierter Kapillaren entnommen; Tiere wurden durch eine zervikale Verrenkung eingeschläfert. Der Dickdarm wurde vom ileozekalen Übergang zum Rektum entfernt, sanft verlängert und die Länge unter minimaler Spannung gemessen. Repräsentative Segmente waren in 4 % Paraformaldehyd fixiert; das verbleibende Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei −80 °C gelagert.
7. Herstellung eines medikamentenhaltigen Serums
Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden zufällig in Kontroll- und DBE-Gruppen eingeteilt (n = 6/Gruppe). Die DBE-Gruppe erhielt 12,34 g/kg/Tag durch orale Gavage, einmal täglich für 7 Tage; Die Kontrollen erhielten gleichvolumiges gereinigtes Wasser. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Dosis wurden die Tiere betäubt, und Vollblut wurde aus der Bauchaorta entnommen. Das Serum wurde nach 30 Minuten Gerinnung bei Raumtemperatur getrennt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.500 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Seren wurden bei 56 °C für 30 Minuten hitzeinaktiviert und unter sterilen Bedingungen durch 0,22-μm-Membranen gefiltert, bevor sie gelagert wurden. Das Serum wurde in sterile Röhren eingelagert und bei −80 °C gelagert. Hämolysierte Proben, die durch eine erhöhte Absorption von etwa 414 nm identifiziert wurden, wurden ausgeschlossen.
8. Histologische Untersuchung (H&E)
Darmgewebe, das 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert war, wurde durch klassifizierte Ethanole dehydriert, in Xylol freigegeben und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte (5 μm) wurden 5 Minuten lang geschnitten, deparaffinisiert, rehydriert und mit Hämatoxylin gefärbt, 5 Minuten in fließendem Wasser gebräunt und 2 Minuten mit Eosin gekontert. Die Objektträger wurden mit Harz montiert und auf Kryptarchitektur, Kelchzelldichte, Epithelkontinuität und entzündliche Infiltration untersucht. Repräsentative Änderungen werden mit Pfeilen/Pfeilspitzen angezeigt und in den Figurenlegenden definiert; Skalenbalken (z. B. 200 μm) und vordefinierte visuelle Schwellenwerte werden in den Legenden angegeben.
9. Immunhistochemie (IHC)
Paraffinschnitte wurden 15–20 Minuten bei 95–98 °C im Citratpuffer (pH 6,0) entnommen, 10 Minuten lang mit 3 % Wasserstoffperoxid abgeschreckt und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang mit 5 % normalem Serum blockiert. Primäre Antikörper wurden über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit einem Streptavidin-Peroxidase-Detektionssystem verarbeitet, das mit DAB für 2 Minuten entwickelt wurde (mikroskopische Überwachung), mit Hämatoxylin Gegenfärbung, dehydriert und montiert. Negative Kontrollgruppen ohne den primären Antikörper wurden in jede Charge aufgenommen.
10. Immunfluoreszenzanalyse (IF)
Paraffin-eingebettete Schnitte wurden deparaffinisiert und der Antigenabnahme im EDTA-Puffer (pH 8,0) unterzogen. Nach dem Abkühlen wurde die unspezifische Bindung mit 3% Rinderserumalbumin für 1 Stunde bei Zimmertemperatur blockiert. Schnitte wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen GFAP (1:500) und S100β (1:200) inkubiert, gefolgt von fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern (1:500) für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Die Kerne wurden mit DAPI gekontert und die Objektträger in Anti-Fade-Medium montiert. Die Bilder wurden mit identischen Objektiven aufgenommen, mit einer festen Belichtungszeit von 100 ms und einer Detektorverstärkung von 1,0 über Gruppen hinweg. Die mittlere Fluoreszenzintensität wurde in ImageJ/Fiji v1.53 nach der Kalibrierung der Pixelgröße, der Hintergrundsubtraktion (Rolling-Ball-Radius 50 Pixel) und der Normalisierung auf DAPI-positive Fläche quantifiziert. Mindestens fünf biologische Replikate pro Gruppe und drei nicht überlappende Felder pro Replikat wurden analysiert.
11. Zellkultur und Behandlungen
Rattenenterische Gliazellen (Bezeichnung CRL-2690) wurden in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂. Die Zellidentität wurde durch kurzes Tandem-Wiederholungsprofil bestätigt, und die Kulturen waren frei von Mykoplasma. Experimente wurden an den Passagen 5-15 durchgeführt. Die Zellen wurden in 6-Well-Platten mit 2,0 × 10⁵ Zellen/Bohrloch in 2,0 mL/Bohrloch-Medium eingepflanzt und konnten 24 Stunden anhaften. Versuchsgruppen waren: unbehandelte Kontrolle, Vehikelkontrolle, Modell, DBE-Serum und Inhibitor.
Zur Modellinduktion wurden die Zellen 24 Stunden lang Lipopolysaccharid (LPS, 1 μg/mL) plus IFN-γ (20 ng/mL) ausgesetzt; der entsprechende U/mL-Wert für IFN-γ wird in der Materialübersicht nach chargenspezifischer Potenz angegeben. Bei der DBE-Serumbehandlung erhielten die Zellen 15 % (v/v) wärmeinaktiviertes (56 °C, 30 min), 0,22 μm gefiltertes DBE-haltiges Rattenserum im vollständigen Medium für 24 Stunden (Dosierungsbereich 5%-20 % wird zur Viabilitätsoptimierung gemäß CCK-8 verwendet). Für die Inhibitorbehandlung wurde der selektive S100β-Inhibitor SBI-4211 (10-50 μM; 45 μM für wichtige Messwerte) für 24 Stunden angewendet. Fahrzeugsteuerungen stimmten dem Lösungsmittelgehalt (0,1 % DMSO (v/v)) ansonsten identischen Mediums ab. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Behandlungen in vorgewärmtem (37 °C) Medium vorbereitet, und die Zellen wurden 2 × mit PBS gespült, bevor die Behandlung ersetzt wurde. Nach der Behandlung wurden die Zellen für RNA-Extraktion, Proteinanalyse und Immunfluoreszenz, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben, gesammelt. Die biologische Replikation betrug n ≥ 5 unabhängige Kulturen pro Bedingung.
12. CCK-8-Zellviabilitätstest
Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 5 × 10³ Zellen/Brunnen in einem 100-μL-Medium ausgesat und über Nacht haften lassen. Das Medium wurde für 24 Stunden durch ein Medium mit DBE-behandeltem Serum bei 5 %, 10 %, 15 % oder 20 % (v/v) ersetzt. CCK-8-Reagenz (10 μL/Bohrloch) wurde hinzugefügt, und Platten wurden für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde bei 450 nm mit Blanksubtraktion gemessen (Medium + Reagenz, keine Zellen). Die Tragfähigkeit wurde als Prozentsatz der Fahrzeugkontrolle angegeben. Jede Erkrankung verwendete n ≥ 5 biologische Replikate (unabhängige Kulturen) mit drei technischen Replikaten pro Kultur.
13. ELISA für Gewebezytokine
Das Darmgewebe wurde auf Eis in PBS (1:9, w/v) homogenisiert, das Proteaseinhibitoren enthält. Die Homogenate wurden um 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C geklärt; Supernatanten wurden gemäß den Kit-Protokollen auf IL-1β und TNF-α getestet. Standards und Proben wurden doppelt durchgeführt, und die Kurven wurden mit einem vier-Parameter-logistischen (4PL)-Modell mit R² ≥ 0,99 ausgestattet; rückberechente Standards wurden innerhalb von 85 % bis 115 % des nominalen Werts akzeptiert. Die Absorption wurde bei 450 nm gemessen, mit einer Referenz von 620–650 nm, sofern verfügbar. Die Zytokinkonzentrationen wurden auf das Gewebegewicht (pg/mg Gewebe) normalisiert. Jede Gruppe umfasste n ≥ 5 biologische Replikate.
14. Quantitative Echtzeit-PCR (qPCR)
Die gesamte RNA aus dem Dickdarmgewebe (oder Zellen, je nach Anwendung) wurde mit einem Siliziummembran-Spin-Säulen-Kit isoliert. Die RNA-Integrität wurde durch A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1 und Agarose-Gel-Inspektion bestätigt. Erststrang-cDNA wurde aus 1 μg RNA mit genomischer DNA-Entfernung synthetisiert. qPCR verwendete SYBR Green Master-Mix auf einem kalibrierten Thermocycler mit dem Programm: 95 °C 30 s; 40 Zyklen mit 95 °C 5 S, 60 °C 30 S; Schmelzkurve 65–95 °C in 0,5 °C/5 S-Schritten. GAPDH diente als endogene Kontrolle. Die relative Expression wurde mit 2⁻ΔΔCt berechnet, nachdem die Primer-Effizienz überprüft wurde (90%–110%, aus Standardkurven-Steigungen). Keine RT- und Template-Steuerungen waren enthalten. Die Primer-Sequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Jede Gruppe hatte n ≥ 5 biologische Replikate und zwei technische Wiederholungen pro Probe.
15. Western-Blot-Analyse
Proteine aus dem Darmgewebe (oder den Zellen) wurden im RIPA-Puffer mit Protease-/Phosphataseinhibitoren extrahiert und durch einen BCA-Test quantifiziert. Das gleiche Protein (30 μg/Lane) wurde denaturiert, auf 4-20%-Gradienten SDS-PAGE aufgelöst und auf PVDF übertragen (0,45 μm; 0,2 μm für ≤ 20-kDa-Ziele). Die Membranen wurden in 5%iger Magermilch für 2 Stunden bei Zimmertemperatur blockiert und über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen GFAP (1:1.000), S100β (1:1.000), iNOS (1:1.000), NF-κB p65 (1:1.000), Phospho-NF-κB p65 (Ser536, 1:1.000), Occludin (1:1.000), Claudin-1 (1:1.000) und GAPDH (1:5.000) inkubiert. HRP-konjugierte sekundäre Antikörper (1:5.000) wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur aufgetragen. Die Signale wurden mit ECL entwickelt; Die Belichtungszeiten waren auf den linearen Dynamikumfang (10–90 Sekunden) beschränkt. Die Übertragungen wurden vor dem Blockieren durch reversible Membranfärbung bestätigt. Die Bandintensitäten wurden in ImageJ/Fiji v1.53 nach Hintergrundsubtraktion quantifiziert und auf GAPDH normalisiert. Erwartete Molekulargewichte: GFAP ~49 kDa, S100β ~10-12 kDa, NF-κB p65 ~65 kDa, iNOS ~130 kDa, Occludin ~65 kDa, Claudin-1 ~22 kDa, GAPDH ~36-37 kDa. Jede Analyse enthielt n ≥ 5 biologische Replikate.
16. Statistische Analyse
Die Daten wurden in GraphPad Prism 8.0 analysiert und als Mittelwert ± SEM präsentiert. Für Mehrfachgruppenvergleiche wurde ein Einweg-ANOVA gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test verwendet; für paarweise Vergleiche wurden bei Bedarf ungepaarte zweiseitige Student's t-Tests angewendet. Für Zeitverlauf- oder Zwei-Faktor-Designs (z. B. Behandlung × Dosis oder Behandlung × Zeit) wurde eine zweiseitige ANOVA (wiederholte Messungen, wenn anwendbar) mit Tukey- oder Dunnett-Korrektur verwendet, wie in den Abbildungslegenden angegeben. Die Tests von Shapiro-Wilk und Levene wurden verwendet, um Normalität und Homoskedastizität vor parametrischen Tests zu untersuchen; wenn Annahmen verletzt wurden, wurden die Daten log-transformiert oder mit geeigneten nichtparametrischen Tests analysiert (Kruskal-Wallis mit Dunns Post-hoc; Mann-Whitney U für Paarweise). Exakte p-Werte und Effektgrößenmaße (η² für ANOVA, Cohens D für t-Tests) werden in Abbildungslegenden angegeben, wo es zutrifft. Ein zweiseitiges p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Figurenlegenden verwenden folgende Notation für die Bedeutung: *p<0,05, **p<0,01, *** p<0,001 vs. Kontrolle; # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 vs DSS; NS, nicht signifikant.
17. Erwartete Ergebnisse und Qualitätskontrolle
Es wird erwartet, dass DSS die Dickdarmlänge verkürzt, den Krankheitsaktivitätsindex erhöht und histologische Schäden verursacht (Kryptarchitekturverzerrung, Kelchzellendepletion, Epithelerosion). Die DBE-Behandlung sollte dosisabhängig diese Indizes verbessern und die enterisch-glialen Aktivierungsmarker reduzieren. Westliche Blots sollten Bänder mit den oben genannten Molekulargewichten zeigen, mit erhöhten Signalen in DSS und Dämpfung mit DBE oder SBI-4211; Belichtungen sollten im linearen Dynamikumfang bleiben. Immunfluoreszenz für GFAP und S100β sollte erhöhte mittlere Intensitäten im DSS und eine Reduktion nach DBE-Behandlung zeigen. LC-MS/MS-Chromatogramme sollten stabile Retentionszeiten (Drift ≤ 0,2 min) und Massengenauigkeiten innerhalb ± 5 ppm für Referenzionen aufweisen, mit charakteristischen Fragmentionen für Schlüsselbestandteile. Negative Kontrollen (z. B. Auslassung primärer Antikörper) sollten kein spezifisches Signal liefern. Bildaufnahmeparameter (Objektiv, Belichtung, Verstärkung, Gamma) müssen über die Gruppen hinweg stabil bleiben, um valide quantitative Vergleiche zu ermöglichen.
18. Hinweise zur Fehlerbehebung
Trübung oder Partikel in DBE-Lösungen deuten auf unzureichende Filtration oder Niederschlagung hin; Wiederholen Sie die 0,22 μm-Filtration und bestätigen Sie den pH-Wert von 6,5-7,5. Übermäßige Sterblichkeit oder starker Gewichtsverlust während der DSS-Exposition deutet auf Überinduktion hin; Reduzieren Sie die DSS-Konzentration, überprüfen Sie das Molekulargewicht der Charge und ersetzen Sie täglich DSS-Lösungen. Die inkonsistente Immunfluoreszenzquantifizierung spiegelt typischerweise eine variable Exposition wider; Fixieren Sie Belichtungszeit und Verstärkung und fügen Sie eine Referenzfolie für die Batch-Kalibrierung bei. Schwache Western-Blot-Bänder können auf Unterlastung oder Übertragungsineffizienz hinweisen; Überprüfen Sie die Proteinquantifizierung, wählen Sie den passenden Gelprozentsatz oder -gradienten aus und bestätigen Sie den Transfer durch reversible Membranfärbung. Eine schlechte ELISA-Passung (R² < 0,99 oder die Standardrückberechnung außerhalb von 85–115 %) rechtfertigt die Wiederholung der Standardkurve und das Nachprüfen verdünnter Proben. Für qPCR läuft die Primer-Effizienz außerhalb von 90–110 % erneut, die Annealing-Temperatur oder die Primerkonzentration vor der Analyse neu zu optimieren.
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Ergebnisse
Identifikation von DBE-Komponenten und arzneimittelhaltigem Serum
LC-MS/MS identifizierte 105 einzigartige chemische Bestandteile in DBE, mit einem Massenfehler < 10 ppm. Die Identifikation wurde durch Molekularformel, Isotopenmuster und Fragmentabgleich bestätigt. Hauptklassen waren unter anderem Triterpene, Flavonoide, Biphenanthrene und organische Säuren. Arzneimittelhaltiges Serum zeigte nach Blanksubtrak...
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Diskussion
Colitis ulcerosa (UC) ist eine chronisch entzündliche Darmerkrankung mit multifaktorieller Pathogenese. Neben dysregulierten Immunantworten sind auch die Dysfunktion der intestinalen Epithelbarriere und die Dysbiose der Darmmikrobiota bekannte Ursachen, während Anomalien des enterischen Nervensystems (ENS) zunehmend als Haupttreiber für das Fortschreiten von UCidentifiziert werden. Insbesondere können sowohl strukturelle als auch funktionelle Dysregulation des ENS...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch das Bauprojekt hochrangiger Schlüsselmedizinischer Disziplinen der Nationalen Verwaltung für traditionelle chinesische Medizin (ZYYSZX-2023256) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AutoDock 4.2 | Molekulare Andocksoftware | - | Das Scripps Forschungsinstitut |
| Dextran Sulfatnatrium (DSS) | Chemikalie zur Auslösung von Kolitis bei Mäusen | 9011-18-1 | Sigma-Aldrich |
| Dibai-Einlaufflüssigkeit (DBE) | Kräutermischung zur Behandlung von Colitis ulcerosa | - | Pekinger Universität für Chinesische Medizin |
| DMEM (Dulbeccos modifizierter Eagle Medium) | Zellkulturmedium | 11965-092 | Thermo Fisher |
| Fetales Rinderserum (FBS) | Nahrungsergänzungsmittel für Zellkultur | 16000-044 | Thermo Fisher |
| Fluoreszenzmikroskop | Instrument zur Immunfluoreszenzbildgebung | - | Olympus |
| LC-MS/MS-System | Massenspektrometer für LC-MS-Analyse | - | Waters Corporation |
| Lipopolysaccharid (LPS) | Auslöser der Entzündung in der Zellkultur | L2630 | Sigma-Aldrich |
| PCR-Wärmezyklus | Ausrüstung für qPCR | T100 | Bio-Rad |
| Primärer Antikörper (S100) | Antikörper zur S100-Proteindetektion | ABC1234 | Abcam |
| Protein-Assay Kit (BCA) | Proteinquantifizierungs-Kit | 23225 | Thermo Fisher |
| Rekombinantes Interferon- (IFN) | Zytokin zur EGC-Aktivierung in der Zellkultur | - | Sigma-Aldrich |
| Sekundärer Antikörper (HRP-konjugiert) | Sekundärer Antikörper für die Immunhistochemie | XYZ5678 | Thermo Fisher |
| Sulfazalazin (SASP) | Positive Kontrolle bei Colitis ulcerosa | - | Sigma-Aldrich |
| Western blot Ausrüstung | Elektrophoresesystem zur Proteinanalyse | - | Bio-Rad |
Referenzen
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