Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)

Giulia Barotti; Ronald Cutler; Joshua Cantlon; Barbara Montanini; Simone Sidoli

doi:10.3791/69588

Method Article

Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)

DOI:

10.3791/69588

⸱

December 19th, 2025

Giulia Barotti¹ , Ronald Cutler¹ , Joshua Cantlon² , Barbara Montanini³ , Simone Sidoli¹

¹Albert Einstein College of Medicine, ²SCIENION, ³Department of Chemical, Life and Environmental Sustainability Sciences, University of Parma

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Automatisierung der posttranslationalen Analyse einzelzelliger Histon-Modifikationen unter Verwendung einer isotopischen Zweiplex-Markierungsstrategie und der ArgC-Verdauung. Dieser Workflow ermöglicht quantitative, reproduzierbare und hochsensible Profilierung der Chromatinheterogenität und epigenetischen Antworten bei Einzelzellauflösung.

Abstract

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Histon-posttranslationale Modifikationen (hPTMs) sind zentrale Regulatoren der Chromatinorganisation und Genexpression. Ihre Dysregulation ist mit Entwicklung, Krebs und Alterung verbunden. Obwohl Massenspektrometrie die bevorzugte Methode zur Untersuchung von hPTMs ist, sind die meisten Protokolle für Massenproben konzipiert und können die Zell-zu-Zell-Variabilität nicht auflösen. Die Erweiterung der Histon-PTM-Analyse auf Einzelzellniveau ist daher essenziell, aber technisch anspruchsvoll, da Histone gering in der Häufigkeit, Lysinreich und stark modifiziert sind.

Hier beschreiben wir einen automatisierten Single-Cell-Proteomik-Workflow für die Histon-PTM-Analyse mittels Nano-Flüssigkeitshandhabung. Das System ermöglicht eine nanoliter-basierte Verarbeitung einzelner Zellen mit minimaler Handhabung und hoher Reproduzierbarkeit. Der Arbeitsablauf beinhaltet die Verdauung mit ArgC Ultra-Protease, die an Arginin-Resten spaltet und die üblicherweise in der Histonproteomik erforderlichen Lysin-blockierenden Derivatisierungsschritte vermieden. Um einen quantitativen Vergleich zwischen den Bedingungen zu ermöglichen, wenden wir eine Zwei-Plex-Markierungsstrategie mit propionischem Anhydrid und seinem deuteraten Analogon propionanhydrid-d10 an. Diese Kombination aus automatisierter Probenvorbereitung, Isotopenmultiplexing und ArgC-Ultra-Verdauung führt zu einem schlanken und sensiblen Protokoll für die PTM-Analyse einzelzelliger Histon.

Die Methode ermöglicht die Untersuchung der Chromatinheterogenität und der Auswirkungen epigenetischer Störungen bei Einzelzellauflösung. Um den Arbeitsablauf zu demonstrieren, erzeugten wir Sphäroide aus HepG2/C3A-hepatozellulären Karzinomzellen und behandelten sie mit Natriumbutyrat, einem Histondeacetylaseinhibitor, der Hyperacetylierung induziert.

Introduction

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Histone sind die Proteinbestandteile der Nukleosomen, die sich wiederholenden Einheiten des Chromatins. Ihre N-terminalen Schwänze sind reich an Lysin- und Argininresten und werden stark durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Acetylierung, Methylierung und Phosphorylierung reguliert. Diese Modifikationen beeinflussen die Zugänglichkeit der DNA und steuern damit Prozesse, einschließlich Transkription, Replikation und Reparatur. Veränderte Histon-PTM-Muster sind stark mit Krankheitszuständen verbunden, von Krebs über Neurodegeneration bis hin zum^Altern ^1,2. Aus diese....

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Protocol

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1. Puffer und Reagenzien

Zellwachstumsmedien für HepG2/C3A-Zellen: Bereite Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM, 4,5 g/L Glukose) her, das 10 % fetales Rinderserum (FBS), nicht-essentielle Aminosäuren (1 % v/v), L-Glutamin (1 % v/v) und Penicillin/Streptomycin (0,5 % v/v) enthält. Wachstumsmedium wird bei 4 °C gelagert.
Hauptmischung: Bereite ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n -Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM) 0,03 %, Dithiothreitol (DTT) 10 mM in LC-MS-Wasser vor.
HA-Lösung: 1 % (v/v) Hydroxylamin in LC-MS-haltigem Wasser bereiten.
Waschlösung: 10 ml einer 50:50 Acetonitril....

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Results

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Um die Anwendung unseres Single-Cell-Histon-Proteomik-Workflows mit unserem System zu demonstrieren, analysierten wir Sphäroide von HepG2/C3A-Zellen, die mit 5 mM Natriumbutyrat behandelt wurden, für 24 Stunden. Nach der LC-MS/MS-Erfassung wurden die Rohdaten mit EpiProfile sowohl für leichte (propionische Anhydrid) als auch für schwere (propionisches Anhydrid-d10) Labeling verarbeitet, wodurch normalisierte Daten erhalten wurden, die die Häufigkeit der Peptide und Histonmarkierungen dar.......

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Discussion

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Die Fähigkeit, posttranslationale Histonmodifikationen auf Einzelzellebene zu messen, stellt einen entscheidenden Schritt zum Verständnis der wahren Heterogenität der Chromatinregulation dar. Traditionelle Bulk-Methoden haben unschätzbare Einblicke in die durchschnittliche Verteilung von hPTMs über Gewebe hinweg geliefert, verbergen jedoch die Zell-zu-Zell-Variabilität, die zunehmend als biologisch bedeutsam anerkannt^wird. Einzellige proteomische Ansätze ermöglich.......

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Disclosures

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J.C. ist Mitarbeiter von SCIENION US Inc.

Acknowledgements

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Wir würdigen Dr. Bernice Morrow und Dr. Jidong Shan im Molecular Cytogenetics Core des Albert Einstein College of Medicine für die Pflege des cellenONE-Instruments.

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5-mL Mikrozentrifugenröhren	Bio-Rad	2239480
1000 & Mikro; L-breite Pipetspitzen	Fisher Scientific	14222703
200 & Mikro; L-breite Pipetspitzen	Fisher Scientific	14222730
384 Brunnen PCR-Platte Lo Bind	Eppendorf	30129547
96-Bohrloch-Vakuumkrümmer	Millipore	MAVM0960R
Acetonitril, Optima LC-MS/MS-Qualität.	Fisher Scientific	A955-1
Klebeweise PCR-Plattenfolien	Thermo Fisher	AB0626
Wasserfreies Acetonitril	Fisher Scientific	AA42311AK	Etiketten-Lösung für Großpackungen lagert
Arg-C Ultra, Mass-Spec-Qualität	Promega	VA1831
Zellkulturqualitätswasser	Corning	25-055-CV
CellenVIALs	SCIENION	/	Die Katalognummer enthält ein Zitat
DMSO, Wasserfrei	Thermo Fisher	D12345	Etikettenlagerlösung
DTT	Sigma	D0632-5G
Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM)	Fisher Scientific	MT17205CV
Fetales Rinderserum	Fisher Scientific	MT35010CV
Ameisensäure	Thermo	28905
Ameisensäure 98 %; 100 % für LC-MS LiChropur	Sigma	5330020050
Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
HEPES (Ultra Rein)	Thermo Fisher	11344041
HPLC-Qualitätsacetonitril	Fisher Scientific	A955-4
HPLC-Qualitätswasser	Fisher Scientific	W5-4
Hydroxylaminlösung 50 Wt. % in H₂O	Sigma	438227-50ML
L-Glutamin	Fisher Scientific	MT25015CI
n-Dodecyl-beta-Maltosid (DDM) Waschmittel	Fisher Scientific	BN2005
Nicht-essentielle Aminosäuren	Fisher Scientific	MT25025CI
Orbitrap Exploris 480 Massenspektrometer	Thermo Fisher	BRE725539
Paraformaldehyd 16% wässrige Lösung EM-Grade	Elektronenmikroskopiewissenschaften	15710-S
PDC-CM (Typ-2-Beschichtung)	SCIENION	/	Die Katalognummer enthält ein Zitat
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	MT3002CI
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x, pH 7,4, RNase-frei	Thermo Fisher	AM9625
Pierce-Dimethylsulfoxid (DMSO), LC-MS-Qualität.	Thermo Fisher	85190
Pipettenpistole	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Propionanhydrid ≥ 99%	Sigma	240311-50G
Propionanhydrid-d10 ≥ 98 Atom % D, ≥ 99 % (CP)	Sigma	615692-1G
Gekühlte Zentrifuge	Thermo	75-217-420
SciCHIP H1-beschichtete Glasverkleidungen	SCIENION	/	Die Katalognummer enthält ein Zitat
SpeedVac-Vakuumkonzentrator (96-Well-Platten)	Thermo	15308325	Savant SPD1010
Sterile Haube	Thermo	1375
Sterile serologische Pipetten	Fisher Scientific	1367549
SYTOX Green Dead Cell Stain, für die Durchflusszytometrie	Thermo Fisher	S34860
TrypLE Express Enzym (1X), kein rotes Phenol	Thermo Fisher	12604013
Vortex	Sigma	Z258415
Wasserbad	Fisher Scientific	FSGPD10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).
Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A.

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Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)

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