Method Article

Verbesserte räumliche Abbildung der Magenmuskelschichten der Maus mit einer modifizierten Swiss Roll-Technik

DOI:

10.3791/69673

⸱

November 25th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program and Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 2Gastroenterology Research Unit, Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine Immunfärbungsmethode für den ganzen Magen, die von der ursprünglich für den Mausdarm entwickelten "Swiss Roll"-Technik abgewandelt wurde.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Räumliche "Omics"-Technologien bieten beispiellose Möglichkeiten, die Biologie und die Interaktionen einzelner Zellen des gastrischen neuromuskulären Apparats in ihrer natürlichen Gewebeumgebung zu untersuchen. Die erfolgreiche Anwendung dieser Ansätze sowie die Bewertung struktureller und molekularer Unterschiede im Fundus, Korpus und Antrum erfordern jedoch eine konsistente Probenahme und Gewebeorientierung. Hier berichten wir über eine modifizierte "Swiss Roll"-Technik, die auf den Mausbauch zugeschnitten ist und es ermöglicht, alle wichtigen anatomischen Regionen in einer einzigen Kryosektion einzubetten und zu visualisieren. Dieser Ansatz betont flache Fixierung und sorgfältige Positionierung, um Schnitte mit reproduzierbarer Ausrichtung und Qualität zu erzeugen. Diese Studie optimierte außerdem die Bedingungen der Immunfluoreszenzfärbung, um eine hochwertige Visualisierung zellulärer Marker sicherzustellen. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende, nebeneinanderfolgende Vergleiche der Magenregionen und minimiert dabei Gewebeverlust und experimentelle Variabilität. Durch die Verbesserung der Gewebeerhaltung und räumlicher Ausrichtung bietet diese Methode Forschenden ein praktisches und skalierbares Werkzeug, die Magenbiologie sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Kontexten untersuchen.

Introduction

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Der Magen ist ein komplexes, J-förmiges Organ, das die Speiseröhre mit demDuodenum 1 verbindet. Er ist in drei Hauptbereiche anatomisch unterteilt: Fundus, Korpus undAntrum 1. Jeder Bereich der Magen-Tunica muscularis spielt eine eigene physiologische Rolle und trägt zu wichtigen Magenfunktionen wie Akkommodation, Compliance, Nahrungsmitteltrituration und Entleerungbei. Die Untersuchung von Veränderungen in der Magenphysiologie und -pathologie erfordert eine detaillierte Analyse dieser Regionen und ihrer zellulären Architektur.

Um große Gewebeflächen zu visualisieren, passen Forscher oft die "Swiss Roll"-Technik an, die ursprünglich für den Mausdarm 3,4,5,6 entwickelt wurde. Diese Studie modifizierte die Swiss-Roll-Technik für den Einsatz im Mausmagen, um ein neues Protokoll zu etablieren. Der Magen wird zunächst in seine anatomischen Bereiche aufgeteilt und in einer flachen Ausrichtung fixiert. Das Gewebe wird dann vorsichtig gerollt und für die Kryosektion verarbeitet. Ein falsches Schweizer Rollen kann empfindliche Epithelstrukturen, insbesondere im Darm, schädigen, was zu einer schlechten Gewebequalität bei der Immunfärbung führt. Die Erhaltung gut fixiertes, richtig orientierten Gewebes mit intakten Zellstrukturen ist für hochauflösende Bildgebung unerlässlich. Diese Arbeit präsentiert eine neue Methode zur Herstellung von Schweizer Rollen, die alle Magenregionen in einem einzigen Kryoblock umfassen. Zusätzlich wird ein optimiertes Immunfluoreszenzfärbungsprotokoll für die Magen-Tunica muscularis beschrieben, das eine detaillierte Bewertung der Magenfunktion ermöglicht. Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Leitfaden zur Erstellung hochwertiger Immunfluoreszenzbilder durch sorgfältige Vorbereitung von Magengewebe, Swissroll-Verarbeitung und Färbung. Durch die Bewahrung der komplexen Morphologie der gastrischen Tunica muscularis erleichtert diese Methode ein tieferes Verständnis ihrer Struktur und Funktion sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheit.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tierversuche wurden nach den Richtlinien durchgeführt, die im National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals festgelegt sind. Die Protokolle wurden vom Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (A48315-15) genehmigt. Die Programme und Einrichtungen der Mayo Clinic für Tierpflege und -nutzung wurden von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) überprüft und vollständig akkreditiert. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Swiss-Roll-Technik für paraformaldehydfixierte (PFA)-fixierte Magenkryosektionen

  1. Betäuben Sie eine C57BL/6J-Maus (8-10 Wochen alt) mindestens 3 Minuten durch Kohlendioxidinhalation (CO₂), gefolgt von einer Zervikalluxation, um eine Euthanasie sicherzustellen (nach institutionell genehmigten Protokollen).
  2. Schneiden Sie die Speiseröhre, den Duodenum sowie die ventrale und dorsale Mesogasttrie ab, um den Magen zu entfernen.
  3. Setzen Sie den Magen in eine silikonbeschichtete Schale mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Stecken Sie Speiseröhre, Fundus, Korpus und Duodenum als Orientierungsreferenzen an (Abbildung 1A). Die Schnittrichtung wird durch eine rot gestrichelte Linie in Abbildung 1A angezeigt.
  4. Entfernen Sie vorsichtig anhaftendes Fett mit einer Dübelschere und Pinzette.
  5. Entlang des ventralen Mesenteriums des Duodenums und des Magens bis zum Pin am Korpus schneiden und dann das Gewebe vorsichtig abflachen (Abbildung 1B).
  6. Verwenden Sie eine mit PBS gefüllte Transferpipette, um eventuelle Restnahrung aus dem Magenlumen zu spülen.
  7. Dehnen Sie vorsichtig den geöffneten Bauch, um eine flache Ausrichtung zu erreichen (Abbildung 1C).
    VORSICHT: Vermeiden Sie eine Überdehnung (d. h. mehr als 110 % der ursprünglichen Abmessungen), um die Gewebearchitektur zu erhalten.
  8. Tauchen Sie den Magen 2 Minuten in kaltes 4%-PFA, um das Gewebe leicht zu fixieren und das Rollen zu erleichtern.
  9. Stecke das Gewebe nach der kurzen Fixierung wieder flach fest.
  10. Schneiden Sie den Bauch entlang der gestrichelten Umrandung, um eine gleichmäßige Form zu schaffen, die zum Rollen geeignet ist (Abbildung 1C).
  11. Legen Sie das gestutzte Magengewebe auf PBS-befeuchtetes Filterpapier (Abbildung 1D).
  12. Rollen Sie das Gewebe zu einer Schweizer Roll-Konfiguration und sichern Sie es, indem Sie einen Zahnstocher durch die Mitte führen.
    VORSICHT: Stellen Sie während des Rollvorgangs sicher, dass die Schleimhautseite nach oben zeigt. Halten Sie das Duodenalende mit einer Pinzette in einer Hand und führen Sie mit der anderen den Zahnstocher nach geringfügigen Änderungen der veröffentlichten Methoden.
  13. Nach dem Rollen wird eine 30-G-Nadel eingesetzt, um die Form zu sichern, und sie in einem 90°-Winkel gebogen, um den eingerollten Bauch zu stabilisieren (Abbildung 1E).
  14. Das gerollte Gewebe in 4 % PFA bei 4 °C für 6 Stunden fixieren.
  15. Das fixierte Gewebe wird in PBS auf 30 % Saccharose übertragen und bei 4 °C 12–16 Stunden inkubiert, um Kryoschutz und die Verhinderung der Eiskristallbildung zu verhindern.
  16. Entfernen Sie vorsichtig die Stabilisierungsnadel.
  17. Das Gewebe in eine optimale Schneidetemperatur (O.C.T.)-Mischung mit Einweg-Basisformen einbetten und dann auf Trockeneis einfrieren (Abbildung 1F).
  18. Sobald die Form vollständig eingefroren ist, lagern Sie die Form bei -80 °C.
    VORSICHT: Vermeiden Sie Luftblasen im O.C.T., besonders um das Gewebe herum, da sie das Schneiden behindern. Gewebeblöcke können mindestens ein Jahr bei -80 °C gelagert werden.
  19. Vor dem Schneiden den Block mindestens 1 Stunde bei -20 °C ausgleichen.
  20. Schneiden Sie das Gewebe mit einer Dichte von 5 μm mit einem Kryostat.
    VORSICHT: Eine Dicke von 5–12 μm ist in der Regel für Maus-Magenschnitte 7,8 geeignet und kann je nach experimenteller Forderung angepasst werden. Abschnitte können bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert werden.

2. Immunfluoreszierende Färbung des Magenmuskelgewebes

  1. Mit einem hydrophoben Barrierenstift zeichnen Sie eine wasserabweisende Barriere um jeden Gewebeschnitt auf dem Objektträger.
  2. Waschen Sie die Stücke 5 Minuten lang mit kaltem PBS, um die restlichen O.C.T.-Substanzen aufzulösen.
  3. Blockieren Sie die unspezifische Bindung, indem Sie die Schnitte mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT; 21-23 °C) inkubieren.
  4. Entfernen Sie das 1%ige BSA mit Absaugung und waschen Sie die Abschnitte dreimal mit kaltem PBS jeweils 10 Minuten bei RT (21-23 °C).
  5. Blockiert die unspezifische Bindung weiter, indem die Schnitte mit einer Maus-zu-Maus-IgG-Blockierungslösung in PBS für 1 Stunde bei RT (21–23 °C) inkubiert werden, was die Bindung endogenen IgG reduziert und die Spezifität bei Verwendung von Mausantikörper-IgG verbessert.
  6. Entfernen Sie die Blocklösung mit Saugung und waschen Sie die Abschnitte dreimal mit kaltem PBS jeweils 10 Minuten bei RT (21-23 °C).
  7. Wiederhole das BSA-Blocken für 1 Stunde bei RT (21-23 °C).
  8. Inkubieren Sie die Schnitte mit primären Antikörpern. Anoctamin-1 (ANO1), KIT, Beta-Tubulin Klasse III (TUBB3), verdünnt in kaltem 1 % BSA mit 0,3 % Triton X-100. In einem separaten Experiment verwenden Sie Myosin-schwere Kette 11 (MYH11), E-Cadherin und KIT. Über Nacht (12–16 H) bei 4 °C bebrüten.
  9. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung mit sanfter Absaugung. Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit kaltem PBS für jeweils 10 Minuten bei RT (21-23 °C).
  10. Inkubieren Sie die Schnitte mit sekundären Antikörpern. Alexa Fluor (AF) 488 Anti-Rabbit IgG, AF555 Anti-Maus IgG und AF647 Anti-Ziegen-IgG (alle bei 5 μg/mL; 1:400) in 1 % BSA für 1 Stunde bei RT (21-23 °C).
  11. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung mit Absaugung und waschen Sie die Abschnitte dreimal mit kaltem PBS jeweils 10 Minuten bei RT (21-23 °C).
  12. Färben Sie die Schnitte mit 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI, bei 1:300 Verdünnung) für 1 Stunde bei RT (21°-23 °C).
    VORSICHT: Neuronale Kerne zeigen typischerweise schwächere DAPI-Signale als andere GI-Zelltypen; Eine mindestens 1 Stunde Inkubation wird für eine optimale Visualisierung empfohlen.
  13. Spülen Sie die Abschnitte einmal mit ultrareinem Wasser, um Rückstände von Salzen zu entfernen.
  14. Montiere die Schlitten mit Antifade Mountant.
  15. Versiegeln Sie die Ecken des Deckdeckels mit nicht-fluoreszierendem Lacknagellack. Entfernen Sie überschüssiges Befestigungsmedium mit sanfter Absaugung. Dann versiegeln Sie den gesamten Umfang des Deckdeckels.

3. Immunfluoreszenzbildgebung mit einem konfokalen Mikroskop

  1. Stellen Sie die Multi-Channel-Z-Stack-Erfassung in der konfokalen Bildsoftware ein, indem Laser und Detektoren für DAPI, AF488, AF555 und AF647 konfiguriert werden, um eine spektrale Trennung zu gewährleisten und Signalsättigung zu vermeiden.
    VORSICHT: Passen Sie die Laserleistung und die Belichtungszeit für jedes Fluorophor einzeln an, um Übersprechen zu vermeiden und das Signal im Dynamikbereich über alle Kanäle hinweg zu halten (Abbildung 2A).
  2. Stellen Sie die Belichtungsparameter in der konfokalen Bildsoftware ein, um Pixelsättigung zu vermeiden und Signaldetails in hochintensiven Bereichen zu erhalten (Abbildung 2B).
    VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass die Signale in allen Kanälen im Dynamikumfang bleiben und keine Sättigung erreichen.
  3. Um die gesamte Magen-Swiss-Rolle zu erfassen, verwenden Sie eine große Bildaufnahmeeinstellung (z. B. 6 × 6 Felder) (Abbildung 2C); Diese Einstellung sollte jedoch je nach Gesamtgröße und Festigkeit des aufgerollten Gewebes angepasst werden.
  4. Erfassen Sie 3D-Bilder mittels Z-Serien-Aufnahme in der konfokalen Bildgebungssoftware. Der detaillierte Workflow für die N-dimensionale (ND) Erfassung ist in Abbildung 2D dargestellt.
  5. Wählen Sie die Z-Stack-Option , um die Z-Serien-Bildgebung zu aktivieren.
  6. Definieren Sie den Z-Bereich, indem Sie die oberen und unteren Fokuspositionen festlegen, die die gesamte Magendicke umfassen.
  7. Bring den oberen Teil des Bauches scharf und klicke auf die Top-Taste , um die obere Z-Grenze einzustellen.
  8. Stellen Sie den Fokus auf den unteren Teil des Magenmuskels ein und klicken Sie auf die Schaltfläche "Bottom ", um das untere Z-Limit einzustellen.
  9. Stellen Sie die Anzahl der Z-Stack-Schritte auf 8 ein, um die gesamte Tiefe des Magenmuskels abzudecken.
  10. Klicken Sie auf Jetzt ausführen , um die Z-Stack-Bildaufnahme zu starten.
  11. Erzeugen Sie Projektionen mit maximaler Intensität für einzelne und fusionierte Fluoreszenzkanäle, um dreidimensionale Daten in einem zweidimensionalen Bild zu visualisieren.

Results

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Mit der neuen Methode umfassten die magengewürfelten Maus alle drei Hauptbereiche des Magens: Fundus, Korpus und Antrum, sowie einen kleinen Teil der Speiseröhre und des Zwölffingerdarms in einem einzigen Abschnitt. Die Einbeziehung des gesamten Magens in einem Abschnitt ermöglicht eine umfassende regionale Analyse (Abbildung 1). Die Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung ganzer Bilder der Magen-Swiss-Rollen zeigte eine gut erhaltene Magenarchitektur in allen Regionen, was eine klare Visualisierung der Mucosal-, Submucosal- und Muscularis-Schichten ermöglicht (Abbildung 3). Abbildung 4 zeigt eine repräsentative immunfluoreszente Färbung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC; Schrittmacherzellen, die rhythmische langsame Wellen erzeugen, die der phasischen Darmbeweglichkeit zugrunde liegen; identifiziert durch KIT und ANO1), enterischen Neuronen (Neuronen des enterischen Nervensystems, die die gastrointestinale Motilität koordinieren; identifiziert durch TUBB3-Immunfärbung) und Kernen (DAPI). In der Magenschleimhaut wird KIT ebenfalls in Paneth- und Becherzellen exprimiert, wie zuvor berichtet 9,10,11. ANO1 ist auch im Magenepithel hoch exprimiert, insbesondere in den säulenförmigen Epithelzellen des Fundus, was mit seiner Rolle beim Chloridtransport und der Schleimhautsekretion11 übereinstimmt. Zusätzlich wird TUBB3 laut Daten aus dem Human Protein Atlas12,13 in bestimmten Magenendokrinzellen und schleimproduzierenden Zellen exprimiert. Abbildung 5 zeigt eine repräsentative immunfluoreszente Färbung glatter Muskelzellen, die mit MYH11 markiert sind, der Magenschleimhautepithelfellen, die mit E-Cadherin markiert sind, und ICC, die mit KIT markiert sind. MYH11 wird auch in Myofibroblasten in der Magenschleimhaut exprimiert, wie zuvorberichtet 14. Zusammen bestätigen diese Immunfluoreszenzergebnisse, dass unser Protokoll die Gewebearchitektur bewahrt.

Abbildung 1
Abbildung 1: Vorbereitung der "Schweizer Rolle" des Mausmagens für die Kryosektion. (A) Der gesamte Magen wird unmittelbar nach der Entnahme in eine schwarze, silikonbeschichtete Dissektionsschale gelegt, die mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, um die Gewebeintegrität zu erhalten. (B) Der Magen wird entlang der Mitte des Duodenums geöffnet. (C) Der Magen wird vorsichtig gedehnt und in der Schale festgehalten, sodass er flach liegt, ohne übermäßige Spannung auszuüben. Eine rote gestrichelte Linie ist entlang des Gewebes umrandet, um anzuzeigen, wo es geschnitten werden soll, um das Rollen zu erleichtern. (D) Der geöffnete und fixierte Magen wird auf PBS-angefeuchtetes Filterpapier gelegt, um das Zusammenrollen in eine kompakte Form vorzubereiten. Der rote Pfeil zeigt die Richtung des Magenrolls. (E) Gewebestücke werden in eine optimale Schneidetemperatur (O.C.T.) Verbindunge eingebettet und auf Trockeneis eingefroren, um sich auf die Kryosektion vorzubereiten. (F) Die gefrorenen Blöcke werden bei −80 °C gelagert und bei 5 μm Dicke zur nachgelagerten Analyse kryosektioniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2
Abbildung 2: ND-Akquisitionsaufbau und Sättigungsvisualisierung während der Z-Stack-Bildgebung. (A) Laser- und Detektoreinstellungen, die in der konfokalen Bildgebungssoftware für Mehrkanal-Spektralbildgebung konfiguriert sind. Es werden vier Fluorophore verwendet: 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI), Alexa Fluor 488 (AF488), Alexa Fluor 555 (AF555) und Alexa Fluor 647 (AF647), jeweils gepaart mit entsprechenden Anregungslasern und Emissionsdetektoren. Der Spektralgraph zeigt Anregungs- und Emissionskurven, was eine Anpassung zur Minimierung von Übersprechen und zur Optimierung der Signalerkennung ermöglicht. (B) Die Belichtungseinstellungen werden für jedes Fluorophor einzeln angepasst, um Pixelsättigung zu vermeiden und Details in Hochintensitätsbereichen zu erhalten. (C) Große Bildaufnahmeeinstellungen (z. B. 6 × 6 Felder) ermöglicht die Visualisierung der gesamten Magen-Schweizer-Rolle; Die Bildfeldgröße sollte entsprechend der Größe und Kompaktheit des gerollten Gewebes angepasst werden. (D) ND-Erfassungsfenster zeigt Z-Stack-Parametereinstellungen an. Der Z-Bereich wird definiert, indem die oberen und unteren Positionen des Magenmuskels ausgewählt werden, wobei acht Schritte so konfiguriert sind, dass die gesamte Gewebetiefe für eine dreidimensionale (3D) Analyse erfasst wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Bild einer mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Maus-Magen-Schweizer Rolle. Das Kachelscannen demonstriert die Fähigkeit, die gesamte Magen-Swiss-Rolle einer acht Wochen alten weiblichen C57BL/6J-Maus zu visualisieren. Wichtige anatomische Bereiche sind angezeigt, darunter die Speiseröhre (rote gestrichelte Linie), der untere Speiseröhren-Schließmuskel (violette gestrichelte Linie), der Fundus (schwarze gestrichelte Linie), der Korpus (blaue gestrichelte Linie), das Antrum (grüne gestrichelte Linie) und der Duodenum (orange gestrichelte Linie). Maßstabsleiste: 1000 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Konfokale Bilder einer Schweizer Rolle eines ganzen Mausmagens: ANO1, KIT, TUBB3. Obere Panels: Repräsentative genähte konfokale Bilder eines Magen-Swiss-Rolls einer 8 Wochen alten weiblichen C57BL/6J-Maus, die Immunfärbung für ANO1 (grün), KIT (cyan), TUBB3 (gelb) und Kerne (blau) zeigen. Der gesamte gerollte Magen, einschließlich Fundus, Corpus und Antrum, wird visualisiert. Maßstabsbalken: 1000 μm. Untere Panels: Vergrößerte Ansichten des Bereichs, der durch das weiß gestrichelte Feld in den oberen Panels umrandet wird und zelluläre Details der Zwischenzellen von Cajal (ANO1+ und KIT+; gelbe Pfeile) und enterische Neuronen (TUBB3⁺; rote Pfeile) hervorhebt. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Konfokale Bilder einer Schweizer Rolle eines ganzen Mausmagens: MYH11, KIT, E-Cadherin. Obere Panels: Repräsentative genähte konfokale Bilder einer Magen-Schweizer Rolle einer acht Wochen alten weiblichen C57BL/6J-Maus, die Immunfärbung für MYH11 (grün), KIT (cyan), E-Cadherin (gelb) und Kerne (blau) zeigen. Der gesamte gerollte Magen, einschließlich Fundus, Corpus und Antrum, wird visualisiert. Maßstabsbalken: 1000 μm. Untere Paneele: Vergrößerte Ansichten der Region, die durch das weiß gestrichelte Feld in den oberen Paneelen umrandet werden. Weiß gepunktete Linien markieren das schleimhautepithel (E-Cadherin) und die Muskelschicht (MYH11). Weiße Pfeile zeigen KIT+- Zwischenzellen von Cajal (ICC) an. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

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Mit der neu optimierten Magen-Swiss-Roll-Methode werden alle drei Magensegmente (Fundus, Korpus und Antrum) sowie Speiseröhre und Zwölffingerdarm auf einem einzigen Objektträger einbezogen. Diese umfassende Einbettung ermöglicht es Forschern, strukturelle und molekulare Veränderungen im gesamten Magen zu analysieren und senkt die Kosten für das Schneiden und Färben der Reagenzien (Abbildung 1).

Das gleichzeitige Aussetzen aller Magenregionen mit denselben Färbungslösungen während der Immunfärbung sorgt für Konsistenz und verbessert die Genauigkeit. Die Immunfärbung von Magen-Swiss-Rolls zeigt deutlich die deutlichen Schichten der Magenwand. Wie in Abbildung 4 und Abbildung 5 gezeigt, ermöglicht diese Methode die Visualisierung morphologischer Unterschiede zwischen Magensegmenten und ermöglicht den Nachweis von ICC (KIT und ANO1)10, Neuronen (TUBB3)15, glatten Muskelzellen (MYH11), mukosalen Epithelzellen (E-Cadherin) und Kernen.

Je nach Gewebezustand und Forschungszweck können kleinere Veränderungen vorgenommen werden. Zum Beispiel kann das Entfernen von zusätzlichem Fett helfen, die Form der Rolle während der Fixierung zu erhalten. Die Anpassung der Schnittdicke kann ebenfalls helfen, die Gewebestruktur zu erhalten oder die Haftung am Objektträger zu verbessern. Eine weitere mögliche Verfeinerung ist die Verwendung einer Metallform für ein gleichmäßigeres Schneiden, wie es bei Darm-SwissRolls 16 der Fall ist. Obwohl sich dieses Protokoll auf Kryosektionen konzentriert, kann es für paraffin-eingebettete Gewebe angepasst werden. Während die Einbettung von Paraffin die strukturelle Integrität des Gewebes bewahrt, ermöglicht die Kryosektion eine schnellere Verarbeitung und eine bessere Antigenkonservierung, wodurch es besser für Immunfluoreszenz geeignet ist.

Diese Methode hat allerdings Einschränkungen. Ein vergrößerter, fibrotischer oder verkalkter Magen, der häufig bei Entzündungen, Fettleibigkeit, Diabetes oder Alterung auftritt, kann schwieriger zu rollen sein und eine optimale Färbung mit sich bringen. Trotz dieser Einschränkung bietet diese Technik große Vorteile gegenüber traditionellen regionsspezifischen Einbettungen. Die Verarbeitung aller Magenregionen unter identischen Bedingungen verbessert die Konsistenz, reduziert die Variabilität und spart sowohl Zeit als auch Reagenzien.

Dieser Ansatz ist besonders nützlich für Studien zu regionsspezifischen Veränderungen. Sie unterstützt außerdem die räumliche Analyse mehrerer Zelltypen und kann mit bildbasierter Quantifizierung kombiniert werden. Insgesamt bietet diese neu optimierte Magen-Swiss-Roll-Methode eine praktische und skalierbare Plattform für eine umfassende Magengewebeanalyse bei Gesundheit und Krankheit.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde teilweise durch Fördermittel der National Institutes of Health R01 DK057061 (T.O.), R01 DK121766 (Y.H.), R01 DK126827 (T.O.), R01 DK131455 (T.O.) und P30 DK084567 (Epigenomics and Spatial Biology Core, Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology) unterstützt. Die Förderagenturen hatten keine Rolle bei der Studienplanung, Datenanalyse oder Manuskripterstellung. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren. Wir danken Dr. Darren J. Baker und Mitgliedern des Dr. Baker Laboratory (Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Mayo Clinic, Rochester, MN) für die gemeinsame Nutzung von Laborressourcen und technischer Unterstützung für die H&E-Färbung.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#5SF ZangeFEINE WISSENSCHAFTLICHE WERKZEUGE11252-00
Rinderserum Albumin SIGMA-ALDRICHA7906
ColdVision MC-LS LED-LichtquelleSCHOTTMC-LS
Konfokalsoftware NikonNikon NIS-Elements Bildgebungssoftware
Kryoseales XYLEpredida9312-4
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol, Dilaktat)Thermo Fisher ScientificD3571
Große DissektionsschalenLiving Systems  InstrumentierungSKU: DD-90
Esel-Anti-Ziegen-AF647 pAbLebenstechnologienA21447Los: 1739289 RRID:AB_2535864
Esel-Anti-Maus AF555 pAbLebenstechnologienA31570Los: 1774719 RRID:AB_2536180
Esel-Anti-Kaninchen AF488 pAbLebenstechnologienA21206Los: 2668665 RRID:AB_2535792
E-Cadharin (1:400 Verdünnung)BD Bioscience610181Los: 25510 RRID:AB_397580
EosinELITechGroup$SS-071C
Epoxidbeschichtete PinzettenFEINE WISSENSCHAFTLICHE WERKZEUGE11210-10
EthanolSIGMA-ALDRICH459828-4L
FLEXROHR 1,5 mlEppendorf22364111
MullschwämmeFisherscientific22-362-178
Gehärtete feine SchereFEINE WISSENSCHAFTLICHE WERKZEUGE14090-09
HämatoxylinEpredia7211
KIT (0,2 & Mikro; g/mL; 1:1000 Verdünnung)R& D-SystemeAF1356Los: IEO0217101 RRID: AB_354750
LINSENREINIGUNGSLÖSUNG 1 OZ SPRÜHFLASCHENikon77013066
MikroskopabdeckungsglasFisher Scientific12541016
Mikroskop-ObjektträgerCardinalHealthM6133A
Kleine PinsFEINE WISSENSCHAFTLICHE WERKZEUGE26002-20
MYH11 (1:400 Verdünnung)Biomedizinische TechnologienBT-562RRID:AB_10013421
NagellackSÜNDIGE FARBEN7.33855E+11
Nadel 30 G x 1/2 Zoll & nbspoon;BD Bioscience305106
ParaformaldehydSIGMA-ALDRICH158127-500G
Personna-Klingen mit einer SchneideThe Razor Blade Co.76247-652
ReadyProbes Maus-auf-Maus-IgG-Blockierungslösung (30x)Thermo Fisher ScientificR37621Los: 3226230
SlowFade Diamond Antifade Mountant (Montagemedien)Thermo Fisher ScientificS36972
StainTray 10 Folien-FärbesystemSimport ScientificM918-2
Stereomikroskop 0,8x-5xNikonSMZ645
Sucrose SIGMA-ALDRICHS9378-1KG
Oberflächenverstärker X-100 (Triton X)Thermo Fisher Scientific28314
TMEM16A (ANO1: 1:400 Verdünnung)Abcamab53212 Los: GP3295656-1 RRID: AB_883075
TransferpipetFalcon357575
TUBB3 (1:400 Verdünnung)Zell-Signaltechnik4466Los: 5 RRID: AB_1904176
Xylenes Fisher ScientificX3P-1GALLOS 206238

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chaudhry, S. R., Liman, M. N. P., Omole, A. E., Peterson, D. C. Anatomy, abdomen and pelvis: Stomach. , StatPearls. (2025).
  2. Sanders, K. M., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Baker, S. A. Ca(2+) dynamics in interstitial cells: Foundational mechanisms for the motor patterns in the gastrointestinal tract. Physiol Rev. 104 (1), 329-398 (2024).
  3. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  4. Li, S., You, S., Mao, K. Protocol for multiplex immunofluorescence imaging of mouse intestinal tumors. STAR Protoc. 6 (2), 103776(2025).
  5. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  6. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal Swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin-embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  7. Hayashi, Y., et al. Platelet-derived growth factor receptor-alpha regulates proliferation of gastrointestinal stromal tumor cells with mutations in KIT by stabilizing ETV1. Gastroenterology. 149 (2), 420-432.e16 (2015).
  8. Hayashi, Y., et al. TRP53-mediated cell cycle arrest of precursors underlies interstitial cell of Cajal depletion during aging. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 117-145 (2021).
  9. Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
  10. Gomez-Pinilla, P. J., et al. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1370-G1381 (2009).
  11. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl(-) secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  12. Uhlen, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).
  13. Uhlen, M., et al. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1920-1932 (2005).
  14. San Roman, A. K., Jayewickreme, C. D., Murtaugh, L. C., Shivdasani, R. A. Wnt secretion from epithelial cells and subepithelial myofibroblasts is not required in the mouse intestinal stem cell niche in vivo. Stem Cell Reports. 2 (2), 127-134 (2014).
  15. Drokhlyansky, E., et al. The human and mouse enteric nervous system at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1606-1622.e23 (2020).
  16. Jiang, Y., et al. Mapping and tracing Grem1(+) stromal cells in an Apc (Min/+) mouse utilizing cryopreserved intestinal sections prepared via modified Swiss-roll technique. iScience. 27 (11), 111173(2024).
  17. Izbeki, F., et al. Loss of Kitlow progenitors, reduced stem cell factor and high oxidative stress underlie gastric dysfunction in progeric mice. J Physiol. 588 (Pt 16), 3101-3117 (2010).
  18. Hayashi, Y., et al. Hyperglycemia increases interstitial cells of Cajal via MAPK1 and MAPK3 signaling to ETV1 and KIT, leading to rapid gastric emptying. Gastroenterology. 153 (2), 521-535.e20 (2017).
  19. Gao, F., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha stabilization restores epigenetic control of nitric oxide synthase 1 expression and reverses gastroparesis in female diabetic mice. Gastroenterology. 165 (6), 1458-1474 (2023).
  20. Kuro-o, M., et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature. 390 (6655), 45-51 (1997).

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