Methodenartikel

Massiver Eisprung bei Säugetieren: Techniken zur Analyse natürlicher spontaner Polyovulation und induzierter Polyovulation bei Lagostomus maximus

DOI:

10.3791/69653

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6. Februar 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Estudios Biomédicos Básicos, Aplicados y Desarrollo (CEBBAD), Universidad Maimónides, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Analyse des natürlichen und induzierten Eisprungs im Lagostomus maximus, einschließlich der Eierzellenerholung nach spontaner, hormonell induzierter oder seminaler plasma-induzierter Eisprung. Es bietet einen umfassenden Rahmen zur Untersuchung der Eierstockreaktion und der Fortpflanzungsphysiologie in einem hochgradig polyovulatorischen Säugetiermodell.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die südamerikanische Ebenen-Vizcacha, Lagostomus maximus, gilt als die Säugetierart mit der höchsten Eisprungrate, die bis zu 300 Eizellen erreichen kann. Dieses bemerkenswerte Polyovulationsphänomen kann durch mehrere methodische Ansätze untersucht werden, die seine charakteristische reproduktive Physiologie widerspiegeln. Der natürliche Eisprung wird während der Brutzeit durch die Freisetzung der Eizellen bewertet, was Einblicke in die spontanen Ovulationsmechanismen der Art liefert, wobei die Eizellen durch Spülen des Eileiters und der Gebärmutterhörner geborgen werden. Darüber hinaus ermöglicht die experimentelle Induktion des Eisprungs mit exogenen Hormonen wie Gonadotropinen eine kontrollierte Bewertung der Eierstockreaktion und bietet ein wertvolles Modell zum Verständnis der endokrinen Regulation bei hystrucognatischen Nagetieren. Ein dritter Ansatz beinhaltet die Verwendung von autologem Samenplasma als physiologischen Auslöser des Eisprungs, was das Koexistenzen von induzierten und spontanen Mechanismen bei dieser Art hervorhebt. Zusammen erläutern diese Techniken nicht nur die Dynamik der Follikelrekrutierung und der Oocytfreisetzung, sondern etablieren auch L. maximus als vergleichendes Modell für die Fortpflanzungsbiologie mit potenziellen translationalen Implikationen für das Verständnis der Eisprungkontrolle bei Säugetieren.

Einleitung

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Der südamerikanische Ebenenvizcacha (Lagostomus maximus) ist ein Hystricognath-Nagetier, das sich durch seine außergewöhnliche Fortpflanzungsphysiologie auszeichnet und durch eine außergewöhnliche Eisprungrate gekennzeichnet ist, die pro Zyklus300 Eizellen übersteigen kann. Dieses charakteristische Merkmal hat L. maximus als natürliches Modell zur Untersuchung der Eierstockfunktion und der Ovulationskontrolle bei Säugetieren positioniert.

Im Gegensatz zu typischen spontanen Ovulatoren zeigt L. maximus sowohl spontane als auch induzierte Ovulationsmechanismen2. Diese Dualität, kombiniert mit massivem follikelärem Wachstum und asynchroner Eisprung, stellt konventionelle Ansätze heraus, die ausschließlich auf endokrinen oder histologischen Endpunktenbasieren. Daher ist der Einsatz direkter, quantitativer Techniken unerlässlich, um den Zeitpunkt und das Ausmaß der Eizellfreisetzung genau zu bestimmen.

Erwachsene weibliche Vizcachas stammten aus einer natürlichen Population, die in der Estación de Cría de Animales Silvestres (ECAS), Parque Pereyra Iraola, Berazategui, Provinz Buenos Aires, Argentinien (34°49′57" S, 58°06′12" W) unterhalten wurde. Wir erkennen an, dass die souveränen Rechte über natürliche Ressourcen ausschließlich Eigentum der Provinz Buenos Aires sind. Die Anzahl der gefangenen Tiere wurde vom Landwirtschaftsministerium der Provinz Buenos Aires genehmigt. Weibchen wurden mit lebenden Fallen gefangen, die zu verschiedenen Zeitpunkten im Jahr an den Baueingängen platziert wurden.

Die Fangzeiten wurden anhand des natürlichen Fortpflanzungszyklus der Art ausgewählt, der von Llanos & Crespo15 festgelegt wurde, und basierend auf unseren Feldarbeitserfahrungen 7,8,10,14 verfeinert. Die Art weist eine Hauptfortpflanzungssaison auf, die sich vom Spätsommer (März) bis zum Beginn des Frühlings EndeSeptember 16, 17 und 18 erstreckt, sowie eine sekundäre Brutzeit im Oktober, insbesondere bei Weibchen, die ihreNachkommen verloren haben. Dementsprechend wurden folgende Arbeitsgruppen bestimmt: a) Gruppe I (N= 27): Ende Februar–Anfang April (nicht schwanger, Beginn der Hauptreproduktionszeit); b) Gruppe II (N= 26): Mitte September bis Ende Oktober (nicht schwanger, post-laktative Östrus); Gruppe III (N= 35): Dezember–Januar (nicht-schwanger, hormoninduzierter Eisprung); Gruppe IV (N= 7): Dezember–Januar (nicht-schwangere, durch Samenplasma induzierte Eisprung).

Diese Studie stellt verschiedene methodische Ansätze zur Analyse des Eisprungs bei L. maximus vor und validiert sie: (1) Beurteilung des natürlichen Eisprungs durch direkte Eizellen-Erholung; (2) Einleitung des Eisprungs mit exogenen Gonadotropinen; und (3) die Induktion des Eisprungs mit autologem Samenplasma. Jede Technik liefert ergänzende Einblicke in die Follikeldynamik, die Eierreifung und die regulatorischen Mechanismen, die den Eisprung steuern.

Das Spülen der Eileiter und Gebärmutterhörner ermöglicht eine direkte Rückgewinnung der Eizellen und eine genaue Quantifizierung des Eisprungs, was eine Korrelation mit der Follikelentwicklung und der Oocytenmorphologieermöglicht. Hormonelle Stimulation mit exogenen Gonadotropinen, angepasst aus Protokollen, die bei Labornagetierenverwendet wurden, ermöglicht eine kontrollierte Bewertung der Eierstockreaktion und des Zeitpunkts der Eizellfreisetzung. Unterdessen bietet der Einsatz von autologem Samenplasma als physiologischer Auslöser für den Eisprung – zuvor beschrieben bei induzierten Ovulatoren wie Kaninchen und Kamelliden 23,24,25 – eine innovative Möglichkeit, die endokrinen und parakrinen Faktoren zu erforschen, die an der Eisprung beteiligt sind.

Durch die Integration dieser komplementären Methoden bietet die vorliegende Arbeit einen reproduzierbaren Rahmen zur Untersuchung ovvulatorischer Mechanismen bei L. maximus. Die Kombination aus natürlichen und induzierten Modellen ermöglicht eine Unterscheidung zwischen spontaner Follikelrekrutierung, ovulatorischer Effizienz und seminalen plasmavermittelten Reaktionen. Darüber hinaus zeigen diese Ansätze Phänomene wie spontane parthenogenetische Aktivierung der Eizellen und das Nebeneinander von "defekten" und "euovulatorischen" Eierzellen auf, was zum Verständnis der Follikelseselektion und der Fähigkeit der Eizellenbeiträgt 2.

Über seine artspezifischen Implikationen hinaus bietet das Vizcacha-Modell eine breitere Relevanz für die vergleichende Fortpflanzungsbiologie. Seine gemischte Ovulationsstrategie überbrückt Eigenschaften von induzierten und spontanen Ovulatoren und bietet wertvolle Parallelen zu Fortpflanzungsprozessen bei anderen Säugetieren, einschließlich Hausarten und Menschen 7,14,26,27.

Die hier beschriebenen methodischen Protokolle sind darauf ausgelegt, die Reproduzierbarkeit sicherzustellen und ihre Anpassung an verschiedene experimentelle Kontexte mit Follikeldynamik, ovulatorischer Regulation und hormoneller Manipulation zu erleichtern.

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Protokoll

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Die hier beschriebenen experimentellen Protokolle wurden vom Institutionellen Ausschuss für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren (CICUAE, Universidad Maimónides, Protokollnummer #6184) überprüft und genehmigt. Fangen, Handhabung und Euthanasie wurden von geschultem technischem Personal unter Einhaltung aller lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt. Die Tierhaltung folgte den Richtlinien des National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Nutzung von Labortieren28 sowie den Richtlinien der American Society of Mammalogists (ASM) für den Einsatz wilder Säugetiere in der Forschung29. Alle Experimente entsprachen den ARRIVE 2.0 Richtlinien30. Es wurde alles unternommen, um die Anzahl der eingesetzten Tiere zu minimieren. Die südamerikanische Ebene Vizcacha (Lagostomus maximus) gilt nicht als gefährdete Art31.

1. Hormonelle Einleitung des Eisprungs

HINWEIS: Dieser Abschnitt zeigt die hormonelle Induktion des Eisprungs bei nicht trächtigen Weibchen gefangener Vizcachas. Drei verschiedene Protokolloptionen werden diskutiert.

  1. Protokoll A:
    1. Geben Sie 200 IE Pferdechoriongonadotropin (eCG) intramuskulär bei 0 und 24 Stunden, gefolgt von 500 IE humanes Choriongonadotropin (hCG) bei 48 Stunden.
    2. Weibchen bis zur Euthanasie ruhen.
    3. Euthanasie Frauen 60–132 Stunden nach der hCG-Verabreichung (siehe Abschnitt 3).
  2. Protokoll B:
    1. Verabreichen Sie 200 IE eCG intramuskulär bei 0 und 24 Stunden, gefolgt von 1.000 IE hCG bei 72 Stunden.
    2. Weibchen bis zur Euthanasie ruhen.
    3. Euthanasie Frauen 60–132 Stunden nach der hCG-Verabreichung (siehe Abschnitt 3).
  3. Protokoll C:
    1. Verabreichen Sie 250 IE eCG intramuskulär um 0 Uhr, 24 Stunden und 48 Stunden, gefolgt von 2 mg Schweineluteinisierendes Hormon (pLH) bei 72 Stunden.
    2. Weibchen bis zur Euthanasie ruhen.
    3. Weibchen 60–132 Stunden nach der Verabreichung von pLH eingeschläfert (siehe Abschnitt 3 und Tabelle 1).
      HINWEIS: Die Tiere in jeder Gruppe wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten eingeschläfert (von 60 Stunden bis 132 Stunden nach der HCG-Verabreichung). Diese zeitliche Verteilung war entscheidend, um die verlängerte Natur der Eisprungphase bei dieser Art zu bestätigen. Insbesondere für Experimente, die ausschließlich auf die Sammlung reifer Eizellen abzielten, wurde die Euthanasie konsequent 120 Stunden nach hCG durchgeführt.

2. Induktion des Eisprungs durch Samenplasma

HINWEIS: Untersuchen Sie die Fähigkeit des Samenplasmas, den Eisprung durch intramuskuläre Verabreichung bei hormonell beeinträchtigten Frauen zu induzieren.

  1. Samensammlung und -vorbereitung
    1. Sammeln Sie Sperma von reproduktiv aktiven Männern durch Elektroejakulation, wie von Giacchino32 beschrieben.
    2. Zentrifugiere Samen bei 200 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um Spermien und Zellreste zu pelletieren.
    3. Ergänzen Sie Supernatanten (Samenplasma) mit Penicillin und Streptomycin und lagern Sie bis zur Anwendung bei -20 °C.
  2. Einleitung des Eisprungs bei nicht schwangeren Frauen durch Samenplasma
    1. Verabreichen Sie 200 IE eCG intramuskulär im 0 und 24 Stunden pro Weibchen.
    2. Injizieren Sie Samenplasma intramuskulär 48 Stunden nach der letzten eCG-Dosis.
    3. Weibchen bis zur Euthanasie ruhen.
    4. Tiere 72 Stunden nach der Samenplasmainjektion eingeschläfert (siehe Abschnitt 3).
      HINWEIS: Kontrollweibchen werden mit Kochsalzlösung anstelle von Samenplasma injiziert.

3. Anästhesie, Euthanasie und Entnahme des Fortpflanzungstrakts

HINWEIS: Verwenden Sie Anästhesie- und humane Euthanasiemethoden, um intakte Fortpflanzungstrakte für Eizellen- und histologische Analysen zu erhalten.

  1. Die Euthanasie wird durch eine einzige, berechnete intramuskuläre Injektion von 13,5 mg/kg Ketaminchlorhydrat und 0,6 mg/kg Xylazinchlorhydrat gemäß den Herstellerempfehlungen und den etablierten institutionellen Protokollen induziert.
  2. Bestätigen Sie die Tiefenanästhesie durch das Ausbleiben einer Schmerzreaktion (Pedalreflexe).
  3. Setzen Sie das Tier in die Rückenlage und sterilisieren Sie den Bauch.
  4. Öffnen Sie die Bauchhöhle chirurgisch, um alle Bauchorgane vollständig freizulegen.
  5. Führen Sie eine allgemeine Untersuchung durch, um den Gesamtzustand des Tieres zu bestimmen und den natürlichen oder hormoninduzierten Eisprung durch das Vorhandensein von ovulatorischen Stigmata zu bestätigen.
  6. Entnehmen Sie eine Blutprobe durch direkte Punktion der oberen Vena cava zur serologischen Untersuchung.
  7. Führen Sie eine Euthanasie am Tier durch intrakardiale Verabreichung von 0,5 ml/kg Natriumpentobarbital durch.
  8. Sezieren und entfernen Sie sorgfältig die Eierstöcke, Eileiter und Gebärmutterhörner, wobei Sie darauf achten, ihre Strukturen nicht zu beschädigen.
  9. Bewahren Sie das Gewebe bis zur Verarbeitung (≤15 Min) in eiskaltem phosphatgepuffertem Kochsalzlösungszustand (PBS) auf.

4. Eizellen-Erneuerung

HINWEIS: Entfernen Sie Eizellen aus den Eierleitern und Gebärmutterhörnern durch sanftes Spülen, um eine vollständige Sammlung freigesetzter Gameten sicherzustellen und gleichzeitig Gewebeschäden zu minimieren.

  1. Bereiten Sie das Spülgerät vor, indem Sie eine stumpfe 26-G-Nadel an eine 1-mL-Spritze mit 0,9 % NaCl befestigen, ergänzt mit 4 mg/mL BSA, 100 μg/mL Penicillin G und 100 IU/mL Streptomycin.
  2. Führen Sie die Nadel vorsichtig in das Infundibulum jedes Eileiters ein und injizieren Sie langsam die Spüllösung.
  3. Sammeln Sie das Abwasser aus dem distalen Eileiter und dem Gebärmutterhorn in sterile Petrischalen.
  4. Wiederholen Sie das Spülen, bis die wiedergewonnene Flüssigkeit klar und frei von sichtbaren Eierzellen oder Zellresten erscheint.
  5. Übertragen Sie Eizellen auf 100 μL Tröpfchen des M2-Mediums mit 4 mg/mL BSA und Antibiotika unter Mineralöl.
  6. Bestätigen Sie die erfolgreiche Wiederherstellung durch Inspektion der Tröpfchen unter einem Stereomikroskop; Erwarten Sie freie Oocyten ohne Kumuluszellen, die in der Flüssigkeit verteilt sind.
  7. Spülen Sie weiter, bis das Abwasser klar ist und unter dem Stereomikroskop keine weiteren Eizellen beobachtet werden (typischerweise 3–5 Spülungen pro Eileiter).
    HINWEIS: Gewonnene Eizellen sollten unter geringer Vergrößerung kugelförmig und durchsichtig erscheinen.
  8. Klassifizieren Sie Eizellen nach morphologischer Integrität wie in Abschnitt 6 beschrieben.

5. Oocytenmorphologische Beurteilung

HINWEIS: Beurteile die Qualität der geborgenen Oozyten anhand des zytoplasmatischen Aussehens, der Einheitlichkeit der zona pellucida und der Kernreifungsphase.

  1. Identifizieren Sie Eizellen als normal, wenn sie eine kugelförmige Form, eine einheitliche Zona pellucida, ein homogenes, durchscheinendes Zytoplasma und eine sichtbare Keimbläse oder einen ersten polaren Körper aufweisen.
  2. Erkennen Sie Eizellen als abnormal, wenn das Zytoplasma dunkel, körnig oder fragmentiert erscheint oder wenn die Zona pellucida unregelmäßig ist.
  3. Erfassen Sie die Kernreifungsphase als Keimblüche (GV), Keimvesikelabbau (GVBD) oder Metaphase II (MII).

6. Bewertung der Kernreifung der Eizellen und der Integrität der meiotischen Spindel

HINWEIS: Untersuchen Sie die Kernreifung und Spindelmorphologie durch Immunfluoreszenzfärbung der α-Tubulin- und Chromatin-Gegenfärbung.

  1. Eizellen in 20 % Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten fixieren.
  2. Permeabilize in 0,2 % Triton X-100 in PBS für 40 Minuten.
  3. Nach der Fixierung 20 % PFA für 20 Minuten und dreimal mit PBS (jeweils 30 Minuten) waschen.
  4. Blockieren Sie mit 2 % Ziegenserum, 2 % BSA, 2 % Milchpulver, 0,1 m Glycin und 0,01 % Triton X-100 in PBS für ≥ 1 Stunde.
  5. Inkubieren Sie die Eizellen über Nacht bei 4 °C mit dem Maus-Anti-α-Tubulin-Antikörper (1:200).
  6. 30 Minuten in PBS waschen und 1 Stunde in Dunkelheit mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (1/1000) inkubieren.
  7. Gegenbeize mit 10 μg/mL Hoechst 33324 für 10 Minuten und Waschen in PBS mit 2 % BSA.
  8. Ezyten in Antifade-Medium montieren und mit einem konfokalen Mikroskop abbilden.
  9. Aufnahme und Verarbeitung von Bildern mit der EZ-C1-Software (EZ-C1 Version 3.90); Kontrast und Helligkeit in Bildverarbeitungssoftware nach Bedarf anpassen.
    HINWEIS: Erfolgreiche Färbung zeigt sich durch ein klares grünes Fluoreszenzmuster der meiotischen Spindel (FITC) und blaue Kern-Gegenfärbung mit Hoechst 33324.

7. Statistische Analyse

HINWEIS: Analysieren Sie quantitative Daten, um ovulatorische Reaktionen und Eizellqualität zwischen experimentellen Gruppen zu vergleichen.

  1. Drücken Sie Daten als Mittelwert ± SD aus.
  2. Verwenden Sie den Schüler-t-Test für Zweigruppenvergleiche.
  3. Wenden Sie Einweg-ANOVA an, gefolgt von Bonferronis Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche.
  4. Betrachten wir p < 0,05 als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

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Natürlicher Eisprung

Zwölf der 27 Weibchen (Gruppe I), die von Ende Februar bis Mitte April gefangen wurden, zeitgleich mit der primären Paarungszeit, wurden als Eisprung beobachtet, während während der zweiten Paarungszeit (September/Oktober) (Gruppe II) 10 von 26 gefangenen Weibchen einen Eisprung zeigten. Während beider Fangphasen wurde eine vergleichbare Erfolgsquote von etwa 40 % der ovulierenden Weibchen beobachtet. In keinem Fall wurde eine Schwellung des ampullären Ber...

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Diskussion

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Das hier vorgestellte Protokoll zur Untersuchung des Eisprungs in den Vizcacha-Ebenen bietet einen reproduzierbaren Rahmen zur Bewertung sowohl natürlicher als auch experimentell induzierter Ovulationsereignisse. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls liegt in seiner Fähigkeit, die außergewöhnlich hohe Anzahl der von den Ebenen-Vizcacha freigesetzten Eizellen direkt zu quantifizieren und zu charakterisieren – ein Merkmal, das bei anderen Säugetiermodellen unerreicht ist. Im Gegensatz...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt, der als Beeinträchtigung der Unparteilichkeit der berichteten Forschung wahrgenommen werden könnte.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch die intramurale finanzielle Unterstützung der Universidad Maimónides, Argentinien, und der Agentur FONCYT-AMPCYT, Argentinien, (PICT-2018-04619, an NPL vergeben), unterstützt. Die Autoren sind besonders dankbar gegenüber der Landwirtschaftsbehörde der Regierung der Provinz Buenos Aires, Argentinien, für die Genehmigung des Fangs von Tieren; an das Personal der Estación de Cría de Animales Silvestres (ECAS, Provinz Buenos Aires, Argentinien) für ihre unschätzbare Hilfe beim Fangen und Umsetzen der Tiere; und an DVM Sergio Ferraris und DVM Fernando Lange von der CCV-Universidad Maimónides für ihre Unterstützung während der Anästhesie und chirurgischen Eingriffe.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Adobe PhotoshopAdobe Systems Inc., USAN/ABildverarbeitung
Rinderserum-Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, USAA9647Verwendung im Spülmedium und im Blockpuffer
Zentrifuge (zur Samenverarbeitung)Eppendorf, Deutschland5417RSeminale Plasmavorbereitung
Konfokalmikroskop (C1 Eclipse E800)Nikon Ltd., JapanN/AOocytenbildgebung
ElektroejakulatorEntworfen im Labor; Angepasst von Haustieren für den Einsatz bei Caviomorph-NagetierenN/ASpermasammlung
Euthanyl (Natriumpentobarbital, Natriumdiphenylhydantoin)Brouwer S.A., ArgentinienN/AEuthanasie
FITC-konjugierte Ziegen-Antimaus-IgG (AP124F)Chemicon, USAAP124FSekundärer Antikörper
Hämatoxylin-Eosin-FärbesetSigma-Aldrich, USAVerschiedeneHistologie
Hoechst 33324Thermo Fisher Scientific, USAH3570Nuklearfärbung
KetaminchlorhydratHolliday Scott S.A., ArgentinienN/AAnästhesie
Laminarer FlusshaubeThermowissenschaftlich, USAN/AAseptisches Handling
LichtmikroskopOlympus, JapanBX51Histologie
Lutropin-V (pLH)Bioniche Animal Health Care, KanadaN/AHormonelle Induktion
M2-MediumSigma-Aldrich, USAM7167Eizellengewinnung
MineralölSigma-Aldrich, USAM8410Eizellkultur
Novormon 5000 (eCG)Syntex S.A., ArgentinienN/AHormonelle Induktion
Ovusyn (hCG)Syntex S.A., ArgentinienN/AHormonelle Induktion
Paraformaldehyd (PFA, 2 % und 4 %)Sigma-Aldrich, USA158127Fixierung
Penicillin GSigma-Aldrich, USAP3032Antibiotika für Medien
StereomikroskopLeica Microsystems, DeutschlandM80Eizellen-Identifikation
StreptomycinGibco, Thermo Fisher Scientific, USA11860038Antibiotika für Medien
Spritze mit stumpfer Nadel (1 ml)BD Biosciences, USA305219Spülung von Eileitern/Gebärmutter
Triton X-100Sigma-Aldrich, USAT8787Permeabilisierung
VectaShield-MontagemediumVector Laboratories, USAH-1000Montage für Fluoreszenz
XylazinchlorhydratRichmond Laboratories, ArgentinienN/AAnästhesie
XylenSigma-Aldrich, USA534056Paraffin-Entwachsabschnitte
α-tubulin monoklonaler Antikörper (Maus-Anti-α-Tubulin, SC-5286 B7)Santa Cruz Biotechnologie, USASC-5286 B7Für meiotische Spindel-Immunfärbung

Referenzen

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