Der Nijmeger Hämostase-Assay: Gleichzeitige fluorogene Messung der Thrombin- und Plasminbildung in einem einzigen Bohrloch

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Nijmeger Hämostasis-Assay, der eine gleichzeitige, zeitaufgelöste Messung von Thrombin- und Plasminbildung ermöglicht, um eine integrierte Bewertung der Gerinnung und Fibrinolyse zu ermöglichen. Der Test zielt darauf ab, die Charakterisierung des hämostatischen Gleichgewichts in Forschung und klinischen Einrichtungen über den Rahmen konventioneller hämostatischer Tests hinaus zu verbessern.

Abstract

Thrombin und Plasmin spielen beide eine zentrale Rolle bei der Hämostase, indem sie Gerinnung bzw. Fibrinolyse regulieren. Konventionelle hämostatische Tests konzentrieren sich oft auf isolierte Komponenten oder begrenzte Phasen der Hämostase; Beispielsweise bewerten aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit und Prothrombin-Zeit nur den Beginn der Fibrinbildung, während Faktoraktivitätstests die Funktion einzelner Gerinnungsfaktoren bewerten. Obwohl wertvoll, fehlt ihnen es an einem umfassenden Überblick über den Gesamtprozess der sekundären Hämostase und Fibrinolyse, die sich dynamisch über die Zeit entfalten. Der Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) behebt diese Einschränkung, indem er eine gleichzeitige, zeitaufgelöste Messung der Thrombin- und Plasminbildung in einem einzelnen Mikroplattenbohrloch ermöglicht. Mit zwei synthetischen fluorogenen Substraten mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionsspektren und ohne Kreuzreaktivität ermöglicht der Test eine genaue Quantifizierung beider Enzyme parallel. Die Hämostase wird in plättchenarmem Plasma mit Gewebefaktor, Calcium- und Gewebe-Plasminogenaktivator initiiert, und die Fluoreszenz wird alle 30 Sekunden über 70 Minuten bei 37 °C registriert. Enzymaktivitätskurven werden mithilfe von Kalibrierungsstandards erzeugt, aus denen Parameter wie Verzögerungszeit, Thrombinpotential, Fibrin-Lysezeit und Plasmin-Peakhöhe abgeleitet werden. Der Test erfasst zuverlässig die gleichzeitige Thrombin- und Plasminbildung mit guter intra- und inter-assay-Präzision und detektiert die Modulation der Gerinnung und Fibrinolyse durch Effektoren wie Heparin, aktiviertes Protein C und Epsilon-Aminocaproinsäure. In klinischen Proben wurde bei Patienten mit Koagulationsfaktormangel eine signifikant reduzierte Thrombinbildung beobachtet, während Patienten mit fibrinolytischen Störungen erhöhte Plasminbildungsprofile aufwiesen. Durch die Kombination von Messungen der Thrombin- und Plasmingenerierung bietet die NHA einen umfassenden Einblick in das hämostatische Gleichgewicht über konventionelle Tests hinaus. Dieser integrierte Ansatz birgt Potenzial für Forschung und klinische Anwendungen, wie etwa die Charakterisierung hämostatischer Phänotypen, die Bewertung von Blutungs- und thrombotischen Risiken sowie die Überwachung gezielter therapeutischer Interventionen. Dieses Protokoll beschreibt das NHA-Verfahren, das darauf abzielt, das Verständnis und die Bewertung des hämostatischen Gleichgewichts zu verbessern.

Introduction

Die Hämostase ist das Ergebnis eines dynamischen Gleichgewichts zwischen Gerinnung und Fibrinolyse. Thrombin und Plasmin sind die wichtigsten Enzyme, die diese Prozesse antreiben: Thrombin wandelt Fibrinogen in Fibrin um, während Plasmin Fibrin abbaut, um Gerinnsel aufzulösen. Eine Störung dieses Gleichgewichts kann zu Blutungen oder thrombotischen Ereignissen führen ^1,2. Die Labortests, die zur Bewertung der Hämostase in der klinischen Praxis verwendet werden, konzentrieren sich jedoch typischerweise auf isolierte Schritte der Gerinnung oder Fibrinolyse, was nur begrenzte Ein....

Protocol

Alle Verfahren mit humanen Plasmaproben wurden gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom medizinischen Ethikausschuss von Arnhem-Nimwegen genehmigt. Vor der Probenentnahme wurde von allen Spendern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt.

1. Herstellung von Puffern, Reagenzien und Plasmaproben

1. Pufferlösungen bereiten
   1. Wiege 1,2 g Tris (p.a.) und löse dich in 180 mL mit 0,9 % NaCl.
   2. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein.
   3. Bringen Sie das Endvolumen auf 200 mL mit 0,9 % NaCl, um einen 50 mM Tris-150 mM NaCl-Puffer (TBS) zu....

Results

Repräsentative Thrombin- und Plasmin-Generierungskurven, die mit dem Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) erhalten wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Signalintensität jeder Kurve wird als Prozentsatz relativ zur gleichzeitig gemessenen normalen Pooled Plasma (NPP)-Probe angegeben. Eine Probe mit NPP wird bei jedem Durchlauf als interne Kontrolle einbezogen, um die Gültigkeit des Tests zu überprüfen und die Vergleichbarkeit zwischen den Durchläufen siche.......

Discussion

Der Nijmeger Hemostasis-Assay (NHA) ist ein fluorogener Zwei-Enzym-Test, der die gleichzeitige, zeitaufgelöste Messung der Thrombin- und Plasminbildung in plättchenarmem Plasma ermöglicht. Durch die Erfassung beider Prozesse in einem einzigen Bohrloch ermöglicht die Methode eine hochauflösende kinetische Analyse der sekundären Hämostase und Fibrinolyse. Diese doppelte Messung bietet deutliche methodische Vorteile gegenüber herkömmlichen Tests und wurde erfolgreich in der Untersuchung von.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materialien
Calciumchloriddihydrat (CaCl2,2H2O)	Merck	1.02382
Cephalin (C.K. Prest 5 APTT Reagenzkit)	Stago	00847	Stabil für 6 Monate bei -20 °C.
Destilliertes Wasser			Notieren Sie das Eröffnungsdatum. Verwenden Sie es innerhalb eines Tages nach der ersten Öffnung.
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	1.02950.0500
Menschliches Alpha-Thrombin	Enzymforschungslabore	HT 1002a	Die Kiste enthält ein Informationsblatt mit einem Analysezertifikat. Das zu addierende Puffervolumen hängt von der angegebenen Konzentration ab und sollte so angepasst werden, dass 1 & Mikro; L des menschlichen Thrombins im Jahr 120 & Mikro; Das L-Reagenz ergibt eine Endkonzentration von 76 nmol/L.
Menschliches Plasmin	Enzymforschungslabore	HPlas	Die Kiste enthält ein Informationsblatt mit einem Analysezertifikat. Das zu addierende Puffervolumen hängt von der angegebenen Konzentration ab und sollte so angepasst werden, dass 1 & Mikro; L des hinzugefügten menschlichen Plasmins in 120 & Mikro; Das L-Reagenz führt zu einer Endkonzentration von 200 nmol/L.
Normales pooliertes Plasma	Interne Vorbereitung	Nicht anwendbar	Nach dem Auftauen stabil für 3 Stunden, wenn sie auf Eis gelegt wird.
Patientenplasma	Nicht anwendbar	Nicht anwendbar
Plasmin-Substrat (CBZ-L-phenylalanyl-L-Arginin-Amid)-Rhodamin-Morfolin-Harnstoff	Symeres		Stabil für 6 Monate bei -80 °C.
Rekombinanter humaner Gewebefaktor (TF): Innovin	Dade Behring	B4212	Stabil für 6 Monate bei -80 °C.
Rekombinanter Gewebetyp-Plasminogenaktivator (tPA): Alteplase/Actilyse	Boehringer Ingelheim		Stabil für 12 Monate bei -80 μ°C.
Tris(Hydroxylmethyl)Aminomethan (H2NC(CH2OH)3)	Merck	1.08382.2500
Tris-NaCl-Puffer, pH 7,4 (TBS)	Interne Vorbereitung	Nicht anwendbar
Tris-NaCl-CaCl2 Puffer, pH 7,4 (TBS-Ca)	Interne Vorbereitung	Nicht anwendbar
Thrombinsubstrat Bz-beta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-methylcoumarin	Symeres		Stabil für 6 Monate bei -80 °C.
Ausrüstung
Fluostar Optima Fluorimeter / Mikroplattenleser mit Temperaturregelung und Reagenzieninjektoren	BMG Labtech
96-Well-Mikrotiterplatte, Polystyrol, flacher Boden, schwarz, mittlere Bindefläche (Microlon-Äquivalent)	Greiner BIO-ONE	655076
Analytische Bilanz (Top-Load-Balance)
Blaue Pipettenspitzen (für 100-1000 & Mikro; L)
Citrat-Blutentnahmeröhrchen 3 ml (3,2 % Citrat)	BD Vacutainer
Eiskübel
Eismaschine
Inkubator / Mikroplattenschüttler
Magnetischer Rührer
Mikrozentrifugenröhrengestell
Mikrozentrifugenröhren, schließbar
pH-Meter
Pipettenspitzen 0,1-10 & Mikro; L, nicht steril
Pipetten (2, 10, 20, 100 und 1000 & Mikro; L)
Schraubenzieher (als Sonde verwendet)
Röhrenmischer
Wasserbad
Gelbe Pipettenspitzen (für 20-200 und Mikro; L)