Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Automatisierung der posttranslationalen Analyse einzelzelliger Histon-Modifikationen unter Verwendung einer isotopischen Zweiplex-Markierungsstrategie und der ArgC-Verdauung. Dieser Workflow ermöglicht quantitative, reproduzierbare und hochsensible Profilierung der Chromatinheterogenität und epigenetischen Antworten bei Einzelzellauflösung.

Abstract

Histon-posttranslationale Modifikationen (hPTMs) sind zentrale Regulatoren der Chromatinorganisation und Genexpression. Ihre Dysregulation ist mit Entwicklung, Krebs und Alterung verbunden. Obwohl Massenspektrometrie die bevorzugte Methode zur Untersuchung von hPTMs ist, sind die meisten Protokolle für Massenproben konzipiert und können die Zell-zu-Zell-Variabilität nicht auflösen. Die Erweiterung der Histon-PTM-Analyse auf Einzelzellniveau ist daher essenziell, aber technisch anspruchsvoll, da Histone gering in der Häufigkeit, Lysinreich und stark modifiziert sind.

Hier beschreiben wir einen automatisierten Single-Cell-Proteomik-Workflow für die Histon-PTM-Analyse mittels Nano-Flüssigkeitshandhabung. Das System ermöglicht eine nanoliter-basierte Verarbeitung einzelner Zellen mit minimaler Handhabung und hoher Reproduzierbarkeit. Der Arbeitsablauf beinhaltet die Verdauung mit ArgC Ultra-Protease, die an Arginin-Resten spaltet und die üblicherweise in der Histonproteomik erforderlichen Lysin-blockierenden Derivatisierungsschritte vermieden. Um einen quantitativen Vergleich zwischen den Bedingungen zu ermöglichen, wenden wir eine Zwei-Plex-Markierungsstrategie mit propionischem Anhydrid und seinem deuteraten Analogon propionanhydrid-d10 an. Diese Kombination aus automatisierter Probenvorbereitung, Isotopenmultiplexing und ArgC-Ultra-Verdauung führt zu einem schlanken und sensiblen Protokoll für die PTM-Analyse einzelzelliger Histon.

Die Methode ermöglicht die Untersuchung der Chromatinheterogenität und der Auswirkungen epigenetischer Störungen bei Einzelzellauflösung. Um den Arbeitsablauf zu demonstrieren, erzeugten wir Sphäroide aus HepG2/C3A-hepatozellulären Karzinomzellen und behandelten sie mit Natriumbutyrat, einem Histondeacetylaseinhibitor, der Hyperacetylierung induziert.

Introduction

Histone sind die Proteinbestandteile der Nukleosomen, die sich wiederholenden Einheiten des Chromatins. Ihre N-terminalen Schwänze sind reich an Lysin- und Argininresten und werden stark durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Acetylierung, Methylierung und Phosphorylierung reguliert. Diese Modifikationen beeinflussen die Zugänglichkeit der DNA und steuern damit Prozesse, einschließlich Transkription, Replikation und Reparatur. Veränderte Histon-PTM-Muster sind stark mit Krankheitszuständen verbunden, von Krebs über Neurodegeneration bis hin zum^{Altern 1,2}. Aus diesem Grund ist die Histon-PTM-Analyse in der Epigenetik- und Proteomikforschung von großem Interesse geworden. Massenspektrometrie (MS) bietet standortspezifische und quantitative Analysen von Histonmodifikationen, aber Histone stellen besondere analytische Herausforderungen dar. Ihre Aminosäurezusammensetzung, mehrere Modifikationsstellen und komplexen kombinatorischen Muster machen sie schwerer zu analysieren als typische Proteine. Etablierte Protokolle basieren auf chemischer Derivatisierung, um Lysinreste vor der Verdauung zu blockieren, wodurch die Peptidgewinnung und chromatografische Leistung^{verbessert werden}. Obwohl sie in Massenanalysen effektiv sind, können diese mehrstufigen Derivatisierungsprotokolle Verluste verursachen, die für Einzelzelleingaben problematisch sind. Die Einzelzellanalyse wird zunehmend wichtig, da biologische Systeme von Natur aus heterogen sind. Bulk-Histon analysieren durchschnittliche Signale über viele Zellen hinweg und können diese Variabilität daher nicht erfassen. Subpopulationen von Zellen können sich in ihren Chromatinzuständen unterscheiden, und diese Unterschiede können die Entwicklung, die zelluläre Umprogrammierung oder die Medikamentenreaktionen ^4,5 antreiben.

Hier stellen wir eine automatisierte Probenvorbereitungsmethode für die multiplexierte Einzelzell-Histon-PTM-Analyse (sc-hPTM2) vor. Diese Methode basiert auf dem CellenONE-System, das eine präzise Abgabe einzelner Zellen und nanolitergroßer Reagenzien automatisiert ermöglicht. Diese Methode ist eine Variante der nanoproteomischen Probenvorbereitung (nPOP), die erstmals die Verwendung der Tröpfchenpräparation auf einem^{Glasobjektträger 6} einführte. Die nPOP-Plattform verfügt über fortschrittliche automatisierte Einzelzell-Proteomik, doch ihr standardmäßiges tryptisches Verdauungsprotokoll ist aufgrund ihres hohen Lysingehalts und der umfangreichen Modifikationsdichte für Histone suboptimal. Hier passten wir das CellenONE-System an, um die Goldstandard-Histonderivatisierung mit propionensäurehaltigem Anhydrid zu integrieren, und führten eine isotopische Markierung ein, die eine genaue und umfassende Quantifizierung von Histon-posttranslationalen Modifikationen bei Einzelzellauflösung ermöglicht. Konkret vereinfachen wir das Protokoll, indem wir ArgC Ultra-Protease für die Proteinverdauung verwenden. Im Gegensatz zu Trypsin spaltet ArgC nur an Argininresten und benötigt keine Lysinblockierung. Dadurch entfällt eine zweistufige Derivatisierungsstrategie und wird das Protokoll vereinfacht. Zusätzlich beinhaltet die Methode ein Zweiplex-Isotopen-Markierungsschema mit propionischem Anhydrid und propionischem Anhydrid-d10, wodurch zwei Zellen gleichzeitig analysiert werden können ^7,3. Nach der Verdauung und Markierung werden Einzelzellproben mit Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)/MS mittels datenunabhängiger Erfassung (DIA) gewonnen und analysiert. In unseren Händen wurde gezeigt, dass diese Methode sowohl die Empfindlichkeit als auch die Reproduzierbarkeit bei der Quantifizierung von Histon-PTMs im Vergleich zur vorherigen Version dieser^{Methode 8} erhöht.

Um die Methode zu demonstrieren, analysierten wir die Dynamik einzelzelliger Histon-PTM in Sphäroiden, die von HepG2/C3A-hepatozellulären Karzinomzellen abgeleitet wurden. Wir behandelten diese Sphäroide mit Natriumbutyrat, einem gut charakterisierten Histondeacetylasehemmer, der die Histonacetylierung erhöht und als Maßstab für die Chromatinregulation ^9,10 dient. Durch den Vergleich von Kontroll- und Natriumbutyrat-behandelten Sphäroiden bei Einzelzellauflösung demonstrieren wir einen Prinzipiennachweis repräsentativer Ergebnisse und heben das Potenzial für breitere Anwendungen in der Chromatinbiologie und Krebsepigenetik hervor. Bemerkenswert ist für das Protokoll eine frühere Veröffentlichung, die Wachstum und Behandlung von 3D-Sphäroiden¹⁰, Aufnahme von Histonpeptiden in Massenspektrometrie¹¹ und Datenanalyse mit der Software EpiProfile¹² beschreibt.

Protocol

1. Puffer und Reagenzien

1. Zellwachstumsmedien für HepG2/C3A-Zellen: Bereite Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM, 4,5 g/L Glukose) her, das 10 % fetales Rinderserum (FBS), nicht-essentielle Aminosäuren (1 % v/v), L-Glutamin (1 % v/v) und Penicillin/Streptomycin (0,5 % v/v) enthält. Wachstumsmedium wird bei 4 °C gelagert.
2. Hauptmischung: Bereite ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n -Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM) 0,03 %, Dithiothreitol (DTT) 10 mM in LC-MS-Wasser vor.
3. HA-Lösung: 1 % (v/v) Hydroxylamin in LC-MS-haltigem Wasser bereiten.
4. Waschlösung: 10 ml einer 50:50 Acetonitril/Wasser-Mischung mit 0,1 % (w/w) Ameisensäure (alle LC-MS-Qualität) zubereiten.
5. Mobile Phase A (MPA) – 0,1 % Ameisensäure: Fügen Sie 1 ml konzentrierte Ameisensäure zu 999 ml HPLC-haltigem Wasser hinzu und mischen Sie gut.
6. Mobile Phase B (MPB) – 80 % HPLC-Qualitätsacetonitril + 0,1 % Ameisensäure: Fügen Sie 800 ml HPLC-Qualitätsacetonitril zu 199 ml HPLC-Qualitätswasser hinzu. Als Nächstes 1 ml konzentrierte Ameisensäure zu dieser Lösung geben und mischen.

2. Präparation von Sphäroiden

1. Für die Präparation der Sphäroide siehe Stransky S et ^al.11.
2. HepG2/C3A hepatozelluläre Karzinomzellen werden 5–7 Tage lang in einem rotierenden dreidimensionalen (3D) Bioreaktor kultiviert, um die gleichmäßige Sphäroidbildung zu fördern, bis ein Durchmesser von ~400–600 μm erreicht wird. Verwenden Sie DMEM ergänzt mit 10 % FBS, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % L-Glutamin und 0,5 % Penicillin/Streptomycin. Halten Sie die Sphäroide bis zur Behandlung bei 37 °C und 5 %_CO2 .
   HINWEIS: Abbildung 1A zeigt die Ausrüstung, die zur Herstellung der Sphäroide im Referenzpapier verwendet wurde.

3. Zellkultur und Behandlung

1. Geben Sie ~10 Sphäroide in eine Gewebekultur-Platte mit 6 Wellen und enthält 2 ml Wachstumsmedium.
2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igen CO2-Brutkasten.
3. Behandeln Sie die Sphäroide 24 Stunden lang mit 5 mM Natriumbutyrat oder fügen Sie für die Kontrolle das gleiche Volumen Wasser hinzu (Abbildung 1B).

4. Zellisolierung und Herstellung einer Einzelzell-Suspension

1. Nach 24 Stunden Behandlung werden die Zellen mit 1 ml TrypLE bei 37 °C für 3–5 Minuten inkubiert.
2. Sanft auf und ab pipetieren, bis das Sphäroid zerfällt und einzelne Zellen entstehen.
3. Sammeln Sie die Zellen in einem 15-mL-Rohr und waschen, verdünnen Sie bis zu 10 ml mit eiskaltem 1x PBS, zentrifugieren Sie bei 500 g für 5 Minuten bei 4 °C und aspirieren Sie das Supernatant.
4. Die Zellen in 1 ml eiskaltes 1x PBS wieder suspendieren und Sytox Dead-Cell-Farbstoff mit einer Endkonzentration von 1 μM hinzufügen.
5. Inkubiere die Zelle mit Sytox Green für 20 Minuten auf Eis in einer dunklen Umgebung.
6. Waschen Sie die Zelle mit 10 ml eiskaltem 1x PBS, zentrifugieren Sie bei 500 g für 5 Minuten bei 4 °C und aspirieren Sie das Supernatant.
7. Suspendieren Sie die Zellen in 1 ml eiskalten 1x PBS und fügen Sie Paraformaldehyd (PFA) mit einer Endkonzentration von 0,5 % hinzu.
8. Inkubiere die Zelle mit PFA für 15 Minuten auf Eis.
   HINWEIS: Obwohl Sytox grün typischerweise aufgrund der Membranpermeabilisierung mit der Fixierung nicht kompatibel ist, haben wir bei Zellen getestet, dass der Anteil der Sytox-grünen Zellen bis zu 8 Stunden nach der Fixierung gleich bleibt, ohne Anzeichen von Histonproteinlecks.
9. Waschen Sie die Zelle mit 10 ml eiskaltem 1x PBS, zentrifugieren Sie bei 500 g für 5 Minuten bei 4 °C und aspirieren Sie das Supernatant.
10. Die Zellen werden mit einer Endkonzentration von 200–500 Zellen/μL rekonstituiert.
    HINWEIS: Für kleine Zellen, die sich nicht ablagern, wird eine Konzentration von 500 Zellen/μL empfohlen, während für große Zellen, die sich ablagern, eine Konzentration von 200 Zellen/μL empfohlen wird. Wenn die Zellsuspension anfällig für Aggregation ist, führen Sie sie vor der Aspiration durch ein 40-μm-Sieb, um Verstopfungen der Düse zu vermeiden. Wenn Zellen größer als 40 μm interessant sind und wahrscheinlich in einer Probe vorhanden sind, kann stattdessen ein 70-μm-Sieb verwendet werden, um sehr große Aggregate zu entfernen.
11. Lagern Sie die Zellen auf Eis, bis sie zum Sortieren in das Instrument geladen werden.

5. Softwareverbindung und Systeminitialisierung

1. Schalten Sie das cellenONE-System ein (Abbildung 2A), starten Sie den Steuercomputer, starten Sie die Software und öffnen Sie den Benutzerarbeitsbereich v2.0-nPOP2 ; alle erforderlichen Felddateien und Laufvorlagen für nPOP sind dort vorinstalliert.
2. Stellen Sie sicher, dass der Kühler des Instruments eingeschaltet ist, und stellen Sie dann den Taupunkt-Chase-Wert entsprechend der aktuell vom Gerät gemeldeten Innentemperatur ein.
3. Bereiten Sie das System mit PDC-70, Beschichtungstyp 2 Dosierdüsen (Abbildung 2B), die in den Steckplätzen 1 und 3 installiert sind, entsprechend den Anweisungen auf dem Bildschirm.
4. Stellen Sie die Pulsbreite und die Antriebsspannung jeder Düse auf die auf der Verpackung des Herstellers angegebenen Werte ein.
   HINWEIS: Die Verwendung zweier separater Düsen bewahrt die Konsistenz der Dosierung: Eine liefert die Zellsuspension, die andere die Reagenzien, sodass eventuelle an der Düse haftender Schmutz die nachfolgenden Tropfen nicht beeinträchtigen. Der Einsatz beider Düsen während des letzten Entnahmeschritts beschleunigt zudem die Probenentnahme.
   1. (KRITISCHER SCHRITT) Für maximale Aufnahmeeffizienz sollte der Z-Versatz zwischen den beiden Düsen um <50 μm variieren. Bestimmen Sie dies, indem Sie die optimale Kontaktposition für jede Düse definieren und die Z-Höhenanzeigen im Tab Düseneinrichtung vergleichen.
5. Füllen Sie das Luftbefeuchterreservoir mit deionisiertem Wasser bis zur angegebenen Füllleitung.

6. Vorlaufkonfiguration am Flüssigkeitsbehandler

1. Wählen Sie die Anzahl der Glasobjektträger (Abbildung 2C) aus, die vorbereitet werden sollen. Diese Wahl definiert direkt die Gesamtzahl der zu analysierenden Zellen.
2. Für ein 2-Plex-Multiplexing-Schema (Abbildung 3A) laden Sie eine einzelne Folie mit 320 Zellen.

7. Verteilung eines Dimethylsulfoxid-(DMSO)-"Grabens" um die Schlittenkanten

HINWEIS: Abbildung 3B stellt die Schritte zur Vorbereitung der Proben im cellenONE dar, beginnend mit dem DMSO-Graben. Als zusätzliche Kontrolle gegen Tröpfchenverdunstung wird DMSO entlang der Ränder der Objektträger verteilt.

1. Im Haupt-Tab wählen Sie den Lauf zum 0_Dispense_DMSO_Moat aus.
2. Gehe zum Reiter Ziel-Einrichtung , lade die Datei DMSO_Moat.fld aus dem entsprechenden Scheme-Ordner und setze die Anzahl der Felder auf Y, entsprechend der Anzahl der geplanten Folien.
3. Aliquot 150 μL LC-MS-Grade DMSO in ein neues PCR-Rohr und platzieren Sie es in Position 2 der CellenWASH-Station, wobei die Röhrenkappe zur Instrumententür zeigt.
4. Öffne den Reiter Ausführen und klicke auf Start Run. Das System aspiriert 10 μL DMSO und pausiert, um die Stabilität des Tröpfchens zu bestätigen. Drei Autodrop-Testtropfen abfeuern (Abbildung 4A); wenn alle drei perfekt geformt sind, klicken Sie auf Weiterführen.
5. Nach der Dosierung werden die Düsen automatisch gespült, und das Instrument erfasst Bilder über alle Folien zur Qualitätskontrolle. Überprüfen Sie die Bilder, um auf jeder Folie einen einheitlichen DMSO-Tropfen zu überprüfen und auf fehlende oder abweichende Tropfen zu prüfen (Abbildung 4B).

8. DMSO-Abgabe

1. Im Haupt-Tab wählen Sie den Lauf zum 1_Dispense_DMSO aus.
2. Öffnen Sie den Reiter Zieleinrichtung , importieren Sie die Felddatei DMSO.fld (Abbildung 4C) aus dem entsprechenden Scheme-Verzeichnis und setzen Sie die Anzahl der Felder auf Y, entsprechend der Folienanzahl, die Sie bearbeiten möchten.
3. Aliquot 150 μL LC-MS-Grade DMSO in ein neues PCR-Rohr und platzieren Sie es in Position 2 der CellenWASH-Station, wobei die Röhrenkappe zur Instrumententür zeigt.
4. Öffne den Reiter Ausführen und klicke auf Start Run. Das System aspiriert 10 μL DMSO und pausiert, um die Stabilität des Tröpfchens zu bestätigen. Drei Autodrop-Testtropfen abfeuern; wenn alle drei perfekt geformt sind, klicken Sie auf Weiterführen.
5. Beim Dosieren der Oberflächen spült die Software automatisch die Düsen und erfasst Bilder auf jedem Dia zur Qualitätssicherung. Überprüfen Sie die Bilder, um auf jeder Folie einen einheitlichen DMSO-Tropfen zu überprüfen und auf fehlende oder nicht im Ziel liegende Tropfen zu prüfen.

9. Zellausgabe

1. Im Haupt-Tab wählen Sie den Lauf zum 2_Dispense_Cells aus.
2. Im Tab Ziel-Einrichtung öffnen Sie den Unterordner Cells Field Files des gewählten Multiplexing-Schema-Verzeichnisses.
3. Da das Experiment zwei Bedingungen beinhaltet, wählen Sie die Felddatei, die mit der Stichprobe übereinstimmt, die gleich sortiert werden soll – entweder CellType_A.fld oder CellType_B.fld.
4. Nachdem die Datei geladen ist, setze die Anzahl der Felder auf Y, sodass die Gesamtzahl der Folien für diesen Durchlauf entspricht.
5. Entgasen Sie die Zellsuspension aus Schritt 4.11 mit einer Vakuumpumpe für 10 Minuten auf Eis.
6. Übertragen Sie 150 μL der vorbereiteten Zellsuspension in ein sauberes CellenVIAL und platzieren Sie das Fläschchen dann in Schlitz 1 des CellenWASH-Karussells, wobei die Kappe zur Instrumententür zeigt.
7. Gehe zum Tab Düseneinrichtung > Do Task und führe Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 aus, um die Probe aus dem Fläschchen zu aspirieren.
8. Während Sie im Tab "Düseneinrichtung " bleiben, starten Sie den Zell-Dispensing-Viewer (Abbildung 5A) und führen die Mapping-Routine aus, um die Auswurfzone und die Gate-Objekte basierend auf Größe und Verlängerung zu definieren. Die in Abbildung 5A gezeigten Einzelzell-Isolationsparameter entsprechen den genauen Einstellungen, die zur Dosierung von HepG2/C3A-Zellen verwendet werden, die von Sphäroiden dissoziiert sind.
9. Dann aktivieren Sie den Fluoreszenzmodus, indem Sie T > F auswählen. Stelle den Auswahlmodus auf negativ. Erhöhen Sie den Bereich der Isolationsparameter für Größe und Intensität vom Minimum auf das Maximum, um sicherzustellen, dass keine toten Zellen isoliert werden.
10. Überprüfe mit den Mapping-Parametern, öffne den Reiter Ausführen und klicke auf Start Run, dann folge dann den Softwareanweisungen. Wenn die Dosierung endet, spült das Instrument automatisch die Düsen und nimmt Objektträgerbilder auf, um die Platzierung und Gleichmäßigkeit der Tröpfchen zu überprüfen.
    HINWEIS: Während der Zellsortierung werden Bilder jeder einzelnen Zelle aufgenommen, die während des Laufs isoliert wird (Abbildung 5B).
11. Nachdem die Zellsortierung abgeschlossen ist, schließen Sie das Ausgabefenster.
12. Lassen Sie die übrig gebliebene Zellsuspension auf Eis, bis Abschnitt 9 vorbei ist; Der Überschuss kann später für Massenproben, den Aufbau empirischer Bibliotheken oder zusätzliche Validierungsstudien verwendet werden.

10. Verdauungs-Master-Mix-Dosierung

1. Im Haupt-Tab wählen Sie den Lauf zum 2_Dispense_Digest_10ulPickup aus.
2. Öffnen Sie den Reiter Ziel-Einrichtung , laden Sie Digest.fld aus dem entsprechenden Multiplexing-Scheme-Ordner und setzen Sie die Anzahl der Felder auf Y, sodass es der Anzahl der Folien für diesen Durchlauf entspricht.
3. Bereite eine frische Verdauungs-Mastermischung vor und entfette die Lösung mit einer Vakuumpumpe für 10 Minuten auf Eis (Mastermischung: ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, DDM 0,03 %, DTT 10 mM in LC-MS-Wasser).
4. Pipette 20 μL des Master-Mischs zu einer 384-Well-Platte und platziere die Platte in das X1-System.
5. Im Reiter "Ausführen " klicke auf Start Run und folge den Anweisungen. Nachdem das System das Reagenz abgesaugt hat, überprüfen Sie die Stabilität des Tröpfchens, wenn Sie darauf aufgefordert werden.
6. Beim Dosieren spült das Instrument automatisch die Düsen und fotografiert jeden Schlitten; Überprüfen Sie die Bilder, um sicherzustellen, dass jeder Tropfen die Verdauungsmischung gleichmäßig erhalten hat.
7. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht zur Verdauung und halten Sie die angegebenen Feuchtigkeits- und Taupunkteinstellungen bei. Jeder Tropfen enthält ~13,5 nL Verdauungsmischung. Führen Sie die Verdauung über Nacht bei ~75 % relativer Luftfeuchtigkeit durch, wobei der Taupunkt 1–2 °C unter der Kammertemperatur gehalten wird, um eine Verdunstung der Tröpfchen zu verhindern.

11. Inkubation über Nacht

1. Im Haupt-Tab wählen Sie den Lauf zum 4_Incubation_16h.
2. Wechsle zum Reiter Ausführen , klicke auf Start Run.
   HINWEIS: Die Instrumente machen alle 30 Minuten Fotos von den Objektträgern, um den Zustand der Tröpfchen zu überwachen. Wenn sie während der Brutzeit austrocknen oder anschwellen, passen Sie die Taupunkteinstellung bei Bedarf an.
3. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, erscheint eine Nachricht, dass die Inkubation abgeschlossen ist.
   HINWEIS: Schnelle Verdautung (≤4 H) kann mit höher wirksamen Bedingungen zwischen Enzym und Substrat möglich sein; Dies wurde hier nicht bewertet, daher bleibt die validierte Bedingung 16 Stunden.

12. Verdunstung

HINWEIS: Bevor Sie mit dem Etikettierungsschritt übergehen, wird empfohlen, den Zustand der Tröpfchen zu überprüfen, um sicherzustellen, dass sie nicht zu stark mit Wasser geschwollen sind, da Wasser die Effizienz der Kennzeichnung beeinträchtigen könnte. Zu diesem Zweck wird die Verdunstungsphase empfohlen.

1. Im Haupt-Tab wählen Sie den Lauf aus, den Sie 5_Evaporation möchten.
2. Gehe zu Datei, Kühleinheitssteuerung und stelle unter der Taupunktsteuerung die feste Steuertemperatur auf 23 °C ein.
3. Wechsle zum Reiter Ausführen , klicke auf Start Run. Das Trocknen dauert 5 Minuten, und die Instrumente machen nach dem Trocknen automatisch Bilder der Objektträger.
4. Inspizieren Sie die Bilder; Wenn die Tröpfchen ausreichend trocken sind, stoppen Sie den Lauf. Wenn nicht, klicken Sie auf Weitermachen und weitere 5 Minuten trocknen (Abbildung 6A).
5. Am Ende des Laufs wechselst du zurück zum vorherigen Dew Point Control.

13. Etiketten geben ab

1. Im Haupt-Tab wählen Sie den Lauf aus, den Sie 6_Dispense_PA_Labels möchten.
2. Gehe zum Reiter Ziel-Einrichtung , lade die Datei Labels.fld aus dem entsprechenden Scheme-Ordner und setze die Anzahl der Felder auf Y, entsprechend der Anzahl der geplanten Folien.
3. Aliquot 150 μL LC-MS-Qualitäts-DMSO in Slot 2 der CellenWASH-Station.
4. Bereiten Sie eine Lagerlösung der beiden Etikettenbestände für die multiplexierte Histonderivation vor: 25 % (v/v) Propionanhydrid in DMSO und 25 % (v/v) propionanhydrid-d₁₀ in DMSO.
   HINWEIS: Entgasen Sie beide Lösungen, bevor Sie sie auf die Platte übertragen, um die Blasenbildung zu minimieren.
5. Geben Sie 20 μL jedes Beschriftungsreagens in die vorgesehenen Bohrlöcher einer 384-Well-Platte und platzieren Sie die Platte in das X1-System. Jeder Tropfen erhält ~10 nL Markierungsreagenz (25 % Propionanhydrid oder 25 % Propionanhydrid-D₁₀ in DMSO).
6. Wechsle zum Reiter Ausführen , klicke auf Start Run und folge den Anweisungen.
7. Lassen Sie die Etiketten 1 Stunde auf dem Schieben reagieren.
8. Nach dem Abgeben spült das Instrument automatisch die Düsen und fotografiert jeden Schlitten. Überprüfen Sie die Bilder, um eine gleichmäßige Verteilung und die korrekte Platzierung der Tröpfchen auf allen Objektträgern zu bestätigen.

14. HA-Abgabe

1. Bereiten Sie die HA-Lösung vor und entmagnetisieren Sie sie vor der Benutzung.
2. Lade das Fläschchen ein. Pipettieren Sie 150 μL der HA-Lösung in eine saubere PCR-Röhre, positionieren Sie sie in CellenWASH-Schlitz 2 und richten Sie die Kappe auf die Instrumententür.
3. Wählen Sie das Laufprofil aus. Im Haupt-Tab wählen Sie 7_Dispense_Quench.
4. Konfigurieren Sie die Felddatei. Öffne den Reiter Ziel-Einrichtung , lade HA.fld aus dem entsprechenden Multiplexing-Schema-Ordner und setze die Anzahl der Felder auf Y, sodass es der Gesamtzahl der Folien entspricht.
5. Fang den Lauf an. Navigiere zu Run, klicke auf Start Run und folge den Anweisungen auf dem Bildschirm.
6. Inkubieren. Lass das HA auf den Folien 30 Minuten lang reagieren.
7. Überprüfen Sie die Abgabe. Nach Abschluss spült das System die Düsen und nimmt Bilder jeder Objektträger auf – überprüfen Sie diese Bilder, um die gleichmäßige Platzierung und das Volumen der Tröpfchen zu bestätigen.

15. Probenabholung

1. Bereite die Waschlösung im WashTray XL vor.
2. Richte die Sammelplatte auf. Gib 2 μL 0,01 % (w/w) DDM in LC-MS-Qualitätswasser in jeden Brunnen einer frischen 384-Well-Platte und platziere die Platte in den Flüssigkeitsbehälter.
3. Wähle die Abholstrecke. Im Haupt-Tab wählen Sie das Profil 8_Pickup_2plex.
4. Lade die Felddatei. Öffnen Sie den Reiter Ziel-Einrichtung, importieren Sie Pick-up.fld aus dem korrekten Multiplexing-Scheme-Verzeichnis und setzen Sie die Anzahl der Felder auf Y, sodass die Anzahl der Folien übereinstimmt.
5. Führe den Lauf aus. Wechsle zum Reiter Ausführen , klicke auf Start Run und folge den Anweisungen. Das Instrument sammelt jeden Tropfen, spült die Düsen und bildet Bilder der Objektträger zur Überprüfung ab, um sicherzustellen, dass alle Probe entnommen wurden.

16. Nachabholung

1. Versiegeln Sie die 384-Bohrloch-Platte mit Klebefolie und zentrifugieren Sie kurz, um Tröpfchen an den Boden der Brunnen zu bringen.
2. Entfernen Sie die Folie und trocknen Sie die Proben bei niedriger Hitze in einem Vakuumkonzentrator.
3. Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie und lagern Sie die getrocknete Platte bei -80 °C, bis sie für die LC-MS/MS-Analyse bereit ist.

17. Vorbereitung von Massenproben

1. Mit der übrig gebliebenen Suspension aus Abschnitt 9 wird die Zellen durchgeschleudert und in 1x PBS erneut suspendiert, um eine Konzentration von 2.000 Zellen/μL zu erhalten. Dies sollte nach Abschluss von Abschnitt 10 erfolgen.
2. Thermische Lyse: Die restliche Suspension 10 Minuten bei -80 °C einfrieren, dann 10 Minuten mit einem Hitzeschock bei 90 °C.
3. Lass das Rohr wieder auf Zimmertemperatur abkühlen.
4. Übertragen Sie 25 μL des Lysats in ein PCR-Rohr und fügen Sie 5 μL der zuvor vorbereiteten Verdauungsmischung hinzu.
5. Über Nacht (≈ 16 H) bei 37 °C in einem Thermozyklus bebrüten.
6. Light-label-Derivatisation: 5 μL eines frischen 25%igen (v/v) Light Labels in Acetonitril geben und 1 Stunde inkubieren.
7. Reaktionsabschreckung: 5 μL 1% (w/w) Hydroxylamin (HA)-Lösung hinzufügen und 30 Minuten inkubieren.
8. Trocknen Sie die Probe in einem Vakuumkonzentrator, der auf niedrige Hitze eingestellt ist, und lagern Sie sie dann bei -80 °C, bis sie für LC-MS/MS bereit ist.

18. LC/MS-Einrichtung und Datenerfassung

HINWEIS: Um die Daten für dieses Manuskript zu sammeln, wird ein LC-MS\MS-System mit einer Ion Optics 75 μm ID x 25 cm x 1,7 μm analytischen Säule eingerichtet.

1. Bereiten Sie die mobilen Phasen auf dem HPLC vor:
   Mobile Phase A (MPA): 0,1 % Ameisensäure in HPLC-haltigem Wasser
   Mobile Phase B (MPB): 0,1 % Ameisensäure in HPLC-Qualitätsacetonitril
2. Programmieren Sie die HPLC-Methode für einen aktiven Gradienten von 30 Minuten: 5–23 % MPB in 25,7 Minuten, 23–35 % MPB in 2,6 Minuten und 35–45 % MPB in 1,7 Minuten bei einer Durchflussrate von 200 nL/min. Programmieren Sie den Autosampler so, dass er die Probe bei 0,1 % FA + 0,01 % DDM für die 'trockene' Aufnahme wieder suspendiert.
3. Richten Sie die MS-Erfassungsmethode ein, um datenunabhängige Erfassung (DIA) durchzuführen:
   HINWEIS: Diese Einstellungen sind speziell für eine Thermo Exploris 480 mit FAIMS Pro Duo und können je nach Instrument variieren. Es wird empfohlen, solche zu verwenden, die für die DIA-Einzelzell-Proteomik mit ähnlichen m/z-Bereichen wie unten beschrieben üblich sind.
   1. Stellen Sie den MS auf einen vollständigen Scan von 300–1100 m/z mit einer Auflösung von 120.000 m, AGC-Ziel von 300 %, maximale Einspritzzeit von 246 ms und FAIMS CV von -50 V ein.
   2. Stellen Sie das MS/MS auf einen DIA-Scan von 300–1100 m/z mit einer Auflösung von 60.000, einem Isolationsfenster von 50 m/z, HCD-Kollisionsenergie von 27 %, der ersten Masse von 120 m/z, AGC-Ziel von 1000 %, maximaler Einspritzzeit von 118 ms und einer FIMIS-CV von -50 V ein.
4. Entferne die Foliendichtung von der 384-Loch-Platte, die die Einzelzellen enthält. Die Bulkprobe wird mit 100 Zellen/μL in 0,1 % FA + 0,01 % DDM rekonstituiert und 10 μL in einen leeren Brunnen wie P24 übertragen. Dann versiegeln Sie die Platte mit einer durchstichbaren Gummimatte und laden sie in den Autosampler.
5. Warteschlangenläufe: Zuerst die Bulk-Samples und dann die Sets von Einzelzellen ausführen.

19. Datenanalyse

1. Führe die Rohdaten mit EpiProfile2.1 aus, um das Ergebnis mit den Peptidoform-Abundanzen für die mit propionensäurehaltigen Anhydrid gekennzeichneten Zellen zu erhalten.
   HINWEIS: Proben müssen auf einem Thermo-Instrument aufgenommen werden, um EpiProfile 2.1 für die Datenverarbeitung nutzen zu können. Diese Software extrahiert etwa 250 Peptidoformen mit ihrer kanonischen Version, ist aber je nach Organismus, zusätzlichen interessanten Modifikationen, Mutationen usw. editierbar.
2. Führe die Rohdaten mit EpiProfile2.1_D5 aus, um das Ergebnis mit den Peptidoform-Häufigkeiten für die mit propionischen Anhydrid-d10 gekennzeichneten Zellen zu erhalten.
3. Führen Sie das Mapping durch und verknüpfen die Metadaten mit den Epiprofile-Ausgaben mit dem quantQC-Programm.
4. Filtere fehlgeschlagene Proben heraus, indem du sie mit den Rohlings vergleichst.
5. Filtern Sie Peptidoformen heraus, die nicht in mindestens 50 % der Proben vorhanden sind.
6. Peptidoformen filtern Sie heraus, deren Signal der Einzelzellintensität nicht größer als das 150%-Signal in Blanks ist.
7. Erhalten Sie die Ergebnistabelle (Abbildung 7A) und verarbeiten Sie die Daten bei Bedarf weiter.

Results

Um die Anwendung unseres Single-Cell-Histon-Proteomik-Workflows mit unserem System zu demonstrieren, analysierten wir Sphäroide von HepG2/C3A-Zellen, die mit 5 mM Natriumbutyrat behandelt wurden, für 24 Stunden. Nach der LC-MS/MS-Erfassung wurden die Rohdaten mit EpiProfile sowohl für leichte (propionische Anhydrid) als auch für schwere (propionisches Anhydrid-d10) Labeling verarbeitet, wodurch normalisierte Daten erhalten wurden, die die Häufigkeit der Peptide und Histonmarkierungen darstellen. Das QuantQC R-Paket wurde...

Discussion

Die Fähigkeit, posttranslationale Histonmodifikationen auf Einzelzellebene zu messen, stellt einen entscheidenden Schritt zum Verständnis der wahren Heterogenität der Chromatinregulation dar. Traditionelle Bulk-Methoden haben unschätzbare Einblicke in die durchschnittliche Verteilung von hPTMs über Gewebe hinweg geliefert, verbergen jedoch die Zell-zu-Zell-Variabilität, die zunehmend als biologisch bedeutsam anerkannt^wird. Einzellige proteomische Ansätze ermöglich...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5-mL Mikrozentrifugenröhren	Bio-Rad	2239480
1000 & Mikro; L-breite Pipetspitzen	Fisher Scientific	14222703
200 & Mikro; L-breite Pipetspitzen	Fisher Scientific	14222730
384 Brunnen PCR-Platte Lo Bind	Eppendorf	30129547
96-Bohrloch-Vakuumkrümmer	Millipore	MAVM0960R
Acetonitril, Optima LC-MS/MS-Qualität.	Fisher Scientific	A955-1
Klebeweise PCR-Plattenfolien	Thermo Fisher	AB0626
Wasserfreies Acetonitril	Fisher Scientific	AA42311AK	Etiketten-Lösung für Großpackungen lagert
Arg-C Ultra, Mass-Spec-Qualität	Promega	VA1831
Zellkulturqualitätswasser	Corning	25-055-CV
CellenVIALs	SCIENION	/	Die Katalognummer enthält ein Zitat
DMSO, Wasserfrei	Thermo Fisher	D12345	Etikettenlagerlösung
DTT	Sigma	D0632-5G
Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM)	Fisher Scientific	MT17205CV
Fetales Rinderserum	Fisher Scientific	MT35010CV
Ameisensäure	Thermo	28905
Ameisensäure 98 %; 100 % für LC-MS LiChropur	Sigma	5330020050
Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
HEPES (Ultra Rein)	Thermo Fisher	11344041
HPLC-Qualitätsacetonitril	Fisher Scientific	A955-4
HPLC-Qualitätswasser	Fisher Scientific	W5-4
Hydroxylaminlösung 50 Wt. % in H2O	Sigma	438227-50ML
L-Glutamin	Fisher Scientific	MT25015CI
n-Dodecyl-beta-Maltosid (DDM) Waschmittel	Fisher Scientific	BN2005
Nicht-essentielle Aminosäuren	Fisher Scientific	MT25025CI
Orbitrap Exploris 480 Massenspektrometer	Thermo Fisher	BRE725539
Paraformaldehyd 16% wässrige Lösung EM-Grade	Elektronenmikroskopiewissenschaften	15710-S
PDC-CM (Typ-2-Beschichtung)	SCIENION	/	Die Katalognummer enthält ein Zitat
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	MT3002CI
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x, pH 7,4, RNase-frei	Thermo Fisher	AM9625
Pierce-Dimethylsulfoxid (DMSO), LC-MS-Qualität.	Thermo Fisher	85190
Pipettenpistole	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Propionanhydrid ≥ 99%	Sigma	240311-50G
Propionanhydrid-d10 ≥ 98 Atom % D, ≥ 99 % (CP)	Sigma	615692-1G
Gekühlte Zentrifuge	Thermo	75-217-420
SciCHIP H1-beschichtete Glasverkleidungen	SCIENION	/	Die Katalognummer enthält ein Zitat
SpeedVac-Vakuumkonzentrator (96-Well-Platten)	Thermo	15308325	Savant SPD1010
Sterile Haube	Thermo	1375
Sterile serologische Pipetten	Fisher Scientific	1367549
SYTOX Green Dead Cell Stain, für die Durchflusszytometrie	Thermo Fisher	S34860
TrypLE Express Enzym (1X), kein rotes Phenol	Thermo Fisher	12604013
Vortex	Sigma	Z258415
Wasserbad	Fisher Scientific	FSGPD10