Methodenartikel

Ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung von Keimlinien-Chimäre bei Huhn durch eine Primordiale Keimzelltransplantation

DOI:

10.3791/69704

⸱

5. Dezember 2025

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vogelkeimbahn-Chimären, die durch die Transplantation von urzeitlichen Keimzellen (PGCs) in Empfängerembryonen entstehen, ermöglichen Anwendungen in der Transgenese, Gen-Editierung und Artenschutz. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für PGC-Isolierung, In-vitro-Expansion , Mikroinjektion und Spenderverifizierung und bietet eine zuverlässige Plattform für die Erzeugung von Keimlinien-Chimären und die Weiterentwicklung der Vogelbiotechnologie.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Entstehung von Keimbahn-Chimären bei Hühnern durch Transplantation von primordialen Keimzellen (PGCs) bietet eine robuste und reproduzierbare Grundlage für die Vogeltransgenese, Genom-Editierung und Artenschutz. Traditionelle Ansätze mit blastodermalen Zellen aus EGK-Embryonen im Stadium X sind durch eine geringe Keimbahnübertragungseffizienz aufgrund früher Zellliniensegregation eingeschränkt. Im Gegensatz dazu nutzen PGC-vermittelte Strategien die intrinsische Keimbahnkompetenz dieser unipotenten Zellen und ermöglichen so eine zuverlässige Integration in Empfängergonaden. Hier präsentieren wir ein stufenweises Protokoll zur Isolierung von PGCs aus HH-Embryonen im Stadium 26-28, deren Pflege und Erweiterung in vitro sowie zur Transplantation in die dorsale Aorta von HH-Staien 14-17 Empfängerembryonen. Die kurzfristige Engraftment wird mit fluoreszierenden Markern wie PKH26 überwacht, während der langfristige Keimbahnbeitrag durch PCR-Analyse der Empfängergonaden bestätigt wird. Dieser Ansatz gewährleistet eine konsistente Erzeugung von Keimbahn-Chimären und erhält gleichzeitig die Lebensfähigkeit und funktionelle Kompetenz der Spender-PGCs. Darüber hinaus ist die Methode kompatibel mit Genom-Editierungswerkzeugen wie CRISPR/Cas9 und transposonbasierten Vektoren, was die Erstellung transgener und gen-editierter Vogelmodelle ermöglicht. Über die Grundlagenforschung hinaus unterstützt diese Strategie Naturschutzmaßnahmen durch interspezifische Keimlinienübertragung und den Erhalt genetischer Ressourcen. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen umfassenden und zuverlässigen Rahmen zur Manipulation der Vogelkeimbahn und bietet eine vielseitige Plattform für sowohl grundlegende als auch angewandte Studien in der Geflügelbiotechnologie.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die durch Primordidiale Keimzellen (PGC)-vermittelte Keimbahnübertragung ist die effizienteste Methode, um genetische Informationen an die nächste Generation bei Vögelnzu übertragen 1,2,3. Keimbahn-Chimären, definiert als Individuen, die sowohl von Spender- als auch von Wirts-Keimzellen abgeleitet sind, ermöglichen die Übertragung von genetischem Material des Spenders auf Nachkommen und unterstützen Anwendungen in der Transgenese, funktionellen Genomik und dem Schutz gefährdeter Arten 4,5,6,7,8. Im Gegensatz zu Ansätzen, die auf blastodermalen Zellen basieren, bieten PGC-vermittelte Strategien eine höhere Effizienz und Reproduzierbarkeit der Keimbahnübertragung, was sie gut für präzise genetische Manipulationen geeignet macht.

Bei Vogelarten stammen PGCs aus der zentralen Pellucida-Region des Blastoderms bei Eyal-Giladi und Kochav (EGK) Stadium X9 und wandern anschließend mit Hamburger und Hamilton (HH) Stadium 4 bis10 zum Keimmond. Zwischen den HH-Stadien 9 und 12 zirkulieren PGCs über embryonale Blutgefäße, bevor sie sich im Gonadalgrat 11,12,13 niederlassen. Dieses ausgeprägte Migrationsmuster ermöglicht die Isolierung von PGCs in mehreren Stadien, einschließlich Keimsichel, zirkulierem Blut und Gonaden14. Bemerkenswert ist, dass PGCs, die aus den Gonaden der HH-Stufe 26-28 entnommen und in die Empfänger-Embryonen der HH-Stufe 14-17 transplantiert wurden, eine optimale Keimbahnkompetenz und Engraftment-Effizienz aufweisen, was einen praktischen Rahmen für die standardisierte Anwendung dieses Protokolls bietet.

PGCs können in vitro erhalten und erweitert werden, während die Keimbahnidentität und Übertragungsfähigkeit erhalten bleiben, was ihre Nutzung für stabile genetische Modifikation ermöglicht. Die PGC-vermittelte Keimbahn-Chimärenproduktion wurde verwendet, um transgene Vögel zu erzeugen, die rekombinante Proteine exprimieren, die Keimlinienlinien zu tracen, Geschlechtsbestimmungswege zu manipulieren und Resistenz gegen Infektionskrankheiten zu verleihen 6,15,16,17,18,19. Darüber hinaus erleichtert PGC-Transplantation die interspecies Keimbahnübertragung und die Erhaltung gefährdeten vogelartigen Keimplasmas 7,8,20,21,22,23, und PGC-Kryokonservierung ermöglicht langfristige genetische Ressourcenerhaltung 24,25.

Obwohl andere Stammzelltypen, darunter embryonale Stammzellen (ESCs)26,27,28,29, induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs)30,31,32 und spermatogonale Stammzellen (SSCs)333,34, für die Modifikation der Keimbahnen der Vogel untersucht wurden, bleibt ihre Keimbahnübertragungseffizienz niedriger als die von PGC-basierten Systemen, die derzeit als die am meisten gelten Zuverlässige Quelle für keimbahnfähige Zellen.

In Keimbahn-Chimären-Studien ist die Wahl der Spenderrasse entscheidend, um Spender-abgeleitete Keimzellen von wirtsabgeleiteten Zellen zu unterscheiden. Das koreanische Ogye-Huhn (KOC) besitzt das rezessive i/i-Allel, das für schwarze Haut und Federn verantwortlich ist und leicht von der White Leghorn-Linie mit dem dominanten I/I-Allel 35,36 zu unterscheiden ist. Dieser sichtbare Unterschied ermöglicht eine eindeutige Identifizierung von von Spendern abgeleiteten Nachkommen während der Keimbahnübertragungsanalyse und unterstützt zugleich den Schutz der Biodiversität aufgrund des indigenen genetischen Wertes von KOC.

Insgesamt bietet die von PGC vermittelte Keimlinien-Chimärenproduktion eine robuste Grundlage für die Vogelbiotechnologie (Abbildung 1). Durch die Festlegung der optimalen Spender- (HH26-28) und Empfängerstadien (HH14-17) sowie die Einbeziehung definierter Kultur- und Validierungsschritte ermöglicht dieses Protokoll eine effiziente Keimbahnübertragung und bietet einen praktischen Rahmen für die Entstehung transgener und genomeditierter Vögel sowie für die Erhaltung wertvoller genetischer Vogelressourcen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren mit Hühnern wurden vom Institut für Labortierressourcen der Seoul National University, Südkorea, genehmigt (IACUC-Zulassungsnummer: SNU-250226-4). Die Tiere wurden unter kontrollierten und hygienischen Bedingungen gehalten, wobei sterilisiertes Wasser und Futter bereitgestellt wurden. Darüber hinaus wurden alle während den Eingriffen entstandenen chemischen und biologischen Abfall, einschließlich Trypsin/EDTA-Lösungen, PKH26-markierten Zellen sowie embryonales oder gonadales Gewebe, gemäß den institutionellen Biosicherheits- und Gefahrenabfallmanagementrichtlinien der Seoul National University behandelt und entsorgt. Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt. PGCs, Medien und Reagenzien, die für Gonadenentnahme und Zellkultur aus Spenderembryonen verwendet werden, müssen steril sein.

1. Isolierung von Hühner-PGCs

  1. Frische befruchtete Hühnereier werden 5,5 Tage lang im Eyal-Giladi und Kochav (EGK) Stadium X bei 37 °C ausgebrütet, bis die Embryonen die HH-Stadien 26–28 erreichen.
    HINWEIS: Halten Sie die Luftfeuchtigkeit bei 60 % bis 65 %, um eine normale embryonale Entwicklung zu gewährleisten.
  2. Isolieren Sie Embryonen sorgfältig aus den Eiern in den HH-Stadien 26–28 mit steriler Pinzette.
  3. Waschen Sie die Embryonen mit 1× PBS, legen Sie den Embryo dann auf eine Kohleplatte und sichern Sie ihn mit Insektennadeln. Mit einem Stereomikroskop werden die paarigen embryonalen Gonaden sorgfältig mit geschärften Zangen zerlegt.
    HINWEIS: Behandeln Sie das Gewebe vorsichtig, um Schäden zu vermeiden und eine genaue Isolierung der Gonaden sicherzustellen. Aufgrund ihrer Nähe zur mesonephrischen Niere in den HH-Stadien 26–28 kann unbeabsichtigt eine kleine Menge Nierengewebe gesammelt werden; eine sorgfältige Sektion unter einem Stereomikroskop und selektive Kulturbedingungen stellen jedoch sicher, dass nur PGCs sich vermehren und die Reinheit erhalten bleibt.
  4. Übertragen Sie die gepaarten Gonaden, die von drei Embryonen gesammelt wurden, in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 500 μL 0,05 % Trypsin/EDTA und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten, um die Zellen zu dissoziieren.
  5. Füge 50 μL FBS hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren.
  6. Zentrifugiere bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (ca. 20–25 °C). Entfernen Sie vorsichtig das Überdachungsmittel, ohne das Zellpellet zu stören.
  7. Die dissoziierten Gonadenzellen in 1 ml von 1 × PBS wieder suspendieren.

2. In-vitro-Proliferation von Hühner-PGCs

  1. Bereite PGC-Kulturmedium vor (KO-DMEM ergänzt mit 20 % FBS, 2 % Hühnerserum, Nukleosiden, GlutaMAX, MEM-nicht-essentiellen Aminosäuren, 2-Mercapptoethanol, 10 mM Natriumpyruvat, Anti-Mykotikum, 10 ng/mL bFGF) und erwärme das Medium auf 37 °C.
  2. Fügen Sie dissoziierte gonadale Zellen aus drei Embryonen in den HH-Stadien 26–28 (etwa 100–150 PGCs pro Embryo37,38) zu 1 ml vorgewärmtem Kulturmedium pro Bohrloch hinzu und plattieren die Zellen auf eine 12-Well-Kulturplatte.
  3. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen sicherzustellen.
  4. PGCs bei 37 °C mit 5 % CO₂ halten und täglich Morphologie und Zelldichte überwachen. PGCs bleiben rund, refraktil und typischerweise schwebend, während somatische Zellen haftend sind (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Die Kulturbedingungen unterstützen selektiv die Proliferation von PGCs, sodass PGCs expandieren können, während somatische Zellen schrittweise eliminiert werden.
  5. PGCs, die in einer 12-Well-Platte kultiviert werden, werden durch den Wechsel des Kulturmediums alle 3–4 Tage aufrechterhalten, um optimale Vermehrung und Lebensfähigkeit zu unterstützen (Abbildung 2B).
  6. Optional verwenden Sie PGC-spezifische Marker (z. B. CVH, DAZL, NANOG und POUV), um die Reinheit zu überprüfen und die Geschlechtsbestimmung mittels PCR durchzuführen (Tabelle 1).
    1. Bereiten Sie PGC-Proben für die RNA-Extraktion mit dem RNA Miniprep System gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    2. RT-PCR (z. B. CVH, DAZL, NANOG und POUV) oder Immunfärbung mit PGC-spezifischen Markern (SSEA1 und DAZL) gemäß Standardprotokollen39 (Abbildung 2C, D) durchführen.
    3. Führen Sie eine geschlechtsspezifische PCR-Analyse gemäß Standardprotokollen40 durch (Abbildung 2E).

3. Validierung der Keimbahnkompetenz kultivierter PGCs mittels PKH26-Kennzeichnung

  1. Ernten Sie PGCs, wenn sie die Log-Growth-Phase erreichen, typischerweise mit einer Dichte von etwa 1–5 × 105 Zellen pro Brunnen in einer 12-Well-Platte.
  2. Die Zellen mit Pellets bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (ca. 20–25 °C) zentrifugieren, in 1× PBS neu suspendieren und die Viabilität mit Trypanblau bewerten.
  3. Bereiten Sie Verdünner C aus dem PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit für die allgemeine Zellmembrankennzeichnung vor und gleichen Sie es auf Raumtemperatur (ca. 20–25 °C) aus.
  4. Rekonstituiert den PKH26-Farbstoff und bereitet eine Arbeitslösung in Verdünner C mit einer Endkonzentration von etwa 1–2 μM her.
  5. Das PGC-Pellet in 1 mL Verdünner C neu suspendieren. Schnell 1 ml PKH26-Lösung (1:1-Verhältnis) hinzufügen, vorsichtig mischen und 2-5 Minuten bei Zimmertemperatur (ca. 20-25 °C) inkubieren.
  6. Fügen Sie schnell 1 ml PKH26-Arbeitslösung zur Zellsuspension (Verhältnis 1:1) hinzu, mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren und inkubieren Sie bei Raumtemperatur (ca. 20–25 °C) für 2–5 Minuten.
    HINWEIS: Überschreiten Sie die empfohlene Inkubationszeit nicht.
  7. Stoppen Sie die Färbung, indem Sie das 2-4-fache Volumen von FBS oder 1%-5% BSA in PBS hinzufügen.
  8. Zentrifugieren bei 200 × g, 5 Minuten bei Raumtemperatur (ca. 20–25 °C); Waschen dreimal mit PGC-Kulturmedium oder 1× PBS + 0,1 % BSA.
  9. Stellen Sie die Zellen in Injektionspuffer (PGC-Kulturmedium oder 1× PBS + 0,1 % BSA) bei einer Konzentration von 1–5 × 104 bis 1 × 10,5Zellen/μL wieder auf. Lassen Sie sie kurzzeitig auf Eis, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
  10. Überprüfen Sie die Beschriftung vor der Injektion unter einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 3A).
  11. Injizieren Sie mehr als 3.000 lebensfähige, markierte PGCs, gezählt mit Trypanblau, in HH-Embryonen der Stufe 14–17 und inkubieren Sie bis Tag 6 (Abbildung 3B).
  12. Bestätigen Sie die Kolonisierung der Empfängergonaden bis Tag 6 (Abbildung 3C).

4. Transplantation von Spender-PGCs in das embryonale Blutgefäß des Empfängers

  1. Brüten Sie die empfangenden Eier auf HH-Stadium 14-17 (37 °C, 60-70 % Luftfeuchtigkeit, Schaukeln bei 45 °C jede Stunde).
  2. Bereiten Sie eine Glaskapillar-Mikropipette mit Borosilikatglasrohr vor (1,0 mm Außendurchmesser, 0,5–0,75 mm Innendurchmesser). Ziehen Sie die Kapillare mit einem Mikropipettenzieher ab und polieren Sie die Spitze auf einen Innendurchmesser von etwa 10–20 μm.
  3. Schaffen Sie ein kleines Fenster (etwa 0,5 cm × 0,5 cm) am spitzen Ende der Eizelle, um Mikroinjektionszugang zu ermöglichen und gleichzeitig eine Störung des Embryos zu minimieren.
    HINWEIS: Sterilisieren Sie die Eierschalenoberfläche vor dem Öffnen des Fensters mit 70 % Ethanol, um eine Verunreinigung zu verhindern.
  4. Injizieren Sie 2 μL einer Suspension mit mehr als 3.000 PGCs in 1× PBS oder HBSS unter einem Stereomikroskop in die dorsale Aorta.
    HINWEIS: Führen Sie die Injektion unter einem Stereomikroskop durch, um Schädigungen des Embryos oder der Blutgefäße zu vermeiden, und führen Sie die Mikroinjektionsnadel sorgfältig an, um Verletzungen zu vermeiden.
  5. Versiegeln Sie das Eifenster mit Paraffinfolie; Stellen Sie das spitze Ei nach unten und brüten Sie es bis zum Schlüpfen bei 37,5 °C, 60-70 % Luftfeuchtigkeit und Schaukeln bei 45 °C jede Stunde.
    HINWEIS: Halten Sie angemessene Temperatur und Luftfeuchtigkeit aufrecht, um die Lebensfähigkeit des Embryos und eine erfolgreiche Entwicklung zu gewährleisten.

5. Validierung der Keimbahn-Chimäre

  1. Sammeln Sie den Hoden oder Eierstock nach dem Schlüpfen vom G0-Küken.
  2. Genomische DNA aus den gesammelten gonadalen Geweben extrahieren, um die Bildung der Keimbahn-Chimäre zu bestätigen. Führen Sie genomische DNA-Extraktion aus den gesammelten Gonadengeweben wie folgt durch:
    1. Sammeln Sie Hoden oder Eierstockgewebe, homogenisieren Sie es in 300 μl Lysepuffer (2 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1% SDS) mit 1,5 μL Proteinase K und inkubieren Sie bei 60 °C für H, um eine vollständige Lyse sicherzustellen.
    2. Fügen Sie 100 μL Protein-Ausfällungslösung (7 m Ammoniumacetat) hinzu, mischen Sie gründlich und zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
    3. Übertragen Sie das Obermaterial (wässrige Phase) in ein neues Rohr, fügen Sie 500 μL Isopropanol zur Ausfällung der DNA hinzu und zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
    4. Entsorge das Supernatant, gib 1 ml 70 % Ethanol hinzu und zentrifugiere bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
    5. Entferne das Ethanol und lasse das DNA-Pellet 10 Minuten bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen.
    6. Eliutieren Sie die DNA mit 50 μL RNase-freiem Wasser und messen Sie die DNA-Konzentration und Reinheit mit einem Spektrophotometer (A260/A280 ≈ 1.8).
    7. Passen Sie die DNA pro PCR-Reaktion auf 10-5 ng an.
  3. Führen Sie eine PCR-Amplifikation mit speziesspezifischen Primern durch, die (Tabelle 1) unter folgenden Bedingungen entwickelt wurden: 94 °C für 3 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen mit 94 °C für 30 Sekunden, 68 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden, plus einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten (Abbildung 4A).
  4. Sperma von geschlechtsreifen G0-Männchen sammeln, Spermien-DNA nach demselben Protokoll extrahieren und PCR mit artspezifischen Primern durchführen (Abbildung 4B).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In-vitro-Proliferation und Charakterisierung von Hühner-PGCs
PGC-haltige ganze gonadale Zellen wurden aus Embryonen in den HH-Stadien 26–28 isoliert und unter definierten PGC-Kulturbedingungen kultiviert. Im Laufe der Zeit hafteten gonadale Stromzellen entweder an der Kulturoberfläche oder unterzogen sich einem Abbau, während PGCs in Suspension blieben und aktiv zu proliferieren begannen (Abbildung 2A). Nach etwa zwei Wochen Kultur wuchs die PGC-...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Transplantation kultivierter primordieller Keimzellen (PGCs) in Empfängerembryonen bietet eine zuverlässige Methode, um Keimbahn-Chimären bei Hühnern zu produzieren. Dieses Protokoll nutzt das intrinsische Keimbahnpotenzial von PGCs und verbessert die experimentelle Konsistenz im Vergleich zu traditionellen blastodermbasierten Systemen, die zu Mosaikismus und Entwicklungsvariabilität neigen. Ein entscheidender Vorteil dieser Methode ist die selektive in-vitro-Expansion von P...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Nationalen Forschungsstiftung Koreas (NRF) unterstützt, der von der koreanischen Regierung (MSIT) gefördert wurde [RS-2024-00418297], sowie durch das Kooperative Forschungsprogramm für Landwirtschaft, Wissenschaft und Technologie [RS-2025-02213489] der koreanischen Landwirtschaftsverwaltung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1x PBS HycloneSH30256
2-MercaptoethanolGibco21985023
Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung (100X)Gibco15240062
Anti-DAZL-AntikörperAbcamab215718
Hähnchenserum sterilRocklandD102-00-0500
Deoxyribonuklease I aus der rindischen BauchspeicheldrüseSigma Aldrich9003-98-9
Drummond Microcaps Einweg-Mikropipeten Drummond Wissenschaftliche Gesellschaft1-000-0500
EmbryoMax-Nukleoside (100X)MerckES-008-D
FBS (Fetal Bovine Seurm charakterisiert, US-bezogen, 500 ml)HycloneSH30919
GlutaMAX-ErgänzungsmittelGibco35050061
KnockOut DMEMGibco10829018
MEM-Lösung für nicht-essentielle AminosäurenGibco11140050
Parafilm M LaborfilmAmcorPM996 
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit für allgemeine ZellmembrankennzeichnungSigma AldrichPKH26GL-1KT
Gereinigter Anti-Maus/menschlicher CD15 (SSEA-1) AntikörperBiolegende125602
Rekombinanter menschlicher FGF Basis/FGF2/bFGF (146 aa) Protein R& D-Systeme  233-FB
ReliaPrep RNA Miniprep-SystemePromegaZ6011
Natriumpyruvat (100 mM)Gibco11360070
Trypan-blaue LösungSigmaT8154-100ML
Trypsin-EDTA (0,5 %), kein rotes PhenolGibco & Handel;15400054

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van de Lavoir, M. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
  2. Macdonald, J., Glover, J. D., Taylor, L., Sang, H. M., McGrew, M. J. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells. PLoS One. 5 (11), e15518(2010).
  3. Choi, J. W., et al. Basic fibroblast growth factor activates MEK/ERK cell signaling pathway and stimulates the proliferation of chicken primordial germ cells. PLoS One. 5 (9), e12968(2010).
  4. Macdonald, J., et al. Efficient genetic modification and germline transmission of primordial germ cells using piggyBac and Tol2 transposons. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), E1466-E1472 (2012).
  5. Park, T. S., Han, J. Y. PiggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9337-9341 (2012).
  6. Lee, H. J., et al. DMRT1 gene disruption alone induces incomplete gonad feminization in chicken. FASEB J. 35 (9), e21876(2021).
  7. Kang, S. J., et al. Reproduction of wild birds via interspecies germ cell transplantation. Biol Reprod. 79 (5), 931-937 (2008).
  8. Wernery, U., et al. Primordial germ cell-mediated chimera technology produces viable pure-line Houbara bustard offspring: potential for repopulating an endangered species. PLoS One. 5 (12), e15824(2010).
  9. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: A complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick. I. General morphology. Dev Biol. 49 (2), 321-337 (1976).
  10. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  11. Ukeshima, A., Yoshinaga, K., Fujimoto, T. Scanning and transmission electron microscopic observations of chick primordial germ cells with special reference to the extravasation in their migration course. J Electron Microsc (Tokyo). 40 (2), 124-128 (1991).
  12. Fujimoto, T., Ukeshima, A., Kiyofuji, R. The origin, migration and morphology of the primordial germ cells in the chick embryo. Anat Rec. 185 (2), 139-145 (1976).
  13. Meyer, D. B. The migration of primordial germ cells in the chick embryo. Dev Biol. 10, 154-190 (1964).
  14. Kim, Y. M., Han, J. Y. The early development of germ cells in chicken. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 145-152 (2018).
  15. Park, T. S., et al. Deposition of bioactive human epidermal growth factor in the egg white of transgenic hens using an oviduct-specific minisynthetic promoter. FASEB J. 29 (6), 2386-2396 (2015).
  16. Kim, Y. M., et al. The transgenic chicken derived anti-CD20 monoclonal antibodies exhibits greater anti-cancer therapeutic potential with enhanced Fc effector functions. Biomaterials. 167, 58-68 (2018).
  17. Rengaraj, D., et al. Dissecting chicken germ cell dynamics by combining a germ cell tracing transgenic chicken model with single-cell RNA sequencing. Comput Struct Biotechnol J. 20, 1654-1669 (2022).
  18. Park, J. S., et al. Production of recombinant human IgG1 Fc with beneficial N-glycosylation pattern for anti-inflammatory activity using genome-edited chickens. Commun Biol. 6 (1), 589(2023).
  19. Idoko-Akoh, A., et al. Creating resistance to avian influenza infection through genome editing of the ANP32 gene family. Nat Commun. 14 (1), 6136(2023).
  20. Ono, T., Yokoi, R., Aoyama, H. Transfer of male or female primordial germ cells of quail into chick embryonic gonads. Exp Anim. 45 (4), 347-352 (1996).
  21. Reynaud, G. The transfer of turkey primordial germ cells to chick embryos by intravascular injection. J Embryol Exp Morphol. 21 (3), 485-507 (1969).
  22. Liu, C., et al. Production of chicken progeny (Gallus gallus domesticus) from interspecies germline chimeric duck (Anas domesticus) by primordial germ cell transfer. Biol Reprod. 86 (4), 101(2012).
  23. van de Lavoir, M. C., et al. Interspecific germline transmission of cultured primordial germ cells. PLoS One. 7 (5), e35664(2012).
  24. Naito, M., Tajima, A., Tagami, T., Yasuda, Y., Kuwana, T. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring. J Reprod Fertil. 102 (2), 321-325 (1994).
  25. Tajima, A., Naito, M., Yasuda, Y., Kuwana, T. Production of germline chimeras by transfer of cryopreserved gonadal primordial germ cells (gPGCs) in chicken. J Exp Zool. 280 (3), 265-267 (1998).
  26. Carsience, R. S., Clark, M. E., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos. Development. 117 (2), 669-675 (1993).
  27. Petitte, J. N., Liu, G., Yang, Z. Avian pluripotent stem cells. Mech Dev. 121 (9), 1159-1168 (2004).
  28. Petitte, J. N., Clark, M. E., Liu, G., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells. Development. 108 (1), 185-189 (1990).
  29. Pain, B., et al. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. Development. 122 (8), 2339-2348 (1996).
  30. Rossello, R. A., et al. Mammalian genes induce partially reprogrammed pluripotent stem cells in non-mammalian vertebrate and invertebrate species. Elife. 2, e00036(2013).
  31. Lu, Y., et al. Avian-induced pluripotent stem cells derived using human reprogramming factors. Stem Cells Dev. 21 (3), 394-403 (2012).
  32. Kim, Y. M., Park, Y. H., Lim, J. M., Jung, H., Han, J. Y. Technical note: Induction of pluripotent stem cell-like cells from chicken feather follicle cells. J Anim Sci. 95 (8), 3479-3486 (2017).
  33. Han, J. Y., et al. Production of quail (Coturnix japonica) germline chimeras by transfer of Ficoll-enriched spermatogonial stem cells. Theriogenology. 154, 223-231 (2020).
  34. Pramod, R. K., et al. Isolation, characterization, and in vitro culturing of spermatogonial stem cells in Japanese Quail (Coturnix japonica). Stem Cells Dev. 26 (1), 60-70 (2017).
  35. Park, T. S., et al. Improved germline transmission in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos. Biol Reprod. 68 (5), 1657-1662 (2003).
  36. Chang, I. K., et al. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells. Cell Biol Int. 21 (8), 495-499 (1997).
  37. Nakamura, Y., et al. Migration and proliferation of primordial germ cells in the early chicken embryo. Poult Sci. 86 (10), 2182-2193 (2007).
  38. Kuwana, T. Migration of Avian Primordial Germ Cells toward the Gonadal Anlage: (avian/PGC/migration/presumptive gonad/chimera). Dev Growth Differ. 35 (3), 237-243 (1993).
  39. Jung, K. M., Kim, Y. M., Ono, T., Han, J. Y. Size-dependent isolation of primordial germ cells from avian species. Mol Reprod Dev. 84 (6), 508-516 (2017).
  40. Ogawa, A., et al. Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing carinatae birds. Chromosome Res. 5 (2), 93-101 (1997).
  41. Park, K. J., et al. Gamma-irradiation depletes endogenous germ cells and increases donor cell distribution in chimeric chickens. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (10), 828-833 (2010).
  42. Nakamura, Y., et al. Germline replacement by transfer of primordial germ cells into partially sterilized embryos in the chicken. Biol Reprod. 83 (1), 130-137 (2010).
  43. Song, Y., D'Costa, S., Pardue, S. L., Petitte, J. N. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion. Mol Reprod Dev. 70 (4), 438-444 (2005).
  44. Lee, H., et al. Compensatory proliferation of endogenous chicken primordial germ cells after elimination by busulfan treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 136(2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Primordiale KeimzellenPGC Transplantationavi re TransgeneseGenomeditierungH hnereierspezies bergreifende KeimbahntransmissionCRISPR Cas9FluoreszenzmarkerPCR Analyse der Gonaden

Verwandte Artikel