Der Nijmeger Hämostase-Assay: Gleichzeitige fluorogene Messung der Thrombin- und Plasminbildung in einem einzigen Bohrloch

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Nijmeger Hämostasis-Assay, der eine gleichzeitige, zeitaufgelöste Messung von Thrombin- und Plasminbildung ermöglicht, um eine integrierte Bewertung der Gerinnung und Fibrinolyse zu ermöglichen. Der Test zielt darauf ab, die Charakterisierung des hämostatischen Gleichgewichts in Forschung und klinischen Einrichtungen über den Rahmen konventioneller hämostatischer Tests hinaus zu verbessern.

Zusammenfassung

Thrombin und Plasmin spielen beide eine zentrale Rolle bei der Hämostase, indem sie Gerinnung bzw. Fibrinolyse regulieren. Konventionelle hämostatische Tests konzentrieren sich oft auf isolierte Komponenten oder begrenzte Phasen der Hämostase; Beispielsweise bewerten aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit und Prothrombin-Zeit nur den Beginn der Fibrinbildung, während Faktoraktivitätstests die Funktion einzelner Gerinnungsfaktoren bewerten. Obwohl wertvoll, fehlt ihnen es an einem umfassenden Überblick über den Gesamtprozess der sekundären Hämostase und Fibrinolyse, die sich dynamisch über die Zeit entfalten. Der Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) behebt diese Einschränkung, indem er eine gleichzeitige, zeitaufgelöste Messung der Thrombin- und Plasminbildung in einem einzelnen Mikroplattenbohrloch ermöglicht. Mit zwei synthetischen fluorogenen Substraten mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsspektren und ohne Kreuzreaktivität ermöglicht der Test eine genaue Quantifizierung beider Enzyme parallel. Die Hämostase wird in plättchenarmem Plasma mit Gewebefaktor, Calcium- und Gewebe-Plasminogenaktivator initiiert, und die Fluoreszenz wird alle 30 Sekunden über 70 Minuten bei 37 °C registriert. Enzymaktivitätskurven werden mithilfe von Kalibrierungsstandards erzeugt, aus denen Parameter wie Verzögerungszeit, Thrombinpotential, Fibrin-Lysezeit und Plasmin-Peakhöhe abgeleitet werden. Der Test erfasst zuverlässig die gleichzeitige Thrombin- und Plasminbildung mit guter intra- und inter-assay-Präzision und detektiert die Modulation der Gerinnung und Fibrinolyse durch Effektoren wie Heparin, aktiviertes Protein C und Epsilon-Aminocaproinsäure. In klinischen Proben wurde bei Patienten mit Koagulationsfaktormangel eine signifikant reduzierte Thrombinbildung beobachtet, während Patienten mit fibrinolytischen Störungen erhöhte Plasminbildungsprofile aufwiesen. Durch die Kombination von Messungen der Thrombin- und Plasmingenerierung bietet die NHA einen umfassenden Einblick in das hämostatische Gleichgewicht über konventionelle Tests hinaus. Dieser integrierte Ansatz birgt Potenzial für Forschung und klinische Anwendungen, wie etwa die Charakterisierung hämostatischer Phänotypen, die Bewertung von Blutungs- und thrombotischen Risiken sowie die Überwachung gezielter therapeutischer Interventionen. Dieses Protokoll beschreibt das NHA-Verfahren, das darauf abzielt, das Verständnis und die Bewertung des hämostatischen Gleichgewichts zu verbessern.

Einleitung

Die Hämostase ist das Ergebnis eines dynamischen Gleichgewichts zwischen Gerinnung und Fibrinolyse. Thrombin und Plasmin sind die wichtigsten Enzyme, die diese Prozesse antreiben: Thrombin wandelt Fibrinogen in Fibrin um, während Plasmin Fibrin abbaut, um Gerinnsel aufzulösen. Eine Störung dieses Gleichgewichts kann zu Blutungen oder thrombotischen Ereignissen führen ^1,2. Die Labortests, die zur Bewertung der Hämostase in der klinischen Praxis verwendet werden, konzentrieren sich jedoch typischerweise auf isolierte Schritte der Gerinnung oder Fibrinolyse, was nur begrenzte Einblicke in das hämostatische Gesamtgleichgewicht bietet. Bei Patienten mit vermuteter Blutungstendenz werden routinemäßige Screening-Tests wie Prothrombin-Zeit (PT) und aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit (aPTT) häufig eingesetzt, um auf Gerinnungsfaktordefizite zu screenen. Diese Assays messen jedoch die Zeit bis zur ersten Fibrinbildung und erfassen die Thrombinbildung nicht über den Gerinnungsbeginn hinaus, wo die physiologisch relevante Thrombinaktivität^{stattfindet 1,2,3}. Daher können sie bei Patienten mit leichten Gerinnungsfaktordefiziten 3,4,5,6,7,8 normale Ergebnisse liefern. Um diese spezifischen Mängel zu identifizieren, werden Gerinnungsfaktor-Aktivitätstests verwendet. Obwohl sie für die Diagnose informativ sind, bewerten diese Assays einzelne Proteine isoliert und spiegeln nicht das hämostatische Gesamtgleichgewicht wider. Daher korrelieren bei Patienten mit leichten Mängeln die Faktorwerte oft schlecht mit dem Blutungsphänotyp ^9,10. Dies erschwert die klinische Risikobewertung und die Optimierung des Patientenmanagements, einschließlich des Zeitpunkts und der Dosierung der Therapie sowie Interventionen als Reaktion auf thrombotische oder schwere hämorrhagische Ereignisse. Diese Einschränkungen verdeutlichen die Notwendigkeit von Analysen, die einen umfassenderen Überblick über den hämostatischen Prozess über die Zeit bieten und helfen können, die Lücke zwischen Laborergebnissen und klinischer Präsentation zu überbrücken.

Der Nijmeger Hemostasis Assay (NHA) wurde entwickelt, um diese Einschränkungen zu beheben, indem die gleichzeitige, zeitaufgelöste Messung von Thrombin- und Plasminerzeugung in plättchenarmem Plasma ^8,9 ermöglicht wurde. Es verwendet zwei synthetische fluorogene Substrate mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsspektren, um beide Enzyme in derselben Mikroplatte ohne Kreuzreaktivität zu quantifizieren. Enzymgenerierungskurven ermöglichen die Herleitung quantitativer Parameter, die die Dynamik der sekundären Gerinnung und Fibrinolyse widerspiegeln, einschließlich Verzögerungszeit, Thrombin-Peak-Höhe, Fibrin-Lysezeit und Plasmin-Peak-Höhe. Die NHA bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Thrombinerzeugungstests, wie dem Calibrated Automated Thrombogram (CAT), Ceveron s100 und ST Genesia, die wertvolle Informationen zur Thrombindynamik liefern, aber die fibrinolytische Aktivität 10,11,12,13 nicht bewerten. Gerinnenslyse erfasst wiederum Aspekte der Fibrinolyse, aber es fehlen Informationen zur Thrombingeneration¹⁴. Dies begrenzt ihre Nützlichkeit bei der Bewertung der komplexen Wechselwirkungen, die das hämostatische Gesamtgleichgewicht bestimmen. Während einige im Labor entwickelte Ansätze Thrombin- und Plasminerzeugungsmessungen kombinierten, erfordern diese typischerweise separate Bohrungen oder parallele Assays, was die zeitliche Ausrichtung und den^{Durchsatz von 15} begrenzt. Globale Assays wie Thromboelastographie (TEG) und Rotationsthromboelastometrie (ROTEM) liefern ergänzende Informationen, indem sie primäre Hämostase, sekundäre Koagulation und Fibrinolyse^16,17 erfassen. Strömungskammersysteme stellen einen weiteren aufkommenden, aber experimentellen Ansatz zur Bewertung der Gesamthämostase unter Strömungsbedingungen¹⁸. Obwohl diese globalen Assays einen breiteren physiologischen Kontext bieten, sind sie im Allgemeinen weniger empfindlich gegenüber leichten Blutungsstörungen 19,20,21. Durch die gleichzeitige Messung der Thrombin- und Plasminbildung in derselben Reaktion verbindet die NHA die Empfindlichkeit konventioneller TGAs mit der integrierten Sicht globaler Assays, was eine direkte Beurteilung der sekundären Hämostase, Fibrinolyse und deren Wechselwirkungen ermöglicht.

Thrombin-Erzeugungstests haben bereits großes Potenzial für translationale Anwendungen gezeigt, wie individuelle Blutungs- und thrombotische Risikoprofilierung sowie Therapieüberwachung 22,23,24,25. In der klinischen Forschung hat die NHA eine verminderte Thrombinbildung bei Patienten mit Hämophilie A, Hämophilie B und seltenen Koagulationsfaktordefiziten sowie erhöhte Plasminbildung bei hyperfibrinolytischen Erkrankungen wie α2-Antiplasminmangel 26,27,28,29 nachgewiesen. Unterschiede in beiden Signalwegen wurden auch bei Patienten mit Hypofibrinogenämie beobachtet, einer Erkrankung, die sowohl mit Blutungen als auch mit einem erhöhten Thromboserisiko einhergeht. In dieser Population korrelierten niedrigere Fibrinogenspiegel mit einer verminderten Plasminbildung, wahrscheinlich aufgrund des Fehlens von Plasminogenbindungsstellen, während Patienten mit Thrombose-Vorgeschichte eine erhöhte Thrombin-Generation³⁰ zeigten. Zusätzlich erkennt der Test die Wirkung therapeutischer Wirkstoffe, darunter Antikoagulanzien, Prokoagulantien und Antifibrinolytika⁸. In einer früheren Studie schlugen wir einen Standardisierungs- und Normalisierungsansatz vor, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern und den Vergleich von Ergebnissen über verschiedene Läufe und Labore hinweg zu ermöglichen – ein wesentlicher Schritt zur klinischen Implementierung²⁸. Dieses Protokoll beschreibt das vollständige Verfahren und den analytischen Ansatz der NHA für die Implementierung in klinischer Forschung oder translationalen Umgebungen.

Protokoll

Alle Verfahren mit humanen Plasmaproben wurden gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom medizinischen Ethikausschuss von Arnhem-Nimwegen genehmigt. Vor der Probenentnahme wurde von allen Spendern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt.

1. Herstellung von Puffern, Reagenzien und Plasmaproben

1. Pufferlösungen bereiten
   1. Wiege 1,2 g Tris (p.a.) und löse dich in 180 mL mit 0,9 % NaCl.
   2. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein.
   3. Bringen Sie das Endvolumen auf 200 mL mit 0,9 % NaCl, um einen 50 mM Tris-150 mM NaCl-Puffer (TBS) zu erhalten.
   4. Aliquot die TBS in zwei 50-mL-Röhren.
   5. Verwenden Sie die verbleibenden 100 ml TBS, um den calciumhaltigen Puffer vorzubereiten. Lösen Sie 7,34 g CaCl₂·2H₂O in 100 mL TBS auf, um einen Tris-NaCl-CaCl-2-Puffer (TBS-Ca, pH 7,4) zu erhalten.
   6. Aliquot TBS-Ca in zwei 50-mL-Röhren.
   7. Beide Puffer bei 4 °C aufbewahren und innerhalb einer Woche verwenden.
2. Bereite fluorogene Substrate vor
   1. Lösen Sie 53,2 mg des Thrombinsubstrats (Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC) in 4 ml Tris-NaCl-Puffer auf.
      HINWEIS: Die Box enthält ein Informationsblatt mit einem Analysezertifikat. Das zu hinzufügende Puffervolumen hängt von der angegebenen Konzentration ab und sollte so angepasst werden, dass 1 μL zugesetztes humanes Thrombin in 120 μL Reagenz eine Endkonzentration von 76 nmol/L ergibt.
   2. Aliquot 100 μL in Eppendorf-Röhren und bei −80 °C gespeichert.
   3. Tauen Sie einen Aliquot thrombin-spezifischen fluorogenen Substrats 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf, bevor Sie ihn verwenden. Vortex und während des Experiments auf Eis bleiben.
   4. Lösen Sie den Inhalt eines Fläschchens des Plasminsubstrats (CBZ-L-Phe-Arg-Rhodamin) in 1.955 μL DMSO auf.
      HINWEIS: Die Box enthält ein Informationsblatt mit einem Analysezertifikat. Das zu hinzufügende Puffervolumen hängt von der angegebenen Konzentration ab und sollte so angepasst werden, dass 1 μL zugesetztes menschliches Plasmin in 120 μL Reagenz eine Endkonzentration von 200 nmol/L ergibt.
   5. Aliquot 60 μL in Eppendorf-Röhren und bei −80 °C gelagert.
   6. Einen Aliquot des plasminspezifischen fluorogenen Substrats 10 Minuten bei Zimmertemperatur auftauen, bevor er verwendet wird. Vortex und während des Experiments auf Raumtemperatur halten.
      HINWEIS: Dieses Substrat ist in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und darf nicht abgekühlt werden, um Niederschlagung zu vermeiden.
3. Auslöserreagenzien bereiten
   1. Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Cephalin durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser. Vortex gründlich, bis er vollständig aufgelöst ist.
      HINWEIS: Cephalin wird rekonstituiert, um Phospholipide bereitzustellen, die für die Katalysierung mehrerer Gerinnungsreaktionen unerlässlich sind und so eine physiologisch relevante Gerinnung im Test ermöglichen.
   2. Aliquot 60 μL in Eppendorf-Röhren (ausreichend für 20 Bohrungen) und bei −20 °C gespeichert.
   3. Taue vor der Anwendung einen Aliquot auf und lasse es auf Eis. Vortex kurz, bevor er pipettert.
   4. Rekonstituierte den Inhalt eines Fläschchens mit rekombinantem menschlichem Gewebefaktor (TF) in 4 ml destilliertem Wasser.
   5. Aliquot 60 μL in Eppendorf-Röhren und bei −80 °C gelagert.
   6. Ein Aliquot von TF und Vortex kurz auftauen.
   7. Bereiten Sie eine 1:500-Verdünnung der TF durch sequentielle Verdünnung vor:
      1. Fügen Sie 6 μL TF zu 54 μL TBS-Puffer hinzu. Vortex.
      2. Nehmen Sie 6 μL dieser Verdünnung und addieren Sie 54 μL TBS. Vortex.
      3. Nehmen Sie 20 μL dieser zweiten Verdünnung und fügen Sie 80 μL TBS hinzu, um eine Endkonzentration von 0,28 pM zu erreichen. Vortex.
   8. Rekonstituieren Sie den Inhalt eines Fläschchens (20 mg) des Gewebetyp-Plasminogenaktivators (tPA) in 20 ml destilliertem Wasser, um eine Endkonzentration von 580.000 IU/mL zu erhalten (batchspezifische Konzentration überprüfen).
   9. Aliquot 50 μL in Eppendorf-Röhren und bei −80 °C gelagert.
   10. Kurzzeitig ein Aliquot von tPA und Vortex auftauen.
   11. Bereiten Sie eine Verdünnung von tPA von 1:50 vor, indem Sie 20 μL tPA zu 980 μL Tris-NaCl-Puffer hinzufügen, wobei eine Endkonzentration von 11.600 IU/mL erreicht wird. Vortex.
4. Plasmaproben bereiten
   1. Sammeln Sie venöses Blut in 3-ml-Citratröhren mit 3,2 % Citrat und stellen Sie sicher, dass mindestens 2,7 ml (90 % Füllung) gesammelt werden.
   2. Verwenden Sie nicht den ersten Tube nach der Venenpunktion; Entsorgen Sie es, um eine Aktivierung durch den Tissue Factor zu vermeiden.
   3. Drehen Sie das Rohr mindestens 10 Mal unmittelbar nach dem Sammeln um.
   4. Zentrifugiere innerhalb von 2 Stunden bei Raumtemperatur, zuerst mit 2.500 g × g für 5 Minuten, gefolgt von 10.000 g × g für 10 Minuten.
   5. Verwenden Sie eine Einwegpipette, um das Plasma direkt über der Zellschicht aufzufangen.
   6. Aliquot-Plasma in beschriftete Kryovialen, mit Schnellfrieren in flüssigem Stickstoff und bei −80 °C lagern.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Probe frei von Gerinnseln ist. Verwenden Sie nur frisches oder einmal aufgetautes Plasma. Eine CTAD-Röhre reicht für eine doppelte Analyse aus.

2. Instrumentenvorbereitung und Softwareeinrichtung

1. Bereiten Sie den Fluoreszenzplattenleser vor
   1. Schalten Sie den Kennzeichenleser ein und lassen Sie ihn auf 37 °C ausgleichen.
   2. Setzen Sie die folgenden Grundparameter:
      1. Greiner 96 – Brunnen, flacher Boden, schwarz.
      2. Allgemeine Einstellungen: Positionierungsverzögerung: 0,1 s; Anzahl der kinetischen Fenster: 1.
      3. Kinetisches Fenster: Anzahl der Zyklen: 140; Messungsbeginn: 0,0 s; Anzahl der Flashes pro Bohrloch und Zyklus: 10; Zykluszeit: 30 Sekunden.
      4. Optik: Obere Optik
      5. Filtereinstellungen: Anzahl der Monochromaten: 2. Anregungsfilter: 355 nm für Thrombin; 485 nm für Plasmin. Emissionsfilter: 460 nm für Thrombin, 520 nm für Plasmin. Gewinn: 600.
   3. Definieren Sie das Layout mit maximal 20 Brunnen pro Platte.
   4. Navigiere zu Konzentrationen/Volumen/Schütteln und überprüfe die folgenden Einstellungen. Pumpe 1 = 20 μL; Pumpe 2 = 0 μL; Geschwindigkeit = 420 μL/s.
2. Bereiten Sie das Einspritzsystem vor.
   1. Entferne und spüle die Injektionsnadeln in einem Behälter mit Puffer.
   2. Stellen Sie das Spülvolumen auf 2.500 μL ein und spülen Sie die Pumpen mit 37 °C Tris/NaCl-Puffer.
   3. Setzen Sie das Spülvolumen auf 500 μL zurück.

3. Assay-Einrichtung im Mikroplattenformat

1. Mikroplatten-Schütter-Aufbau
   1. Stellen Sie den Mikroplatten-Shaker auf 37 °C ein und überprüfen Sie die Temperatur vor der Benutzung.
   2. Stelle die Schüttelintensität auf 1100 U/min ein.
   3. Verwenden Sie diesen Shaker für alle Mischschritte im Assay, um eine homogene Verteilung der Reagenzien und eine gleichmäßige enzymatische Aktivität sicherzustellen.
2. Fügen Sie den Bohrlöchern Reagenzien hinzu
   1. Taue Patientenplasma und normales Pool-Plasma (NPP) in einem 37 °C Wasserbad für bis zu 10 Minuten auf.
   2. Gründlich mischen und vollständiges Auftauen überprüfen (kein Kryoprecipitat).
   3. Fügen Sie 80 μL Patientenplasma oder NPP zu den vorausgewählten Bohrungen hinzu. Verwenden Sie für jede Probe eine frische Pipettenspitze.
      HINWEIS: Fügen Sie bei jedem Assay eine NPP-Probe ein, um die Variabilität zwischen den Durchläufen zu berücksichtigen (siehe weiter in Schritt 5.6).
   4. Füge 2 μL Cephalin hinzu.
   5. Fügen Sie 2 μL Gewebefaktor hinzu (1:500 Verdünnung). Mischen Sie kurz mit einem Tellerschütter.
   6. Fügen Sie 10 μL Tris-NaCl-Puffer hinzu. Mischen Sie kurz mit einem Tellerschütter.
   7. Gib 4 μL Thrombin-Substrat hinzu.
   8. Gib 2 μL Plasminsubstrat hinzu. Mischen Sie kurz mit einem Tellerschütter.
3. Vor der Brüt
   1. Stecken Sie die Mikroplatte in den Plattenleser.
   2. Lassen Sie die Platte mehrere Minuten bei 37 °C im Gleichgewicht bleiben.

4. Herstellung und Injektion des Ausgangsreagenzes

1. Bereite das Reagenz für Pumpe 1 vor
   1. Kombiniert man 672 μL Tris/NaCl-Puffer, 192 μL Tris/NaCl/CaCl₂-Puffer und 96 μL tPA (ab Schritt 1.2.5). Vortex gründlich.
   2. Stiche zwei Löcher in die Kappe des Reagenzrohrs.
   3. Führe das Pumpenrohr durch ein Loch an den Boden des Rohrs.
2. Grundieren und den Assay starten
   1. Benutze die Software, um die Pumpe mit 500 μL des Reagens zu primen.
   2. Setzen Sie die Injektionsnadeln wieder an ihre vorgesehenen Positionen ein.
   3. Beginnen Sie sofort mit der Fluoreszenzmessung.
3. Manuelle Einleitung des Tests
   HINWEIS: Dieses manuelle Initiierungsverfahren bietet eine Alternative zum automatisierten Injektionsworkflow, wie in den Schritten 2.2, 4.1 und 4.2 beschrieben.
   1. Bereiten Sie das Startreagenz wie in 4.1.1 beschrieben unmittelbar vor der Anwendung vor.
   2. Entfernen Sie die Mikroplatte vom Plattenleser und geben Sie schnell 20 μL des Anfangsreagens manuell in jede Mulde mit einer kalibrierten oder Mehrkanalpipette für eine schnellere Handhabung.
   3. Geben Sie die Platte sofort zurück zum Leser und beginnen Sie die Fluoreszenzmessung ohne Verzögerung.
      HINWEIS: Minimieren Sie die Zeit zwischen der Zugabe des Reagenzens und dem Messbeginn (<10 s pro Reihe), um die Variabilität zu verringern.
4. Kinetische Anzeige
   1. Alle 30 Sekunden Fluoreszenz für 70 Minuten aufzeichnen.
   2. Halten Sie die Platte während der Messung bei 37 °C.

5. Datenanalyse

1. Bereiten Sie die Daten für die Analyse vor.
   1. Exportieren Sie die kinetischen Fluoreszenzdaten vom Plattenleser als Tabelle mit Zeitpunkten und Fluoreszenzwerten pro Bohrloch.
   2. Wandeln Sie die rohen Fluoreszenzdaten in Enzymgenerierungskurven um, indem Sie die erste Ableitung mit Excel oder einem anderen Programm berechnen.
   3. Zeichnen Sie die Enzymgenerierungskurven für jedes Bohrloch, um die enzymatische Reaktion zu visualisieren.
      HINWEIS: Diese Kurven stellen die Rate der Thrombin- oder Plasminbildung über die Zeit dar und entsprechen den grafischen Ausgaben in den Abbildungen.
2. Thrombin-Generierungskurven analysieren
   1. Identifizieren Sie die folgenden Parameter aus der Thrombin-Erzeugungskurve (siehe Abbildung 1):
      1. Verzögerungszeit: Der Zeitpunkt, an dem die Thrombingenerierungskurve konstant ansteigt und 8 % der Thrombinspitzenhöhe erreicht.
      2. Thrombin-Spitzenhöhe: Der maximale Signalwert auf der y-Achse (d. h. maximale Thrombin-Erzeugungsrate).
      3. Thrombin-Peak-Zeit: Die Zeit vom Beginn des Tests bis zur Thrombin-Peak-Höhe.
      4. Thrombinpotenzial (Fläche unter der Thrombin-Erzeugungskurve): Die Fläche unter der Kurve von der Verzögerungszeit bis zur Rückkehr des Thrombinsignals zum Ausgangswert.
         HINWEIS: Das Thrombinpotenzial spiegelt die gesamte thrombinerzeugende Kapazität der Probe unter Prüfbedingungen wider.
3. Analyse von Plasmingenerierungskurven
   1. Identifizieren Sie die folgenden Parameter aus der Plasmin-Erzeugungskurve (siehe Abbildung 2):
      1. Fibrin-Lysezeit: Die Zeit vom Beginn der Plasminbildung (d. h. dem Zeitpunkt, an dem die Plasmin-Erzeugungskurve konstant ansteigt und 8 % der Plasmin-Peak-Höhe erreicht) bis zu dem Punkt, an dem der Plasmin-Peak erreicht wird.
      2. Plasmin-Peak-Höhe: Das erste deutliche Maximum in der Kurve, das dem initialen Burst bei der Plasminerzeugung entspricht, wird an dem Punkt bestimmt, an dem die zweite Ableitung der Plasminerzeugungskurve (basierend auf einem dreiminütigen gleitenden Durchschnitt) nach Beginn der Plasminerzeugung null erreicht.
      3. Plasminpotenzial (Fläche unter der Plasmin-Erzeugungskurve): Die Fläche unter der Kurve vom Beginn der Plasminerzeugung bis zum Zeitpunkt des Plasmin-Peaks.
         HINWEIS: Signalfluktuationen treten nach dem anfänglichen Plasmin-Peak auf und sind in der Analyse der Plasmingenerierungsparameter nicht enthalten.
4. Parameter manuell oder mit eigener Software extrahieren
   1. Verwenden Sie Microsoft Excel, GraphPad Prism oder ein benutzerdefiniertes Skript (z. B. in Python oder R), um kinetische Parameter zu extrahieren.
   2. Speichere die Rohdaten, dargestellten Kurven und berechneten Parameter in einem strukturierten Format für Archivierung und zukünftige Referenz.
      HINWEIS: Wenn Sie Makros verwenden, überprüfen Sie die Korrektheit aller Parameter visuell und manuell, bevor Sie sich auf automatisierte Ausgaben verlassen. Unser Makro zur Datenkonvertierung ist auf Anfrage verfügbar.
5. Standardisierung und Normalisierung
   1. Stellen Sie eine physiologische Referenz her, indem Sie 40 einzelne Proben gesunder Spender parallel zur für die Normalisierung verwendeten NPP-Probe messen. Führen Sie diesen Schritt einmal pro NPP-Charge aus.
   2. Berechnen Sie die mittleren Thrombin- und Plasmingenerierungsparameter der gesunden Spender und bestimmen Sie ihr Verhältnis zu den entsprechenden NPP-Werten, die im selben Durchlauf erhalten wurden.
   3. Für jede Patientenprobe in einem gegebenen Durchlauf wird zunächst der Thrombin- oder Plasmingenerierungsparameter auf den im selben Durchlauf gemessenen NPP-Wert normalisiert.
   4. Teilen Sie dieses Ergebnis durch das zuvor für dieselbe NPP-Charge festgelegte gesunde Spender-zu-NPP-Quote (siehe Schritt 5.6.2). Dies ergibt einen relativen Wert, der auf das durchschnittlich gesunde Individuum normalisiert wird, mit Standardisierung für Variationen zwischen den Durchläufen mittels NPP.
   5. Formulieren Sie Parameterwerte als Prozentsätze relativ zum Durchschnittswert gesunder Personen (definiert als 100 %). Zeigen Sie die Patientenprobenergebnisse entsprechend vor.
      HINWEIS: Die relativen Parameterwerte für jede einzelne Patientenprobe werden mit folgender Formel berechnet, wobei Lauf a den Messlauf der Patientenprobe und Lauf b den Referenzlauf bezeichnet, bei dem gesunde Spenderproben parallel zur gleichen NPP-Charge gemessen wurden. Unsere Excel-Datei mit den Berechnungen zur Datennormalisierung ist auf Anfrage verfügbar.
      

6. Erzeugung von Kalibrierungskurven

1. Bereite die Thrombin-Kalibrierungskurve vor
   1. Rekonstituieren Sie das lyophilisierte menschliche α-Thrombin, wie im Datenblatt des Herstellers angegeben.
      HINWEIS: Wenn das Datenblatt beispielsweise eine Rekonstitution in 100 μL Wasser auf 3,34 mg/mL angibt, entspricht dies 0,334 mg in 100 μL.
   2. Verdünne das rekonstituierte Thrombin um 1:10 im Tris/NaCl-Puffer.
      HINWEIS: Dies ergibt eine Lagerkonzentration von etwa 9,1 nmol/mL (0,0091 nmol/μL), basierend auf einem Molekulargewicht von 36.700 g/mol.
   3. Bereiten Sie eine Verdünnungsserie im Tris/NaCl-Puffer vor, um die endgültigen Thrombinkonzentrationen im Test von 0 bis 152 nmol/L zu erreichen.
   4. Pipette in ausgewählte Bohrungen, die bereits einen Puffer enthalten, um ein Gesamtvolumen von 100 μL pro Bohrloch zu erreichen.
   5. Bereite die Substratlösung für Pumpe 1 vor, indem du 300 μL Tris/NaCl-Puffer mit 200 μL Thrombinsubstrat aus Schritt 1.2.2 mischst.
   6. Verdünnen Sie diese Lösung weiter, indem Sie 400 μL des Gemisch mit 360 μL Tris/NaCl-Puffer kombinieren.
   7. Fügen Sie jedem Kalibrierungsbrunnen 20 μL dieser Substratmischung hinzu, sodass das gesamte Assay-Volumen auf 120 μL steigt.
   8. Rühren Sie die Platte vorsichtig und setzen Sie sie in den Plattenleser. Führen Sie den kinetischen Test 25 Zyklen lang durch, wobei Sie die gleichen Fluoreszenzeinstellungen wie in Abschnitt 2 beschrieben verwenden.
   9. Exportieren Sie die rohen Fluoreszenzdaten und bestimmen Sie die anfängliche Steigung (Rate der Fluoreszenzzunahme pro Zyklus) für jede Thrombinkonzentration mit GraphPad Prism oder ähnlicher Software.
   10. Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Anfangsneigung im Vergleich zur Thrombinkonzentration darstellen.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Puffer auf 37 °C vorgeheizt sind und Enzyme auf Eis behandeln. Bereiten Sie immer frische Verdünnungen vor und vermischen Sie gründlich. Die resultierende Standardkurve wird verwendet, um die relative Thrombinaktivität in unbekannten Stichproben anhand des in Abschnitt 5 beschriebenen Makros zu berechnen.
2. Vorbereitung der Plasmin-Kalibrierungskurve
   1. Glyophilisiertes Plasmin wird in destilliertem Wasser (z. B. 0,543 mL) gemäß den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert.
      HINWEIS: Plasmin hat ein Molekulargewicht von 75.400 g/mol. Die resultierende Lagerkonzentration beträgt etwa 24,3 nmol/mL (0,024 nmol/μL), bei der Annahme von 1 mg in 0,543 mL.
   2. Bereiten Sie eine Verdünnungsserie im Tris/NaCl-Puffer vor, um die endgültigen Plasminkonzentrationen im Test von 66 bis 532 nmol/L zu erreichen.
   3. Pipettiere Plasmin in Bohrungen mit Tris/NaCl-Puffer, um ein Endvolumen von 100 μL pro Bohrloch zu erreichen.
   4. Bereite die Substratlösung für Pumpe 1 vor, indem du 680 μL Tris/NaCl-Puffer mit 80 μL Plasmin/Rhodamin Substrat (vorverdünnt 1:1, falls erforderlich) aus Schritt 1.2.5 mischst.
   5. Fügen Sie jedem Kalibrierungsbrunnen 20 μL dieser Substratlösung hinzu, sodass das Gesamtvolumen auf 120 μL steigt.
   6. Rühren Sie die Platte vorsichtig und setzen Sie sie in den Plattenleser. Führen Sie den kinetischen Test 25 Zyklen lang mit denselben Fluoreszenzeinstellungen durch, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
   7. Exportieren Sie die rohen Fluoreszenzdaten und bestimmen Sie die anfängliche Steigung des Fluoreszenzanstiegs für jede Plasminkonzentration, indem Sie eine lineare Regression auf die lineare Phase der kinetischen Kurve mit GraphPad Prism oder ähnlicher Software anwenden.
   8. Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die anfängliche Steigung im Vergleich zur Plasminkonzentration darstellen.
      HINWEIS: Aufgrund von Charge-zu-Charge-Unterschieden in der Plasminaktivität sollte die Kalibrierung bei jedem neuen Charge wiederholt werden. Bei unerwartet hoher Aktivität wird eine 1:2-Verdünnung des Stocks empfohlen, bevor die Kalibrierungsreihe vorbereitet wird.
3. Verwenden Sie die Kalibrierungskurve zur Quantifizierung
   1. Verwenden Sie die in Abschnitt 6 erzeugten Kalibrierungskurven, um Fluoreszenz-Steigungswerte in relative Enzymaktivität umzuwandeln.
   2. Verwenden Sie nur den linearen Teil der Kalibrierungskurve zur Interpolation unbekannter Stichproben.

Ergebnisse

Repräsentative Thrombin- und Plasmin-Generierungskurven, die mit dem Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) erhalten wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Signalintensität jeder Kurve wird als Prozentsatz relativ zur gleichzeitig gemessenen normalen Pooled Plasma (NPP)-Probe angegeben. Eine Probe mit NPP wird bei jedem Durchlauf als interne Kontrolle einbezogen, um die Gültigkeit des Tests zu überprüfen und die Vergleichbarkeit zwischen den Durchläufen siche...

Diskussion

Der Nijmeger Hemostasis-Assay (NHA) ist ein fluorogener Zwei-Enzym-Test, der die gleichzeitige, zeitaufgelöste Messung der Thrombin- und Plasminbildung in plättchenarmem Plasma ermöglicht. Durch die Erfassung beider Prozesse in einem einzigen Bohrloch ermöglicht die Methode eine hochauflösende kinetische Analyse der sekundären Hämostase und Fibrinolyse. Diese doppelte Messung bietet deutliche methodische Vorteile gegenüber herkömmlichen Tests und wurde erfolgreich in der Untersuchung von...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Materialien
Calciumchloriddihydrat (CaCl2,2H2O)	Merck	1.02382
Cephalin (C.K. Prest 5 APTT Reagenzkit)	Stago	00847	Stabil für 6 Monate bei -20 °C.
Destilliertes Wasser			Notieren Sie das Eröffnungsdatum. Verwenden Sie es innerhalb eines Tages nach der ersten Öffnung.
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	1.02950.0500
Menschliches Alpha-Thrombin	Enzymforschungslabore	HT 1002a	Die Kiste enthält ein Informationsblatt mit einem Analysezertifikat. Das zu addierende Puffervolumen hängt von der angegebenen Konzentration ab und sollte so angepasst werden, dass 1 & Mikro; L des menschlichen Thrombins im Jahr 120 & Mikro; Das L-Reagenz ergibt eine Endkonzentration von 76 nmol/L.
Menschliches Plasmin	Enzymforschungslabore	HPlas	Die Kiste enthält ein Informationsblatt mit einem Analysezertifikat. Das zu addierende Puffervolumen hängt von der angegebenen Konzentration ab und sollte so angepasst werden, dass 1 & Mikro; L des hinzugefügten menschlichen Plasmins in 120 & Mikro; Das L-Reagenz führt zu einer Endkonzentration von 200 nmol/L.
Normales pooliertes Plasma	Interne Vorbereitung	Nicht anwendbar	Nach dem Auftauen stabil für 3 Stunden, wenn sie auf Eis gelegt wird.
Patientenplasma	Nicht anwendbar	Nicht anwendbar
Plasmin-Substrat (CBZ-L-phenylalanyl-L-Arginin-Amid)-Rhodamin-Morfolin-Harnstoff	Symeres		Stabil für 6 Monate bei -80 °C.
Rekombinanter humaner Gewebefaktor (TF): Innovin	Dade Behring	B4212	Stabil für 6 Monate bei -80 °C.
Rekombinanter Gewebetyp-Plasminogenaktivator (tPA): Alteplase/Actilyse	Boehringer Ingelheim		Stabil für 12 Monate bei -80 μ°C.
Tris(Hydroxylmethyl)Aminomethan (H2NC(CH2OH)3)	Merck	1.08382.2500
Tris-NaCl-Puffer, pH 7,4 (TBS)	Interne Vorbereitung	Nicht anwendbar
Tris-NaCl-CaCl2 Puffer, pH 7,4 (TBS-Ca)	Interne Vorbereitung	Nicht anwendbar
Thrombinsubstrat Bz-beta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-methylcoumarin	Symeres		Stabil für 6 Monate bei -80 °C.
Ausrüstung
Fluostar Optima Fluorimeter / Mikroplattenleser mit Temperaturregelung und Reagenzieninjektoren	BMG Labtech
96-Well-Mikrotiterplatte, Polystyrol, flacher Boden, schwarz, mittlere Bindefläche (Microlon-Äquivalent)	Greiner BIO-ONE	655076
Analytische Bilanz (Top-Load-Balance)
Blaue Pipettenspitzen (für 100-1000 & Mikro; L)
Citrat-Blutentnahmeröhrchen 3 ml (3,2 % Citrat)	BD Vacutainer
Eiskübel
Eismaschine
Inkubator / Mikroplattenschüttler
Magnetischer Rührer
Mikrozentrifugenröhrengestell
Mikrozentrifugenröhren, schließbar
pH-Meter
Pipettenspitzen 0,1-10 & Mikro; L, nicht steril
Pipetten (2, 10, 20, 100 und 1000 & Mikro; L)
Schraubenzieher (als Sonde verwendet)
Röhrenmischer
Wasserbad
Gelbe Pipettenspitzen (für 20-200 und Mikro; L)