Isolierung von Perizyten aus Mauskortikalgewebe mittels FACS zur Einzelzellsequenzierung

Zusammenfassung

Um die Perizyten des Gehirnkortikats der Maus zu erhalten, die den Anforderungen von scRNA-seq entsprechen, stellen wir ein kritisch optimiertes FACS-Protokoll auf Basis der CD13/CD31⁻-Auswahl vor. Unsere wichtigsten Verfeinerungen verbessern die Zelllebensfähigkeit und die RNA-Integrität erheblich und ermöglichen eine zuverlässige transkriptomische Profilierung.

Zusammenfassung

Perizyten, als Kernbestandteil der neurovaskulären Einheit, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke und der Regulation der zerebralen hämodynamischen Homöostase durch Modulation des mikrovaskulären Tonus. Die Dysfunktion von Perizyten wurde mit einer Vielzahl neurologischer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Um die Heterogenität von Perizyten zu untersuchen und ihre Mechanismen bei neurovaskulären Erkrankungen bei Einzelzellauflösung zu erläutern, entwickelten wir ein optimiertes und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung von Mäus-Gehirnperizyten, die für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung geeignet sind (scRNA-seq). Diese Methode baut auf der etablierten CD13^+/CD31-Sortierstrategie auf, integriert jedoch wichtige Verbesserungen, die speziell für scRNA-seq-Anwendungen entwickelt wurden. Kurz gesagt: Gehirne wurden von drei erwachsenen C57BL/6-Mäusen entnommen. Das Gehirngewebe wurde mechanisch dissoziiert und einer enzymatischen Verdauung unterzogen, um Einzelzell-Suspensionen zu gewinnen. Nach der sequentiellen Zentrifugation wurde das Endzellpellet in einer 20%igen Rinderserum-Albuminlösung (BSA) wieder suspendiert, ein entscheidender Schritt, den wir eingeführt haben, um Stress und Aggregation zu minimieren und so die Viabilität und RNA-Qualität für die Sequenzierung zu maximieren. Dieser optimierte FACS-basierte Ansatz ermöglicht somit die robuste Isolierung lebensfähiger Mäus-Gehirnperizyten, die die strengen Anforderungen für scRNA-seq erfüllen, und bietet ein mächtiges Werkzeug zur Analyse von Perizytenheterogenität und deren pathologischer Rolle bei neurovaskulären Erkrankungen.

Einleitung

Perizyten sind ein wichtiger Zelltyp, der entlang von Mikrogefäßen vorkommt, typischerweise in die Kapillarbasalmembran eingebettet und endotheliale Zellen^umhüllend. Im Gehirn bilden Perizyten zusammen mit Endothelzellen, Astrozyten und anderen Zelltypen die neurovaskuläre Einheit und sind integraler Bestandteil der Struktur und Funktion der Blut-Hirn-Schranke (BBB). Perizyten spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulation des zerebralen Blutflusses, der Gefäßremodellierung und der Aufrechterhaltung der gefäßlichen Homöostase. Sie erhalten die Integrität des BBB durch enge physikalische Interaktionen und parakrine Signalübertragung mit benachbarten Zellen²; den transendothelialen Transport dynamisch durch Endozytose und die Expression spezifischer Transporterproteine zu regulieren; und tragen durch ihre kontraktilen und entspannenden Aktivitäten zur zerebralen hämodynamischen Stabilität^bei. Eine Dysfunktion der Perizyten sowie Veränderungen in ihrer Abdeckung oder Dichte können zu vaskulärer Dysregulation und neurologischen Defiziten führen, was letztlich zu pathologischen Veränderungen im Zusammenhang mit verschiedenen neurologischen^{Erkrankungen führt}. Die inhärente Heterogenität der Perizyten stellt jedoch erhebliche Herausforderungen für weitere mechanistische Studien dar.

Mit dem Fortschritt der Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnologie (scRNA-seq) haben immer mehr Studien scRNA-seq genutzt, um zelluläre Heterogenität zu erforschen und wichtige Ziele in der Pathogenese und dem Verlauf von Krankheiten zu identifizieren. Häufig verwendete Perizytenmarker sind der thrombozytenabgeleitete Wachstumsfaktor-Rezeptor-Beta-Faktor (PDGFR-β)⁵, das Neuron-Glialantigen 2 (NG2) und Alpha-glattes Muskel-Aktin (α-SMA). Diese Marker haben jedoch eine relativ geringe Spezifität⁶, da sie gleichzeitig andere Gefäßzellen wie glatte Muskelzellen und neuronale Vorläuferzellen wie Oligodendrozyten-Vorläuferzellen markieren können, was es erschwert, Perizyten von anderen Gehirnzellen zu unterscheiden. Auf der Suche nach einer robusteren Alternative wandten wir uns CD13 (Aminopeptidase N, APN) zu, einem Marker, der in früheren Studien 7,8,9,10 weithin für seine starke und konsistente Expression in zerebrovaskulären Perizyten anerkannt ist. In unserer Studie führten wir eine Immunfluoreszenzfärbung an Hirngewebeschnitten durch, und die Ergebnisse bestätigten die CD13-Expression bei Perizyten, was ihre Wirksamkeit bei der Unterscheidung von Perizyten von Endothelzellen zeigte, da das CD13-Signal ausschließlich mit perivaskulären Zellen assoziiert war und in CD31⁺-Endothelzellen fehlte. (Abbildung 1A). Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die CD13-Expression nicht ausschließlich auf Perizyten beschränkt ist; Nachweisbare Werte werden auch in glatten Muskelzellen der Arteriolen und Venulen beobachtet (Abbildung 1B,C).

Abbildung 1: Immunfluoreszenzfärbung zeigt CD13-Expression in hirnvaskulären Perizyten und glatten Muskelzellen, ohne nachweisbares Signal in Endothelzellen. (A) Repräsentative Immunfluoreszenzbildgebung der arteriolen-kapillaren Übergangszone in der Mikrovaskulatur des Gehirns. Das zusammengeführte Bild zeigt CD13⁺ Perizyt (grün), der CD31⁺ Endothelzellen (rot) umhüllt. α-SMA⁺ glatte Muskelzellen (Cyan) sind im arteriolären Bereich lokalisiert und fehlen in den Kapillaren. (B) Querschnitt einer Arteriole. Die Bilder zeigen eine klare Kolokalisierung von CD13⁺-Perizyten (grün) und α-SMA⁺ glatten Muskelzellen (Cyan) in der umgebenden glatten Muskelschicht und bestätigen die CD13-Expression in arteriolären glatten Muskelzellen. (C) Querschnitt einer Venule. Ähnlich ist CD13 (grün) in den glatten Muskelzellen (Pfeilspitzen der α-SMA der Venularwand nachweisbar. Skalenbalken: 20 μm (A-C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Um Maus-kortikale Gefäßperizyten zu erhalten, die die Anforderungen für scRNA-seq erfüllen, führten wir eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit CD13⁺/CD31⁻-Antikörper-Kennzeichnung für die Perizyten-Isolierung¹¹ durch. Anfangs wurden CD45- und CD41-Marker verwendet, um hämatopoätische Zellen aus Hirngewebesuspensionen^{auszuschließen 12}. Anschließend wurden Perizyten durch Selektion für CD13^+-Zellen angereichert, und Endothelzellen wurden weiter ausgeschlossen, indem sie für CD31-Populationen gating, wodurch die Ziel-Perizytenpopulation¹³ isoliert wurde.

Wir erkennen an, dass der CD13-positive Selektionsschritt gleichzeitig CD13-exprimierende glatte Muskelzellen sowohl von Arteriolen als auch von Venulen erfasst. Um die kritischen Anforderungen für scRNA-seq zu erfüllen und die Perizytenretention zu maximieren, wählten wir diese Markerkombination strategisch aus, um die Perizytenerträge in der Sortierphase zu priorisieren. Obwohl dieser Ansatz zur Ko-Isolierung einer kleinen Population glatter Muskelzellen führt, maximiert er effektiv die Wiederherstellung aller potenziellen Perizyten während der vorläufigen Anreicherungsphase. Diese schrittweise Gating-Strategie minimiert den anfänglichen Cellverlust erheblich. Zusätzlich haben wir, um die Perizytenlebensfähigkeit und -erträge zu maximieren, eine 20%ige BSA-Lösung für die Resuspension und Filtration der Zellen nach der Dissoziation verwendet, wodurch Schmutz effektiv entfernt und die Zelllebensfähigkeit sowie Reinheit¹⁴ erhalten bleiben.

Mit dieser Methode haben wir die Hirn-Gefäßperizyten erfolgreich von anderen Zelltypen unterschieden und so hochreine und lebensfähige Perizytenpräparate erreicht, die die strengen Anforderungen an scRNA-seq erfüllen. Diese Technik bietet eine solide Grundlage für spätere eingehende Untersuchungen der Rolle von Perizyten in verschiedenen Krankheitskontexten.

Protokoll

In dieser Studie verwendeten wir drei erwachsene C57BL/6J-Mäuse (3 Monate alt, 20–25 g). Alle Mäuse wurden in einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus mit streng kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit untergebracht, mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser vor den Experimenten. Alle experimentellen Verfahren mit Labortieren wurden vom Ausschuss für Labortierpflege und -ethik des Instituts für Mikrozirkulation, der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften und dem Peking Union Medical College genehmigt und in strikter Übereinstimmung mit den relevanten Tierschutzrichtlinien durchgeführt.

1. Reagenzvorbereitung

1. 30% (Wt/vol) Glukoselösung: 15 g Glukose in 50 ml UltraPure DNase/RNase-freier dH₂O auflösen. Um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten, geben Sie zunächst Glukose zu 20 ml UltraPure DNase/RNase-freiem dH₂O und mischen Sie gründlich. Dann fügen Sie UltraPure DNase/RNase-freies DH₂O zu einem Endvolumen von 50 ml hinzu. Filtern Sie die Lösung und lagern Sie sie bis zu 6 Monate bei 4 °C.
2. DNase I (10 mg/mL): Lösen Sie 50 mg DNase I in 5 mL sterilen ddH₂O. Die Serienlösung kann bei -20 °C bis zu 2 Monate gelagert werden.
   HINWEIS: Wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen sollten strikt vermieden werden, um einen enzymatischen Aktivitätsverlust zu verhindern. Um die Einfrier-Tau-Wirkung zu minimieren, wird 150 μL der Lösung vor dem ersten Einfrieren in sterile Mikrozentrifugenröhren geautet und einzelne Aliquots bei Bedarf für Experimente aufgetaut.
3. 2 % (vol/vol) fetales Rinderserum (FBS) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS): Bereiten Sie 1× PBS vor, indem Sie 5 ml 10× PBS mit 45 ml UltraPure DNase/RNase-freiem dH₂O mischen. Geben Sie 1 ml FBS zu 49 mL 1× PBS und vermischen Sie gründlich.
   HINWEIS: Bereiten Sie diese Lösung während Schritt 2.1.2 frisch vor. Stellen Sie 15 ml pro Gewebeprobe bereit.
4. Kollagenase- und Dispase-(CD)-Enzym-Lagerlösung: 100 mg Dispase und 100 mg Kollagenase jeweils separat in 1 ml UltraPure DNase/RNase-freiem dH₂O auflösen. Kombinieren Sie die Lösungen, um ein Endvolumen von 2 mL (100 mg/mL Enzymkonzentration) zu erhalten.
   HINWEIS: Aliquot 500 μL in sterile Mikrozentrifugenröhren und bei -20 °C lagern. Vortex vor der Anwendung, um Aktivitätsverlust durch Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Es ist wichtig zu beachten, dass die Puderform starke Haut- und Augenreizungen sowie Atemnot verursachen kann. Immer mit einer chemischen Abgashaube umgehen, während du Nitrilhandschuhe und eine N95-Maske trägst. Im Falle einer Exposition bewässern Sie den betroffenen Bereich sofort mit reichlich Wasser und suchen Sie medizinische Hilfe auf.
5. CD-Enzym-Arbeitslösung: 1,5 ml CD-Enzym-Stocklösung mit 43,5 ml 2 % (vol/vol) FBS in PBS (ab Schritt 1.3) durch sanfte Inversion mischen.
   HINWEIS: Bereiten Sie sich unmittelbar vor der Gewebedissoziation vor (Schritt 2.3.4). Dieses Volumen ist für drei Mäuse optimiert; Anpassen Sie proportional nach Bedarf.
6. 22 % (Vol/vol) Percoll-Lösung: Kombinieren Sie 11 ml Percoll, 5 mL 10× PBS und 34 ml UltraPure DNase/RNase-freies dH₂O, um eine 50 mL Lösung herzustellen.
   HINWEIS: Filtersterilisieren durch eine 0,22 μm PES-Membran. Sie kann einen Monat lang bei 4 °C gelagert werden, ohne dass die Stabilität erheblich verloren geht.
7. Mechanischer Dissoziationspuffer: Fügen Sie 1 ml DNase I (10 mg/ml) zu 10 ml 2 % (vol/vol) FBS in PBS (ab Schritt 1,3) hinzu. Mischen Sie durch Pipettern.
8. BSA-Lösungen: Bereiten Sie 1 %, 20 % und 35 % (Wt/Vol) BSA-Lösungen separat wie folgt vor:
   1. 1 % (Wt/vol) BSA: 0,15 g BSA in 15 mL Dulbeccos Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) auflösen.
   2. 20 % (Wt/vol) BSA: 3 g BSA in 15 ml DPBS auflösen.
   3. 35 % (Wt/vol) BSA: 0,7 g BSA in 2 ml DPBS auflösen.
      HINWEIS: Filtern Sie alle Lösungen vor der Anwendung durch eine 0,22 μm PES-Membran.
9. Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)/BSA/Glukosepuffer: Fügen Sie 167 μL 30% (Wt/vol) Glukose (ab Schritt 1.1) und 1,4 ml 35% (Wt/vol) BSA (ab Schritt 1.8) zu 50 mL HBSS hinzu und mischen Sie vorsichtig.
   HINWEIS: Bereiten Sie diese Lösung frisch unter sterilen Bedingungen in Schritt 2.1.2 vor. Lagern Sie bei 4 °C bis zur Verwendung.
10. Gewebeabnahmepuffer: Ergänzen Sie 12 ml HBSS/BSA/Glukosepuffer (ab Schritt 1,9) mit 800 μL DNase I (10 mg/mL). Verwendung zur temporären Gewebelagerung und zum Spülen der Pipetten.
    HINWEIS: Bereiten Sie diese Lösung frisch unter sterilen Bedingungen in Schritt 2.1.2 vor.
11. 1,25 % (w/v) Tribromoethanol-Lösung: 1,25 g 2,2,2-Tribromoethanol in 2,5 ml 2-Methyl-2-Butanol auflösen und diese Mischung dann 97,5 ml sterilen ddH₂O oder physiologischer Kochsalzlösung hinzufügen, um eine klare 1,25%ige Tribromoethanol-Lösung zu erhalten.
    HINWEIS: Bereiten Sie die Lösung vor jeder Verwendung frisch vor. Bewahren Sie es bei Raumtemperatur vor Licht auf und verwenden Sie es umgehend.

2. Experimentelles Verfahren (mit drei Mäusen als Beispiel)

1. Vorbereitung vor dem Experiment (Timing: 30 min)
   1. Ein Autoklav benötigte Verbrauchsgüter und desinfizierte chirurgische Instrumente mit 75 % (Vol/Vol) Ethanol.
   2. Bereite Arbeitslösungen vor: 1× PBS (ab Schritt 1.3), 2% (Bd/Bd) FBS in PBS (ab Schritt 1.3), HBSS/BSA/Glukoselösung (ab Schritt 1.9) und Gewebeabnahmepuffer (ab Schritt 1.10).
   3. Gieße 10 ml 1× PBS in eine 10 cm große Zell-Cluture-Schüssel und stelle sie auf Eis.
   4. Bereiten Sie drei Ampullen vor, fügen Sie jeweils 3 ml Gewebeabholpuffer hinzu und lassen Sie sie auf Eis.
   5. Bereite drei 15-mL-Zentrifugenröhren vor, gib jeweils 10 ml 2% (vol/vol) FBS in PBS hinzu und stelle sie auf Eis.
2. Mäuse-Gehirnentnahme (Timing: 30 Min.)
   1. Mäuse wurden tief betäubt durch intraperitoneale Injektion von Tribromoethanol (aus Schritt 1.11) in einer Dosis von 0,2 mL pro 10 g Körpergewicht. Nach dem Verlust der Pedalreflexe wurde die Euthanasie durch eine zervikale Verrenkung durchgeführt.
      HINWEIS: Wenn die Maus innerhalb von 5–10 Minuten nach der Injektion nicht eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreichte (beurteilt durch das Ausbleiben eines Pedalrückzugsreflexes), wurde eine zusätzliche intraperitoneale Dosis Tribromoethanol verabreicht, die einem Drittel der Anfangsdosis entspricht.
   2. Besprühe den Bereich von Kopf und Hals mit 75 % Ethanol. Machen Sie einen Schnitt auf der mittleren Kopfhaut vom Okzipital- bis zum Frontall, um den Schädel freizulegen. Führen Sie einen transversalen Schnitt vor den beidseitigen Augenhöhlen vor, gefolgt von lateralen Einschnitten entlang der unteren Ränder des Kleinhirns, um die Schädelbasis abzutrennen. Schließlich wird das Kalvarium längs entlang der sagittalen Naht von hinten nach vorne eingeschnitten. Heben Sie die Schädellappe an, um das von der Dura umschlossene Gehirn freizulegen. Das Gehirn vorsichtig anheben, während die Sehnerven und die Verbindung zwischen Medulla oblongata und Rückenmark mit chirurgischer Schere¹⁵ durchtrennt werden. Setzen Sie das intakte Gehirn in eine 10 cm große Schale mit 10 ml eiskalten 1× PBS.
      HINWEIS: Behandeln Sie das Gewebe vorsichtig, um Schäden zu vermeiden.
   3. Übertragen Sie das Gehirn auf Alufolie. Mit einer Pinzette hebt man die Dura Mater von den Rändern ab und entfernt sie entlang der Mittellinien-Sulci. Nach vollständiger Entfernung der Dura legen Sie den Subarachnoidalraum frei. Spülen Sie den Subarachnoidalraum mit einer HBSS-Lösung ab, sezieren Sie dann die Gefäße mit einer stumpfen Nadel und entfernen Sie vorsichtig die Pia Mater¹⁶. Schneiden Sie das Gehirn koronal in 2–3 mm dicke Scheiben mit einer Rasierklinge. Verwerfen Sie die Riechknolle und die vorderste Abschnitte. Isolieren Sie den Großhirnrinden entlang des Corpus callosum und übertragen Sie kortikales Gewebe auf Ampullen mit 3 ml eiskaltem Gewebepuffer¹¹.
   4. Die Perizytenisolation in diesem Protokoll richtet sich speziell an den Großhirnrinde. Für andere Interessensgebiete: Platziere koronale Schnitte in einem Zwei-Well-Slide mit einem Verlust von 2 % (Vol/Vol) FBS in PBS. Zielregionen unter Dissektionsmikroskopie identifizieren, manuell isolieren und mit identischen weiteren Verarbeitungsschritten fortfahren.
3. Gewebedissoziation (Timing: 3–3,5 Stunden)
   1. Zerkleinern Sie Gewebe in Ampullen mit chirurgischen Skalpellen in Fragmente von etwa 1 mm × 1 mm.
      HINWEIS: Das Hacken innerhalb von 5 Minuten vollständig abschließen, um die Frische des Gewebes zu erhalten.
   2. Pipettenspitzen mit Gewebeabnahmepuffer vorabspülen. Langsam aspirieren Sie gehackte Fragmente in Richtung der Spitze der Spitze, während Sie die vertikale Ausrichtung (Spitze nach unten) beibehalten. Fragmente werden vorsichtig in vorgekühlte 15-mL-Zentrifugenröhren ausgestoßen (vorbereitet in Schritt 2.1.5).
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, Fragmente in den oberen Lauf zu aspirieren, um eine Haftung an der Pipettenwand zu verhindern.
   3. Waschen Sie fragmenthaltige Ampullen (ab Schritt 2.3.1) mit 2 % (vol/vol) FBS in PBS und übertragen Sie die Waschanlage in Zentrifugenröhren. Zentrifugiere bei 300 x g bei 4 °C für 5 Minuten.
   4. Entsorge Übersupernatanten nach der Zentrifugation. Pellets pro Tube in 3 ml CD-Enzym-Arbeitslösung (ab Schritt 1,5) wieder suspendieren. Aliquot jede Suspension gleichmäßig in drei Röhren (insgesamt 9 Röhren, 1 mL/Röhre) und dann mit 4 mL CD-Enzym-Arbeitslösung ergänzen (Endvolumen: 5 mL/Röhre).
   5. Röhrchen in einem 37 °C Hybridisierungsofen für 100 Minuten mit Orbitalschütteln bei 100 x g¹⁴ inkubieren.
   6. Bereiten Sie während der Inkubation eine Gewebedissoziationslösung vor, indem Sie 1 ml DNase-I-Lösung zu 10 ml 2 % (vol/vol) FBS in PBS (ab Schritt 1.10) hinzufügen.
   7. Beenden Sie die Verdauung durch Zentrifugation bei 300 x g bei 4 °C für 5 Minuten.
      HINWEIS: Untersuchen Sie die Verdautungseffizienz mikroskopisch mit einem 10-20 μL Aliquot. Der ideale Endpunkt zeigt sich als perlenartige Gefäßfragmente; Verlängerte Gefäßsegmente deuten auf Unterverdauung hin, während überwiegend Einzelzellen auf Überverdauung hindeuten.
   8. Kuppels pro Röhre in 1 ml Gewebedissoziationslösung neu suspendieren. Dissoziiere mechanisch, indem du 100 mal¹¹ pipetterst.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine vollständige Pipettenvolumenaspiration, um die Blasenbildung zu minimieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
   9. Sammeln Sie alle Suspensionen (aus insgesamt 9 Verdauungsröhren, die das Gehirngewebe von 3 Mäusen repräsentieren) in ein 50-mL-Zentrifugenrohr. Spülen Sie jede Verdauungstube mit 2 ml 2% (vol/vol) FBS in PBS und kombinieren Sie die Waschungen. Zentrifugiere bei 300 x g bei 4 °C für 5 Minuten.
   10. Nach der Zentrifugation sind deutliche Schichten sichtbar. Entsorgen Sie sorgfältig die oberste Schicht (mit Verunreinigungen und kleinen Zellresten), während die Zwischenschicht (bestehend aus Zellen oder Zellclustern mit geringerer Dichte) und die untere Schicht (intakte Zellen und teilweise unverdaute Gewebefragmente) erhalten bleibt. Gib 12,5 ml 20%ige BSA-Lösung hinzu und drehe das Rohr vorsichtig um, um die Pellets wieder aufzuhängen. Zentrifugieren Sie erneut bei 1000 × g bei 4 °C für 20 Minuten.
   11. Sammeln Sie das untere Pellet (angereichert in intakten Zellen mit höherer Reinheit) und übertragen Sie das Supernatant (hauptsächlich mit Myelinresten, Lipiden und einer kleinen Anzahl von Zellen) in ein neues 50-ml-Zentrifugenrohr. Durch sanfte Inversion wieder suspendieren und 20 Minuten bei 1.000 x g bei 4 °C zentrifugieren.
   12. Suspendiere jedes Pellet, das aus den beiden Zentrifugationsschritten (Schritt 2.3.10 und Schritt 2.3.11) gewonnen wurde, in jeweils 2 mL 2 % (Vol/vol) FBS in PBS (Endvolumen: 4 mL).
       HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Rohrwände während der Resuspension zu berühren, um die Kontamination durch Trümmer zu minimieren.
   13. Kombinieren Sie die beiden neu aufgehängten Suspensionen aus dem vorherigen Schritt zu einem 15-mL-Zentrifugenrohr. Zentrifugiere bei 300 × g, 4 °C für 5 Minuten. Entsorgen Sie das Supernatant (Abfallpuffer, der BSA, Zellreste und möglicherweise Spuren von Rest-Myelinlipiden enthält). Setzen Sie das Pellet (die endgültig gereinigte und gewaschene, hochreine intakte Zielzellen) in 2 ml PBS-Lösung mit 2 % FBS auf.
       HINWEIS: Dieser Schritt besteht darin, die Zellen in einen sauberen, geeigneten Aufhängungspuffer für nachgelagerte Anwendungen zu übertragen.
   14. Bereiten Sie vier 15-mL-Zentrifugenröhren vor, die jeweils 4 mL 22%ige Percoll-Lösung enthalten. Schichten Sie vorsichtig 0,5 mL Aliquots der Resuspension auf den Percoll-Gradienten (insgesamt vier Aliquots), um die Zellausbeute zu maximieren. Zentrifugiere bei 560 x g bei 4 °C für 10 Minuten.
       HINWEIS: Stellen Sie die Zentrifuge auf "keine Bremse" ein, um eine wirbelinduzierte Störung des Dichtegradienten zu vermeiden und sicherzustellen, dass Myelinreste im Supernatant stabilisiert bleiben.
   15. Saugen Sie vorsichtig Supernatanten an. Pellets pro Tube in 1 ml HBSS/BSA/Glukosepuffer wieder suspendieren. Poolaufhängungen in ein neues 15-mL-Rohr. Spüle Percoll-Tuben mit 2 ml HBSS/BSA/Glukosepuffer und kombiniere Waschungen. Zentrifugiere mit 300 x g bei 4 °C für 5 Minuten).
4. Vorbereitung und Erfassung von Flowzytometrie-Sortierung (Timing: 50 min)
   1. Atmen Sie vorsichtig das Überwassermittel ab. Suspendiere das Zellpellet in 1 ml HBSS/BSA/Glukosepuffer neu.
   2. Gib 5 μL Fc-Rezeptor (FcR) blockierendes Reagenz zur Zellsuspension und inkubiere bei 4 °C für 5 Minuten.
   3. Fügen Sie der Zellsuspension die folgenden fluoreszenzkonjugierten Antikörper bei den angegebenen Volumina (ausreichend für Gewebe von 3 Mäusen) hinzu: 5 μL CD45-PE; 5 μL CD41-PE; 20 μL CD31-APC; 15 μL CD13-FITC.
   4. Inkubiere die Zellen 20 Minuten lang im Dunkeln auf Eis.
      HINWEIS: Schützen Sie vor Licht. Vermeide das Rühren.
   5. Gib 6 ml HBSS/BSA/Glukosepuffer hinzu, um die Zellen zu reinigen. Zentrifugiere bei 300 x g bei 4 °C für 5 Minuten.
   6. Aspiriere das Supernatant. Suspendiere das Zellpellet in 1 ml HBSS/BSA/Glukosepuffer neu. Fügen Sie 200 μL 7-Aminoactinomycin-D (7-AAD)-Lösung hinzu (um abgestorbene Zellen auszuschließen) und inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis. Anschließend stellen Sie die Lautstärke mit HBSS/BSA/Glukosepuffer auf 2 ml ein.
      HINWEIS: Schützen Sie vor Licht.
   7. Gib 1 % BSA-Lösung in die Sortier-Sammelröhren (15 ml konische Röhren) und spüle vorsichtig die Innenflächen ab. Aspiratiere überschüssige Lösung, wobei in jedem Röhrchen genau 1 ml 1 % BSA-Lösung übrig bleibt, um sortierte Zellen aufzunehmen. Vorübergehend auf Eis lagern.
   8. Filtern Sie die gefärbte Zellsuspension unmittelbar vor der Sortierung durch ein 40 μm großes Sieb.
   9. Richte ein initiales Gatter auf Basis von Forward Scatter (FSC-A) und Side Scatter (SSC-A) Parametern ein, um zelluläre Trümmer mit niedrigen FSC-A/SSC-A-Signalen auszuschließen.
   10. Die Depletion hämatopoietischer Linienzellen wurde durch dual-negatives Gating für CD45 und CD41 erreicht, wodurch die Kontamination durch Leukozyten, Immunzellen und Blutplättchen effektiv eliminiert wurde.
   11. Vermutete Perizyten durch CD13-positive Selektion aus Gefäßwandzellen erfassen.
   12. Bewertung der Membranintegrität mittels 7-AAD-Fluoreszenzsonde; apoptotische Zellen durch 7-AAD⁻-Gating ausschließen.
       HINWEIS: Sammeln Sie hochreine CD31⁻/CD13⁺ Perizyten durch CD31-negative Selektion. Sammeln Sie die sortierten Perizyten direkt in Tuben mit 1 % BSA (aus Schritt 2.4.7) und legen Sie sie auf Eis. Bereiten Sie sofort Einzelzell-Suspensionen zum Zählen vor. Dann laden Sie die Proben direkt zur Sequenzierung ohne zwischenentwickelte Kulturschritte.
5. scRNA Seq und Analyse (Tming: 3–4 Tage)
   1. Einzelzellige Suspensionen sortierter Perizyten wurden nach dem Protokoll aus dem 10x Genomics "GEM-X Universal 3' Gene Expression v4 4-plex Reagent Kits User Guide" (CG000731)^17,18 vorbereitet. Die zum Laden vorbereitete Zellsuspension hatte eine Viabilität von > 90 % und wurde auf eine Konzentration im empfohlenen Bereich von 300–2000 Zellen/μL verdünnt.
   2. Kombinieren Sie Einzelzellsuspension mit gebarcodeten Gelperlen und Enzymen und teilen Sie sie dann in Gelperlen in Emulsion (GEMs) mittels mikrofluidischer Tröpfchenkapselung¹⁹. Durchführung von In-situ-Zelllyse , Reverse-Transkription und Barcode-cDNA-Verknüpfung.
   3. Zerstöre GEMs, um Produkte zurückzugewinnen. Amplifizieren Sie cDNA mittels PCR mit folgendem Protokoll: Anfängliche Denaturierung bei 9 °C für 4 Sekunden; gefolgt von Zyklen (13 Zyklen für <500 Zielzellen, 12 Zyklen für 501–6000 Zielzellen), bestehend aus Denaturierung bei 9 °C für 2 Sekunden, Glühen bei 9 °C für 3 Sekunden und Verlängerung bei 7 °C für 6 Sekunden pro Zyklus; und eine letzte Verlängerung bei 72 °C für 1 Minute, gefolgt von einem Halten bei 4 °C. Validiere die amplifizierten Produkte hinsichtlich Fragmentgröße (200–300 bp) und Ausbeute.
      HINWEIS: Die Amplifikationsprodukte können bei bis zu 72 Stunden bei 4 °C oder eine Woche bei -2 °C gelagert werden, oder sie können direkt im nächsten Schritt verarbeitet werden.
   4. Für qualifizierte cDNA: Fragmentieren, Endreparatur durchführen, P7-Adapter ligatieren und mit Indexprimern amplifizieren. Größenauswahl von Fragmenten, um Sequenzbibliotheken zu konstruieren.
   5. Sequenzbibliotheken auf der Illumina NovaSeq-Plattform nach QC-Validierung.
   6. Demultiplex-Sequenzierungsdaten zur Extraktion von Zellbarcodes, eindeutigen molekularen Identifikatoren (UMIs) und RNA-Sequenzen. Align liest zum Referenzgenom.
   7. Quantifizieren Sie UMI-Zählen, schätzen Sie gültige Zellzahlen und erstellen Sie eine Gen-Barcode-Expressionsmatrix²⁰.
   8. Entfernen Sie Doublets mit dem DoubletFinder-Paket (v2.0.6) in R. Vorhersagen basierend auf künstlicher Identifikation des nächstgelegenen Nachbarn, um die Datenqualität sicherzustellen.
   9. Führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) und eine Dimensionsreduktion der Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) mit Seurat (v5.0) durch. Identifizieren Sie Zellcluster und visualisieren Sie perizytenspezifische Markergene, um die zelluläre Identität zu validieren.

Ergebnisse

Um eine präzise Isolierung von Hirnperizyten zu erreichen, wurden Zellen, die vom Gehirngewebe dissoziiert sind, mit PE Texas Rotkonjugiertem Anti-Maus-Anti-Maus-CD41/CD45, FITC-konjugiertem Anti-Maus-CD13 und APC-konjugiertem Anti-Maus-CD31 gefärbt, wodurch eine mehrstufige Sortierstrategie etabliert wurde, die Oberflächenmarker und Viabilitätserkennung integriert (Abbildung 2). Das anfängliche Gating basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC-A) und Seitenstreuun...

Diskussion

Diese Studie beschreibt eine systematisch optimierte und validierte FACS-Strategie basierend auf CD13/CD31⁻-Mehrfarb-Kennzeichnung für die hocheffiziente Isolierung von Gehirn-Perizyten^{im Gehirn 24}. Flowzytometrische und anschließende scRNA-seq-Analysen bestätigten, dass die Methode Perizyten von Endothelzellen präzise unterscheidet und Zellen liefert, die alle wichtigen Qualitätskontrollkennzahlen für scRNA-seq konsistent erfüllen, einschließlich Viabilität, Aggr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibicol	A5669701	Aliquot und bei -20°C lagern; kann nach dem Auftauen bis zu 1 Woche bei 4°C gelagert werden
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7,4)	Life Technologies	70011-044	Vor Gebrauch zum Zellwaschen verdünnen
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	Zur Herstellung des Zellenergiepuffers
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A1933-25g	Schützt Zellen und verhindert Adhäsion
Dulbecco's  Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)	Gibco	14190-144
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS,1×)	Life Technologies	14175-095	Zum Zellwaschen und Resuspendieren
UltraPure DNase/RNase-Free Destilliertes Wasser	Life Technologies	10977-015	Zur Herstellung nukleasenfreier Reaktionssysteme
Collagenase/Dispase	Sigma-Aldrich	11097113001-100mg	Zur Gewebeverdauung und Zelldissoziation; aliquotieren und bei -20°C lagern
DNaseI(RNase-Free)	TIANGEN	RT411-1500U	Verhindert DNA-Aggregation; aliquotieren und bei -20°C lagern
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-100ML	Zur Zelltrennung; bei 4°C lagern
FITC Rat Anti-Mouse CD13	BD Biosciences	558744	Fluoreszentes Konjugat; geschützt vor Licht bei 4°C bis zu 1 Monat lagern
APC Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	551262	Geschützt vor Licht bei 4°C mehrere Monate lagern
PE Rat Anti-Mouse CD41	BD Biosciences	558040	Geschützt vor Licht bei 4°C mehrere Monate lagern
PE Rat Anti-Mouse CD45	BD Biosciences	553081	Geschützt vor Licht bei 4°C mehrere Monate lagern
FITC Rat IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	552916	Fluoreszenzkontrolle; geschützt vor Licht bei 4°C lagern
APC Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	553932	Geschützt vor Licht bei 4°C mehrere Monate lagern
PE Rat IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	553989	Geschützt vor Licht bei 4°C mehrere Monate lagern
RNase AWAY Dekontaminationsreagenz	Ambion	10328011	Zur Beseitigung von RNase-Kontamination
Gereinigtes Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Verhindert nicht-spezifische Antikörperbindung
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	559925	Zur Ausschlussanalyse lebender Zellen
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25g	Zur Herstellung der 1,25%igen (w/v) Tribromoethanol-Lösung
2-Methyl-2-butanol	Psaitong	M20008-500mL	Zur Herstellung der 1,25%igen (w/v) Tribromoethanol-Lösung
C57BL/6 Maus	Jiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	SYXK (Su) 2020-0041
50 mL Zentrifugenrohr	Corning	430291
15 mL Zentrifugenrohr	Corning	430791
Zellkulturschale 100mm×20mm	Corning	430167
Cell Ranger		3.1.0/4.0.0	Software zur Analyse von Single-Cell-Sequenzierungsdaten
Loupe Cell Browser		4.1	Zellbrowser
STAR		2.5.1b	RNA-Alignment
irlbpy		-	Hauptkomponentenanalyse
tsne		0.15	Barnes-Hut t-SNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding) Analyse
k-means		0.17	K-Means-Clustering
graph-based clustering		0.17	Graph-basiertes Clustering
FastQC		v0.11.2	Datenqualitätskontrolle (QC)