Wird die Teicoplanin-Resistenz vom automatisierten System in Staphylococcus-spp-Stämmen zuverlässig erkannt?

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um die Zuverlässigkeit eines automatisierten Systems (VITEK 2) zur Bestimmung der Teicoplanin-Suszeptibilität in Staphylokokken-Isolaten im Vergleich zur Brühe-Mikrodilution (BMD) zu bewerten, mit Anwendungen zur Bestätigung der Resistenz und zur Steuerung geeigneter antimikrobieller Therapie.

Zusammenfassung

Insgesamt wurden 467 Staphylococcus aureus (S. aureus) und 66 koagulase-negative Staphylococcus (CoNS)-Isolate, die zwischen Juni 2022 und Dezember 2024 gesammelt wurden, in diese Studie eingeschlossen. Die Teicoplanin-Anfälligkeitstests wurden mit dem automatisierten antimikrobiellen Suszeptibilitätstestsystem, der Brühe-Mikroverdünnung (BMD) und einer Gradiententestmethode durchgeführt. Methicillinresistenz wurde in 71,7 % der S. aureus-Isolate und in allen CoNS-Isolaten nachgewiesen. In dieser Studie wurden 13 S. aureus-Isolate und 4 CoNS-Isolate durch ein automatisiertes Empfindlichkeitstestsystem als teicoplaninresistent identifiziert. Alle 13 S. aureus-Isolate wurden sowohl durch den Gradiententest als auch durch BMD als anfällig für Teicoplanin festgestellt. Alle vier CoNS-Isolate wurden durch den Gradiententest als anfällig identifiziert, während BMD zwei Isolate als anfällig und zwei als resistent klassifizierte. Teicoplanin-Resistenz wurde in vier Stämmen [S. capitis (n = 1) und S. haemolyticus (n = 3)] unter den CoNS-Isolaten mittels BMD nachgewiesen. Die vier teicoplaninresistenten CoNS-Stämme, die durch BMD identifiziert wurden, wurden aus Blutkulturen isoliert; drei stammten von pädiatrischen Patienten und einer von einem erwachsenen Patienten. Insgesamt war die Methicillin-resistente S. aureus (MRSA)-Rate in der Studie relativ hoch, und alle CoNS-Isolate waren methicillinresistent. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass automatisierte Systeme bei der Bestimmung der Teicoplaninresistenz unzuverlässig sind, und Isolate, die als resistent identifiziert wurden, sollten durch BMD bestätigt werden. Da Teicoplanin ein letztes Antibiotikum zur Behandlung von Krankheitserregern wie MRSA und methicillinresistentem CoNS ist, sollte seine Anfälligkeit genau überwacht werden.

Einleitung

Staphylococcus aureus (S. aureus) ist eine der klinisch bedeutendsten Staphylococcus-Arten aufgrund ihres breiten Spektrums an Virulenzfaktoren und seiner Fähigkeit, schwere Infektionen in verschiedenen Geweben und Organen zu verursachen. Er ist verantwortlich für Haut- und Weichteilinfektionen, Tiefengewebsinfektionen, Atemwegsinfektionen, Harnwegsinfektionen und Blutkreislaufinfektionen und bleibt einer der wichtigsten Krankheitserreger im Krankenhaus ^1,2. Insbesondere ist die methicillinresistente S. aureus (MRSA) weltweit eine Hauptursache für medizinisch assoziierte Infektionen und bleibt eine der Hauptursachen postoperativer Wundinfektionen ^2,3. Koagulase-negative Staphylokokken (CoNS), obwohl Teil der normalen Hautflora, wurden in den letzten Jahren zunehmend sowohl mit lokalen als auch mit systemischen Infektionen in Verbindung gebracht. Dieser Anstieg hat zu häufigeren antimikrobiellen Empfindlichkeitstests geführt und folglich zu einer erhöhten Detektion von Resistenzen gegen Glykoptidantibiotika wie Teicoplanin⁴.

Da S. aureus- und CoNS-Stämme häufig Resistenzen gegen β-Lactam-Antibiotika aufweisen, werden Glykopeptid-Antibiotika, hauptsächlich Vancomycin und Teicoplanin, häufig zur Behandlung dieser Infektionen eingesetzt5. Die zunehmende Prävalenz resistenter gram-positiver nosokomialer Krankheitserreger hat zu einer verstärkten Verwendung von Glykoppeptiden geführt, was zur Abnahme der bakteriellen Anfälligkeit für diese Erreger^beigetragen hat ^5,6. Vancomycin und Teicoplanin haben eine vergleichbare antimikrobielle Wirksamkeit; Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass Teicoplanin mit weniger Nebenwirkungen assoziiert ist, insbesondere mit einer reduzierten Nephrotoxizität ^7,8. Daher gilt Teicoplanin oft als geeignete Alternative zu Vancomycin in bestimmten Patientengruppen, einschließlich solcher mit Neutropenie, Bakteriämie oder beeinträchtigter Nierenfunktion ^9,10.

Eine schnelle und genaue Bestimmung der Glykopeptid-Suszeptibilität ist wichtig wegen der weit verbreiteten Verwendung dieser Substanzen bei Methicillin-resistenten Staphylokokken-Infektionen und der zunehmenden Berichte über glykopeptidresistente Stämme¹¹. Es stehen mehrere Labormethoden zur Beurteilung der Glykoptid-Suspertibilität bei Staphylokokken-Arten zur Verfügung, darunter Agar-Verdünnung, Gradiententests, Brühe-Mikrodilution (BMD) und automatisierte antimikrobielle Anfälligkeitstestsysteme⁵. Frühere Studien haben Unterschiede zwischen automatisierten Systemen und Referenzmethoden bei der Erkennung einer verminderten Anfälligkeit oder Resistenz gegenüber Glykopeptiden, insbesondere Teicoplanin, bei Staphylococcus-Spezies ^4,11 festgestellt.

Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die Zuverlässigkeit des automatisierten antimikrobiellen Anfälligkeitstestsystems zur Bestimmung der Teicoplanin-Anfälligkeit in Staphylococcus-Isolaten im Vergleich zur Brühe-Mikroverdünnungsmethode, dem Referenzstandard, zu bewerten. Die Bewertung der Leistungsmerkmale des automatisierten Systems kann klinischen Laboren helfen, dessen Eignung für die routinemäßige Detektion der Glykoptidanfälligkeit in der klinischen Praxis zu beurteilen.

Protokoll

Die Studie wurde am 27. Januar 2025 vom örtlichen Ethikausschuss genehmigt (Protokollnummer: HRU/25.02.03). Die Studie wurde gemäß den Grundsätzen der Helsinkier Erklärung durchgeführt.

1. Studiendesign

Diese retrospektive Studie bewertete die Leistung des automatisierten antimikrobiellen Suszeptibility-Testsystems zur Bestimmung der Teicoplanin-Suszeptibilität bei Staphylococcus-Arten und verglich die Ergebnisse mit der Brühe-Mikroverdünnungsmethode (BMD) und einer Gradiententestmethode.

2. Isolatauswahl

1. Sammlung klinischer Isolate
   1. Umfassen insgesamt 467 S. aureus - und 66 koagulase-negative Staphylococcus- (CoNS)-Isolate, die zwischen Juni 2022 und Dezember 2024 aus verschiedenen klinischen Proben gewonnen wurden.
   2. Behandle alle klinischen Proben gemäß routinemäßigen mikrobiologischen Verfahren im diagnostischen Labor.
   3. Beziehen Sie nur ein Isolat pro Patient in die Analyse ein. Wiederholte Isolate aus verschiedenen Proben desselben Patienten werden ausgeschlossen.
2. Erstbestimmung und Screening
   1. Identifizieren Sie alle Isolate auf Speziesebene mittels matrixunterstützter Laser-Desorptionsionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS).
   2. Testen Sie S. aureus und CoNS auf Methicillinresistenz und Teicoplanin-Anfälligkeit mit VITEK 2 AST-P664-Karten und dem automatisierten Empfänglichkeitstestsystem.
   3. Zeichnen Sie die vom automatisierten Empfindlichkeitstestsystem erzeugten Werte der minimalen Hemmungskonzentration (MIC) für den späteren Vergleich auf.
3. Isolierungsspeicher und Subkultur
   1. Isolate werden bei −80 °C in tryptischer Sojabrühe mit 20 % Glycerol nach einem automatisierten Empfindlichkeitstestsystem gelagert.
   2. Vor dem Referenztest tauen Sie die Isolate bei Raumtemperatur auf und subkultivieren Sie sie zweimal auf 5%igen Schafsblut-Agar.
   3. Teller bei 37 °C nach jedem Durchgang 24 Stunden lang inkubieren, um Reinheit und Lebensfähigkeit sicherzustellen.

3. Antimikrobielle Anfälligkeitstests

1. Brühe-Mikroverdünnung (BMD)
   1. Herstellung von Teicoplanin-Lösungen
      1. Bereiten Sie eine Lagerlösung aus Teicoplaninpulver mit einer Konzentration von 2560 mg/L in kationenangepasster Mueller-Hinton-Brühe (CAMHB) her.
   2. Brühe-Mikroverdünnungsverfahren
      1. Führen Sie Brühe-Mikroverdünnungstests mit sterilen 96-Well-Mikroplatten mit U-Boden durch.
      2. Gib 100 μL CAMHB in jedes Bohrloch. Verdünnen Sie die Teicoplanin-Stocklösung um das Zehnfache und fügen Sie dem ersten Bohrloch 100 μL hinzu.
      3. Bereite zweifache Serienverdünnungen über die Bohrungen 1–10 vor, um endgültige Antibiotikakonzentrationen von 64 bis 0,125 μg/mL zu erhalten.
      4. Verwenden Sie Brunnen 11 als Wachstumskontrolle mit CAMHB und bakteriellem Inokulum. Verwende Brunnen 12 als Negativsteuerung und enthält nur CAMHB¹².
   3. Inokulumpräparation und Inkubation
      1. Reine Bakterienkolonien in steriler Kochsalzlösung aufhängen und die Suspension auf eine Trübung anpassen, die dem 0,5-McFarland-Standard entspricht.
      2. Bereiten Sie eine 1:100-Verdünnung in CAMHB vor und geben Sie 100 μL der bakteriellen Suspension zu den Brunnen 1–11, um eine endgültige Inokulumkonzentration von etwa 5 × 105^CFU /ml zu erreichen.
      3. Inkubieren Sie die Mikroplatten bei 37 °C für 24 Stunden unter atmosphärischen Bedingungen¹².
   4. Bestimmung und Interpretation des MIC
      1. Definieren Sie die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) als die niedrigste Teicoplaninkonzentration, die das sichtbare Bakterienwachstum nach der Inkubation vollständig hemmt.
      2. Interpretieren Sie MIC-Werte gemäß den EUCAST-Richtlinien^14.0 des Europäischen Ausschusses für antimikrobielle Susceptibilitätstests 13.

4. Qualitätskontrolle

1. Verwenden Sie Staphylococcus aureus ATCC 29213 mit einem Teicoplanin-MIC-Referenzbereich von 0,25–1 mg/L als Qualitätskontrollstamm.

5. Statistische Analyse

1. Methodenvergleich
   1. Vergleichen Sie Teicoplanin-MIC-Ergebnisse, die mit dem automatisierten Suszeptibilitätstestsystem erhalten wurden, mit denen der BMD-Referenzmethode.
   2. Definieren Sie kategoriale Übereinstimmung (CA) als konkordant anfällige oder resistente Ergebnisse zwischen den beiden Methoden.
2. Fehlerklassifikation
   1. Definieren Sie sehr schwerwiegende Fehler (VME) als Isolate, die vom automatisierten Anfälligkeitstestsystem als anfällig, aber durch BMD resistent klassifiziert werden.
   2. Definieren Sie Hauptfehler (ME) als Isolate, die vom automatisierten Anfälligkeitstestsystem als resistent, aber durch BMD anfällig sind.
3. Leistungskriterien
   1. Betrachten Sie die Methodenleistung als akzeptabel, wenn die kategorische Übereinstimmung ≥90 % beträgt und die Raten von VME und ME ≤3 % gemäß den veröffentlichten Bewertungskriterien^14,15 betragen.

Ergebnisse

Insgesamt wurden 533 Isolate, die über einen Zeitraum von 2,5 Jahren aus klinischen Proben gewonnen wurden, in die Analyse einbezogen. Alle methicillinresistenten CoNS (MR-CoNS)-Isolate und 71,7 % der S. aureus-Isolate wurden als methicillinresistent festgestellt. Wundabstriche waren die häufigsten klinischen Proben mit S. aureus-Isolaten , während MR-CoNS-Isolate am häufigsten aus Blutkulturen gewonnen wurden (Abbildung 1).

Diskussion

Antimikrobielle Resistenz ist eine der bedeutendsten Bedrohungen für die globale öffentliche Gesundheit und trägt zu erhöhten Gesundheitskosten, Behandlungsversagen und Sterblichkeit^bei. Die Häufigkeit sowohl gemeinschaftlicher als auch im Krankenhaus erworbener Infektionen, die durch Staphylococcus aureus verursacht werden, steigt national und weltweit weiter an. Insbesondere Methicillinresistenz ist mit erhöhter Morbidität und Sterblichkeit verbunden; d...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kation-angepasste Mueller-Hinton-Brühe	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland	CM0405B	Für das Bakterienwachstum in der Brühe-Mikroverdünnungsmethode
MALDI-TOF MS	VITEK MS, BioMé Rieux, Frankreich	410893	Zur Bakterienidentifikation
McFarland-Standard	bioMé Rieux, Frankreich	95060-958	Standardisierung des bakteriellen Inokulums
Petrischalen	RTA, Tü rkiye	2102	Für die Mittelzubereitung und Bakterienkultivierung
Pippette Spitze 20 - 200 & mu; L	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland	Z740105	Für die Verteilung der kationenbereinigten Mueller– Hinton-Brühe (CAMHB) in U-Boden-Mikroplatten und Herstellung serieller Verdünnungen
Schafsblutagar	RTA, Tü rkiye	2001	Isolierung und Kultivierung von Mikroorganismen
Staphylococcus aureus	Sammlung der amerikanischen Typkultur	29213	In dieser Studie verwendete Referenzstamm
Teicoplanin-Pulver	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland	T0578	Antibiotika
Tryptische Sojabrühe	Merck, Deutschland	1,054,590,500	Isolierung und Kultivierung von Mikroorganismen
U-Boden-Bohrlochplatte	Thermo Fisher Scientific	163320	Für antimikrobielle Anfälligkeitstests mit der Brühe-Mikroverdünnungsmethode
VITEK 2 AST-P664 Karten	bioMé Rieux, Frankreich	414197	Für antimikrobielle Anfälligkeitstests
VITEK2 Compact	bioMé Rieux, Frankreich	4700030	Für antimikrobielle Anfälligkeitstests