Methodenartikel

Entwicklung eines neuartigen internen Fixationsmodells für Rattenradialfrakturen: Bruchheilungsbewertung und Isolierung des dorsalen Wurzelganglions

DOI:

10.3791/69707

13. März 2026

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Studie kombiniert innovativ Nähte und Titannadeln für eine stabile innere Fixation in einem Rattenradialbruchmodell. Die Bruchheilung wurde mittels Mikrocomputertomographie (Mikro-CT) untersucht, und primäre Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) wurden isoliert und für weitere Untersuchungen kultiviert.

Zusammenfassung

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Das Modell der radialen Rattenfraktur ist von großer Bedeutung in der orthopädischen Forschung, insbesondere für die Untersuchung von Bruchheilungsmechanismen, Medikamententests und die Bewertung biologischer Materialien. Trotz gewisser Einschränkungen bleibt seine Rolle in der wissenschaftlichen Forschung unersetzlich. Da der Radius der Ratten relativ dünn ist, sind die derzeit in der klinischen Praxis verwendeten Stahlplatten und -schrauben für die Behandlung von Radialfrakturen bei Ratten nicht geeignet. Um diese Einschränkung zu beheben, verwendet diese Studie innovativ die Naht- und Titannadelfixierung, ein internes Fixationsmodell für radiale Brüche, das eine relativ stabile Fixation ermöglicht und ein robustes Tiermodell zur Untersuchung der internen Fixation solcher Brüche etabliert. In vivo wurde eine Bildgebung mit einem lebenden Tier-Mikro-CT-System durchgeführt, um die Heilung von Radialfrakturen bei Sprague-Dawley (SD)-Ratten nachzuweisen. Die Gewinnung und Anwendung des Ratten-DRG sind wichtige Schritte in der neurowissenschaftlichen Forschung, die weit verbreitet in Bereichen wie Neurowissenschaften, Pathologie und Zellbiologie eingesetzt werden. Dieses Protokoll eignet sich für die Primärkultur von dorsalen Wurzelganglion-Neuronen von Ratten mit radialen Brüchen und kann zur Untersuchung von Mechanismen von Nervenschäden und -reparaturen nach Frakturen verwendet werden, wie etwa neuronale Apoptose und Freisetzung von Neurotransmittern.

Einleitung

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Radialfrakturen gehören zu den häufigsten klinischen Frakturen, mit einer erheblichen globalen Inzidenz, und gelten als Hauptursache für Langknochenbrüche in denExtremitäten 1,2,3. Populationsstudien zeigen eine bimodale Altersverteilung für radiale Brüche, die typischerweise sowohl bei pädiatrischen als auch in älteren Populationen ihren Höhepunkt erreicht4. Verzögerte Behandlung führt häufig zu einer Rotationsstörung des Unterarms, was die täglichen Aktivitäten (ADLs) stark beeinträchtigt. Es gibt weiterhin Kontroversen im Radialbruchmanagement, die sich hauptsächlich auf Frakturklassifikationssysteme und die Auswahl der Behandlungsmodalitätenkonzentrieren 7,8. Klinische Evidenz legt nahe, dass die offene Reduktion der internen Fixation (ORIF) den Bewegungsumfang (ROM) und die Krafterholung des Ellbogen- oder Handgelenks signifikant verbessert9; Dieser Ansatz ist jedoch mit höheren Raten postoperativer Infektionen und interner fixationsbedingter Komplikationen verbunden10,11.

Das DRG dient als kritische anatomische und funktionelle Brücke für die Übertragung sensorischer Informationen zwischen dem peripheren und zentralen Nervensystem (ZNS). Über seine Hauptrolle hinaus bei der Sammlung und Weiterleitung peripherer sensorischer Signale (z. B. Berührung, Temperatur) reguliert das DRG aktiv abnormale Empfindungen wie Schmerz und bildet damit eine Schlüsselstruktur für die normale sensorische Funktion und das klinische Schmerzmanagement 12,13,14. Pathologische Veränderungen wie Verletzungen, Entzündungen oder Neurodegeneration in der DRG können sensorische Auffälligkeiten (z. B. Taubheit, Kribbeln) oder chronische Schmerzen auslösen, was sie zu einem Schwerpunkt der Forschung in der Neurowissenschaft und Schmerzmedizin macht.

Hier wurden die acht Wochen alten männlichen SD-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200 g ausgewählt, um (1) ein internes Fixationsmodell für radiale transversale Frakturen bei Ratten und anschließende Nachheilungsbeurteilung sowie (2) die Isolierung und In-vitro-Kultur von DRGs aus Ratten mit einem internen Fixationsmodell für radiale Frakturen zu erstellen. Dieses Protokoll ist darauf ausgelegt, reproduzierbare Experimente in Studien zu ermöglichen, die Bruchheilungsmechanismen, DRG-vermittelte sensorische Veränderungen und potenzielle therapeutische Ziele für Schmerzen oder Funktionsstörungen nach der Fraktur untersuchen.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden vom Tierethikkomitee der Nanjing Universität für Chinesische Medizin (Nr. 202508A046) genehmigt. Alle in den folgenden Tests verwendeten Ratten wurden unter spezifischen krankheitserregerfreien (SPF) Bedingungen erhalten. Ein Schaltplan, der das Protokoll darstellt, ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Einrichtung eines internen Fixationsmodells für radiale Brüche bei Ratten

HINWEIS: Ratten wurden vor der Operation an eine ruhige Umgebung mit sanftem, diffusem Licht gewöhnt, das sie vor Lärm und grellem Licht schützte. Während der Handhabung wurden der Bauch und die Brust der Ratten mit sanfter manueller Fesselung gestützt, um das Greifen am Schwanz zu vermeiden – eine Praxis, die dafür bekannt ist, Schmerzen und Unbehagen beim Kämpfen zu verringern.

  1. Bereiten Sie die chirurgischen Instrumente wie in Abbildung 2 dargestellt vor. Zu den chirurgischen Instrumenten gehören eine Skalpellklinge, ein Skalpellgriff, eine Bedienschere, ein Nadelhalter, eine hämostatische Zange und eine Zahntissue-Pinzette. Die männliche Sprague-Dawley-(SD)-Ratte war etwa 8 Wochen alt und etwa 200 g.
  2. Betäuben Sie die Ratte mit einer Isoflurangas-Anästhesiemaschine. Zur Einleitung verwenden Sie 4 % Isofluran und halten während des gesamten chirurgischen Eingriffs eine ventilatorische Anästhesie (2 % Isofluran) mit einem Nasenkegel aufrecht. Halten Sie die Operationsraumtemperatur bei etwa 28 °C.
    HINWEIS: Bestimmen Sie den Erfolg der Anästhesie durch Überprüfung der Vitalwerte (wie Atmung und Herzfrequenz), Hornhautreflex (keine Reaktion zeigt auf wirksame Anästhesie), Blinzelreflex (Abwesenheit) und Zehenkontraktionsreaktion (kein Rückzug nach Stimulation).
  3. Setze die Ratte in die seitliche Position, entblöße das rechte Vordergliedmaß und rasiere die Haare mit einer Haarschneider ab. Legt ein steriles Laken und wickelt ein Tourniquet um das proximale rechte Vordergliedmaß, um die chirurgische Blutung zu reduzieren.
  4. Bereiten Sie die Haut vor, indem Sie dreimal abwechselnd Alkohol und Betadine-Peelings verwenden.
  5. Machen Sie einen 1,5 cm langen Längsschnitt auf der dorsalen radialen Seite des rechten Unterarms, wie in Abbildung 3 gezeigt. Trennen Sie die Muskelräume und legen Sie den rechten Vordergliedradius vollständig frei.
    HINWEIS: Der Radius wird freigelegt, indem die Muskeln entlang des Muskelinterspace stumpf getrennt werden. Nur die dorsalen Muskeln des Radius sind freigelegt, ohne die umliegenden Muskeln vollständig zu entkern.
  6. Verwenden Sie eine Bedienschere, um den Radius zu schneiden und so einen Querbruch zu erzeugen. Die Schere ist in einem 90-Grad-Winkel zum Radius ausgerichtet (Abbildung 4).
  7. Nehmen Sie eine Titannadel mit 0,8 mm Durchmesser und 10 mm Länge und führen Sie sie entlang ihrer Längsachse in den Radiusbruch ein (Abbildung 5). Fixieren Sie den Radius und die Titannadel mit einer Naht (4-0 [1,5 metrische] Seide geflochten, nicht absorbierbar), wie in Abbildung 6 gezeigt.
  8. Binden Sie die Naht mit drei aufeinanderfolgenden Knoten und befestigen Sie die Titannadel mit vier unterbrochenen Nähten am Radius.
    HINWEIS: Das proximale und das distale Ende des Bruchs sind jeweils zweimal fixiert.
  9. Nähte (4-0 [1,5 metrische] Seide geflochten, nicht absorbierbar) die Haut, schneide die überschüssige Naht ab und schließe die Wunde. Desinfizieren Sie die Haut mit Betadine-Peelings.
  10. Decken Sie die Wunde mit steriler Mull ab und sichern Sie sie mit Verbänden. Setze die Ratte in einen Käfig, um das Bewusstsein wiederzuerlangen, bis sie sich erholt.
  11. Postoperative Schmerzbehandlung:
    1. Wenn das Tier Schmerzen zeigt, nicht frisst und/oder zögert, auf den Hinterbeinen zu laufen, konsultieren Sie das Tierarzt und verabreichen Sie zusätzliche Schmerzmittel.
      HINWEIS: Cefuroxim-Natrium wird bei der Behandlung bakterieller Infektionen verwendet. Tramadolhydrochlorid wird zur Verabreichung von Schmerzmitteln verwendet.

2. Mikro-CT-Bildgebung

  1. Betäuben Sie die Ratte mit einem Isoflurangas (Induktionsdosis 4 %) Anästhesiemaschine.
  2. Setzen Sie die Ratte in eine Bauchlage in der Scankammer, passen Sie die Position von Gliedmaßen und Kopf an, um den Zielbereich im Sichtfeld zu zentrieren, und halten Sie während des gesamten Eingriffs kontinuierliche Belüftung und Anästhesie (2 % Isofluran) aufrecht.
  3. Schiebe das feste Tierbett in die Scankammer und schließe die Kammertür.
  4. Stellen Sie die Mikro-CT-Scan-Parameter wie folgt ein. Scan-Modus: Standard; Belichtungszeit: 2 Minuten; Sichtfeld: 72 mm; Voxelgröße: 144 μm; Spannung: 90 kV; Strömung: 88 μA; Filter: 3D-weich.
    HINWEIS: Die Scandaten werden automatisch an die Software übertragen und ein dreidimensionales CT-Bild erzeugt.
  5. Trennen Sie das Zielgewebe.
    1. Analysieren Sie den ausgewählten Knochengewebebereich aus den ursprünglichen Mikro-CT-Bildern. Schieben Sie die Transferfunktionslinie, um Knochen vom Muskel zu trennen und zu viel Muskelgewebe zu vermeiden. Führen Sie die hochauflösende Rekonstruktion des segmentierten Knochengewebes durch, um ein 3D-Modell zu erstellen.
  6. Exportiere die verarbeiteten Bilder.
    1. Nach der Verarbeitung der Bilder suchen und klicken Sie auf den Beenden-Button , um den aktuellen Workflow abzuschließen.
    2. Ein Pop-up-Fenster erscheint, wähle zuerst noch aus , um zu bestätigen, dass du ein statisches Bild exportieren möchtest (keine dynamische Sequenz).
    3. Wählen Sie jpeg als Ausgabe-Dateiformat aus den verfügbaren Optionen.
    4. Wählen Sie eine große Größe aus, um sicherzustellen, dass das exportierte Bild eine hohe Auflösung behält, die für Analyse oder Dokumentation geeignet ist.
    5. Klicken Sie auf OK , um den Exportvorgang abzuschließen.

3. Isolierung und Kultur von DRG bei Ratten mit radialen Brüchen

HINWEIS: Die Euthanasie wird mit 4 % Isofluran-Inhalationsanästhesie verabreicht, gefolgt von einer schnellen Zervikalluxation zur Euthanasion der Tiere. Die DRGs werden 20 Tage nach der Etablierung des radialen Bruchmodells extrahiert.

  1. Wirbelsäule durchtrennen, die Wirbelkörper C1-C7 entfernen. Schneiden Sie die Halswirbelsäule entlang der vorderen und hinteren Mittellinien ab und teilen Sie sie in die linke und rechte Hälfte. Falls nötig, schneiden Sie die dornigen Prozesse ab, um den Betrieb zu erleichtern.
  2. Reinigen Sie vorsichtig das Rückenmarksgewebe und die Nervenfasern innerhalb der intervertebralen Foramina. Spülen Sie die intervertebralen Foramina mit einer mit PBS gefüllten Spritze, um das Blut zu entfernen und die lateralen Vertiefungen freizulegen.
    HINWEIS: Das DRG befindet sich innerhalb der seitlichen Vertiefungen und präsentiert sich als hellgelber Knoten, mit Nervenfasern, die an beiden Enden verbunden sind.
  3. Verwenden Sie eine Zahntissue-Pinzette, um die DRG aufzuheben, heben Sie sie vorsichtig an und schneiden Sie dann mit einer Operationsschere die Nervenfasern an beiden Enden.
  4. Übertragen Sie die extrahierten DRGs in ein 1,5-ml-Zentrifugenrohr mit Extraktionsmedium; Auf Eis legen.
    HINWEIS: Bereiten Sie das Extraktionsmedium vor, indem Sie 2 % fetales Rinderserum (FBS) zum α-Minimum Essential Medium (α-MEM) hinzufügen. Die DRGs werden etwa 30 Minuten im Extraktionsmedium inkubiert, bevor zum nächsten Schritt übergegangen wird.
  5. Langsam aspirieren und das Extraktionsmedium entsorgen. Gib 1 ml der gemischten Verdauungsenzym-Arbeitslösung hinzu. Man sollte 60–70 Minuten in einem 37 °C Wasserbad verdauen.
    HINWEIS: Um die gemischte Verdauungsenzym-Arbeitslösung herzustellen, lösen Sie 100 mg Typ-I-Kollagenase und 100 mg Dispase in 1 ml Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf. Verdünne es beim Gebrauch zu einer Arbeitslösung von 5 mg/mL und lagere es auf Eis.
  6. Beschichten Sie eine Petrischale, indem Sie ein passendes Volumen der Fibronektin-Arbeitslösung pipettieren und dann bei 37 °C 1 Stunde inkubieren.
    HINWEIS: Die humane Plasmafibronektin-Arbeitslösung (Fibronectin-Arbeitslösung) wird hergestellt, indem die 1 mg/mL Fibronectin-Lagerlösung mit ddH₂O auf eine 0,02 mg/mL Fibronectin-Arbeitslösung verdünnt wird.
  7. Nach der Verdauung aspirieren und entsorgen Sie die gemischte Verdauungsenzym-Arbeitslösung. Gib 1 ml vollständiges Medium hinzu und pipettiere das DRG-Gewebe vorsichtig mehrmals.
    HINWEIS: Zur Herstellung eines vollständigen Mediums mischen Sie 45 ml MEM-α-Medium, 4,5 ml FBS und 0,5 ml Penicillin-Streptomycin (PS)-Lösung und sterilisieren Sie durch Filtration durch eine 0,22 μm sterilisierte mikroporöse Membran.
  8. Filtrat sammeln, bei 75 × g für 8,5 Minuten bei 25 °C zentrifugieren.
  9. Nach der Zentrifugation wird das Supernatant in der Zentrifugenröhre abgesaugt und entsorgt, und 1 ml komplettes Medium hinzugefügt, um das Niederschlagsmittel wieder aufzuhängen.
  10. Nimm die Petrischale raus. Verwerfen Sie die Fibronectin-Arbeitslösung und waschen Sie zweimal mit PBS.
  11. Inokulieren Sie die Zellen in die beschichtete Petrischale, fügen Sie 1 ml vollständiges Medium hinzu und inkubieren Sie in einem Inkubator bei konstanter Temperatur bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 8–12 Stunden.
  12. Nach 8–12 Stunden ersetze das komplette Medium durch Ersatzmedium. Dann ersetze alle 2-3 Tage die Hälfte des Volumens durch das Ersatzmedium.
    HINWEIS: Zur Herstellung des Ersatzmediums mischen Sie 44,5 ml MEM-α-Medium, 4,5 ml FBS, 0,5 ml Penicillin-Streptomycin (PS)-Lösung und 0,5 mL Deoxyuridin. Sterilisieren durch Filtration durch eine 0,22 μm große, sterilisierende mikroporöse Membran.

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Ergebnisse

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Die Mikro-CT-Bilder bestätigten die erfolgreiche Etablierung radialer Frakturrattenmodelle in Abbildung 7 und des internen Fixationsmodells für radiale Rattenfrakturen in Abbildung 8. Die Mikro-CT-Bilder wurden zwischen der Aufnahme am Tag der Erstellung des internen Fixationsmodells der Fraktur und zwanzig Tagen nach der Modellaufnahme verglichen. Zwanzig Tage nach der Modellierung zeigte eine Mikro-CT-Analyse der SD-Ratten in ...

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Diskussion

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Der Radialbruch ist einer der häufigsten langen Knochenbrüche in der klinischen Praxis. Ihr Heilungsprozess umfasst komplexe Wechselwirkungen zwischen Knochengewebereparatur und neuronaler Regulation (wie die Regulation von Osteoblasten/Osteoklasten durch Neuropeptide und neurotrophe Faktoren, die vom dorsalen Wurzelganglion freigesetzt werden)15,16,17,18. Ratt...

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Offenlegungen

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Alle Autoren erklären, dass sie keine potenziellen Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des wissenschaftlichen Forschungsprojekts der Jiangsu Traditional Chinese Medicine Society (XYLD2024038) und des wissenschaftlichen Forschungsprojekts des Nantong Health and Wellness Committee (QNZ2023115) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5-Fluoro-2' DeoxyuridinSigmaF0503
Cefuroxim Natrium Shandong Runze Pharmaceutical Co., Ltd., ChinaGuoyao Zhunzi H20205058
DAPI-FärbelösungBiyotimeC1005
DispersaseShanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd.S25046
Fetales Rinderserum (FBS)Thermo16000-044
hämostatische Zangensätze Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. J31070
Humanes Plasmafibronektin (Humanes Fibronektin) SigmaF0895
IsofluraneHeckantriebR510-22-10 
Mikro-CT-Bildgebungssystem für lebende TierePerkinElmer in den USAQuantum GX 
MEM-ALPHA-Kulturmedium  BIC3060
Nadelhalter Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. 200622
Bedienungsscheren Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. J21130
PenicillinSolarbio140051251
Penicillin-Streptomycin-Lösung NovaCellsN-PSS125
Povidon-JodMeilunbioMB1313800g
SkalpellklingeShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.RYY070
SkalpellgriffShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. J11010
Naht Johnson & Johnson MEDICAL (CHINA) Ltd. SA84G
NahtnadelShanghai XIAOYU MEDICAL EQUIPMENTS. & Delta; 3/8 & Mittelpunkt; 3& Mal; 6
TitannadelTianjin Yutong Medizinisches Gerät 2-0X250 
Zahngewebe-Zangen;Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. J41055
TramadolhydrochloridJiangsu Jiuxu Pharmaceutical Co., Ltd., ChinaCYHB2201997
Tubulin beta-IIISigmaCBL412X
Typ I Kollagenase Thermo17100-017
Zeiss Axio Vert A1 Invertiertes FluoreszenzmikroskopZeissAxio Vert A1

Referenzen

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Schlagwörter

Radiale Fraktur bei RattenMikro CT BildgebungFixierung mit TitannadelnNahtfixierungDRG IsolierungPrim rkultur von NeuronenBeurteilung der Knochenheilung

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