Methodenartikel

Eine neuartige Plattform für in vitro zelluläre Dehnung und Bildgebung

DOI:

10.3791/69779

⸱

10. März 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein neuartiges Gerät vor, das isotrope und uniaxiale Dehnungswellenformen auf Zellen anwendet und gleichzeitig Kultur auf Substraten mit abstimmbarer Steifigkeit und anpassbaren Proteinmatrizen unterstützt. Diese einfache, wirtschaftliche Plattform ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie mechanische Hinweise die zelluläre Funktion sowohl in grundlegenden Studien als auch in krankheitsrelevanten Kontexten regulieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zellen reagieren auf mechanische Signale aus ihrer Umgebung, wie Veränderungen der Steifigkeit der extrazellulären Matrix (ECM) und zyklischer Dehnung, die zelluläre Prozesse wie die Bestimmung des Zellschicksals, interzelluläre Kommunikation und Entwicklung steuern. Veränderungen dieser Kräfte tragen bei Erkrankungen wie Asthma, Bluthochdruck und Krebs zu oder treiben das Fortschreiten der Krankheit voran. Während bestehende In-vitro-Dehnungsgeräte uniaxiale oder isotrope Dehnungen verursachen können, verwenden sie oft nicht-physiologische Steifigkeiten, begrenzen Live-Bildgebung oder können keine hohen Dehnungsamplituden erreichen, die für physiologische und pathologische Bedingungen relevant sind. Hier präsentieren wir ein kompaktes, mikroskop-kompatibles Stretcher-Gerät, das kontrollierte isotrope oder uniaxiale Dehnung auf adhärente Zellen auf elastomeren Kulturschalen anwendet. Diese Schüssel verfügen über ein abstimmbares Youngs-Modul und sind mit verschiedenen Matrixproteinbeschichtungen für die Zelladhäsion kompatibel, was eine unabhängige Modulation der Substratsteifigkeit und ECM-Zusammensetzung ermöglicht. Wichtig ist, dass die einfache Bedienung des Geräts durch sein vom Schrittmotor angetriebenes Design erleichtert wird, das die Erzeugung programmierbarer zyklischer Wellenformen unterstützt. Wir demonstrieren die Leistungsfähigkeit des Geräts, indem wir die intrazelluläre Kalziumdynamik und die Zugkräfte der Zellen der Zellen der primären menschlichen Atemwege unter mechanischer Dehnung quantifizieren. Diese Plattform bietet ein vielseitiges Werkzeug, um die Wirkung mechanischer Hinweise auf die zelluläre Funktion sowohl in gesunden als auch in krankheitsrelevanten Kontexten zu untersuchen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zellen sind mechanischen Kräften aus ihrer Umgebung ausgesetzt, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung vieler Aspekte der zellulären Funktion spielen, einschließlich der Bestimmung des Zellschicksals 1,2, interzellulärer Kommunikation 3,4 und gesundem Wachstum 2,5. Zusätzlich können Veränderungen dieser mechanischen Kräfte zu einem erhöhten Krankheitsfortschritt und Ausbruch der Krankheit führen, einschließlich derUmstrukturierung der extrazellulären Matrix (ECM) 6 und Tumorwachstum 7,8,9,10. Zellen können diese mechanischen Signale wahrnehmen und darauf reagieren, darunter Veränderungen der Steifigkeit des ECM4 sowie zyklische Belastungen in Organen wie Herz, Lunge und Muskeln11,12. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass ECM-Steifheit und -Zusammensetzung die Steifigkeit des Zellzytoskeletts sowohl in Ruhe als auch nach der Exposition gegenüber kontraktilen Agonistenbeeinflussen können 13. Zahlreiche In-vitro- und In-situ-Studien haben untersucht, wie transient, statische und zyklische Stämme Zellen und Gewebe beeinflussen, und gezeigt, dass die Reaktionen je nach Stammtyp, Frequenz und Amplitude14 variieren. Zum Beispiel haben neuere Studien gezeigt, dass eine temporäre Dehnung die Steifheit der adhärenten Zellen proportional zur angelegten Dehnung verringert, wobei eine anhaltende Zunahme der Dehnung zu einer anfänglichen schnellen Steifigkeit führt, gefolgt von einer allmählichenEntspannung von 15. Außerdem wird die Calcium-Signalübertragung, der primäre molekulare Regulator der Kraftbildung, durch Dehnung und andere mechanische Kräftebeeinflusst 4,16,17,18,19,20. Die Untersuchung, wie Steifheit und Dehnung mechanobiologische Wege beeinflussen, erfordert die Modulation beider Faktoren bei der Überwachung der zellulären Reaktionen. Daher entwickelten wir einen neuartigen, mikroskopkompatiblen Zellstrecker, der entweder isotrope oder einaxiale Dehnung induzieren kann, mit unabhängiger Kontrolle über Substratsteifigkeit, Matrixproteinbeschichtung und eine Reihe programmierbarer Wellenformen.

In der Vergangenheit haben Forscher ähnlich Geräte entwickelt, um spezifische Bewegungen und mechanische Dehnungen auf Zellkulturen und Gewebeauszuüben. Der einfachste Fall, die einaxiale Bewegung, ist eine mechanische Dehnung, die auf eine einzige Dimension gelegt wird. Beispielsweise wurden einige Geräte entwickelt, um mechanische Dehnung und Belastung auf Gewebestreifen23 und Kollagenfasern24 auszuüben oder die Zellorientierung auszurichten und Zellmigration25 zu induzieren. Isotrope Dehnung bezeichnet eine Art der Dehnung, bei der eine gleichmäßige Kraft aus allen Richtungen auf ein Gel oder Substrat ausgeübt wird, was zu einer gleichmäßigen Dehnung über das Material führt. Diese Dehnung simuliert die gleichmäßige Kraftverteilung, die Zellen in bestimmten physiologischen Umgebungen erfahren, etwa in den Alveolen der Lunge, wo Zellen während des Atemprozesses radialer Expansion und Kontraktion ausgesetzt sind.

Bestehende Traggeräte haben mehrere Einschränkungen, die ihren Einsatz für mechanologische Forschung einschränken. Viele Entwürfe verwenden Substratsteifigkeitswerte, die den typischen physiologischen Bereich überschreiten, um mechanische Belastungen standzuhalten und das Gewicht des Zellkulturmediums28 zu tragen. Allerdings kann die Verwendung dieser nicht-physiologischen Steifheit auch das Zellverhalten beeinflussen und die Relevanz des Modells für natürliche Gewebeumgebungen einschränkenkönnen 29. Zusätzlich blockieren einige Tragenmodelle das Objektiv oder den Lichtweg und verhindern so die Bildgebung, während andere Membranen verwenden, die für klareBeobachtung 28 zu dick sind. Selbst wenn Keilrahmen mit Mikroskopen kompatibel sind und dünne Substrate verwenden, sind Probleme wie das Durchhängen der Membran und Fokusverlust häufig. Kommerzielle Plattformen wie Flexcell nutzen vakuumbasierte Verformung, um flexible Membranen zu dehnen. Obwohl dieser Ansatz stabile, homogene Dehnungsfelder erzeugen kann, ist er nicht für Live-Zellenmikroskopie optimiert, und mikroskopkompatible Konfigurationen erfordern teure zusätzliche Zubehörteile. Zusätzlich können diese Plattformen einen maximalen Stamm von nur 21,8 % erreichen, während tiefe Einflüsse Stämme von über 30 % erzeugen können, wobei noch höhere Stämme bei Krankheiten wie Asthma und COPD31 beobachtet werden.

Daher haben wir ein neuartiges Zelldehnungsgerät entwickelt, das eine präzise Materialsteuerung der Substratsteifigkeit und ECM-Zusammensetzung ermöglicht und gleichzeitig variable isotrope und uniaxiale Dehnungen auf adhärente Zellen anwenden kann. Diese Plattform eignet sich hervorragend für Forscher, die mechanobiologische Fragen untersuchen und während der mechanischen Stimulation mit Substraten mit physiologisch relevanter Steifigkeit eine Live-Bildgebung benötigen. Das Gerät verwendet einen mechanisch angetriebenen Ansatz, der von der Geometrie einer zweidimensionalen Hoberman-Kugel inspiriert ist und sich durch scherenartige Gelenke ausdehnt und zusammenzieht (Abbildung 1, ergänzende Abbildung 1). Ein einzelner Schrittmotor treibt 16 radial angeordnete Arme über einen Verbindungsmechanismus an, der eine koordinierte Ausdehnung und Zusammenziehung von acht Befestigungspfosten erzeugt. Diese Konfiguration erzeugt homogene Inplane-Dehnung, indem gleichmäßig radiale Verschiebung auf alle Pfosten gleichzeitig angewendet wird. Das einzigartige Design und die kompakte Fläche des Geräts ermöglichen Live-Zell-Bildgebung mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop während der isotropen und uniaxialen Dehnung in der Ebene – zu einem Bruchteil der Kosten kommerzieller Alternativen. Der lineare Schrittmotor wird mit einem speziellen Arduino-Code gesteuert, der programmierbare zyklische Wellenformen mit einstellbaren Perioden und Amplituden ermöglicht. In dieser Studie zeigen wir, dass das Gerät präzise und reproduzierbare Stämme von weniger als 1 % bis 15 % liefert, mit einer geometrischen Kapazität von über 200 %. Darüber hinaus quantifizieren wir die Auswirkungen der mechanischen Dehnung auf die intrazelluläre Kalziumdynamik und die Zugkräfte der primären glatten Atemwege des Menschen.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die primären glatten Atemwegzellen (ASMCs), die in dieser Studie verwendet wurden, stammten vom ATCC (Virginia), und die Spenderinformationen wurden gemäß den NIH-Richtlinien deidentifiziert. Diese Studie wurde vom Biosicherheitsausschuss der Northeastern University vor den Experimenten genehmigt.

HINWEIS: Für Anweisungen zur Herstellung des Geräts sowie zu den Gerätemaßen siehe bitte die CAD-Datei in unserem GitHub-Repository: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.

1. Design der 3D-gedruckten Form

  1. Isotrope Schimmelmaße
    1. Der Außendurchmesser der Form beträgt 37 mm.
    2. Die Außenhöhe der Form beträgt 4,1 mm.
    3. Die Außenwanddicke beträgt 2,1 mm.
    4. Die Grunddicke der Form beträgt 2 mm.
    5. Die Befestigungslöcher befinden sich 2 mm vom Rand entfernt.
    6. Die innere Zellkultur-Bohrfläche hat einen Durchmesser von 20 mm und eine Tiefe von 1,9 mm.
      HINWEIS: Der fertige PDMS-Schimmel sollte eine Zellkulturfläche von 200 μm haben.
  2. Einaxiale Formmaße
    1. Die Außenmaße der Form betragen 41 mm x 12 mm x 4 mm (L x B x H).
    2. Die Befestigungslöcher sind 3 mm von der Breite und 4 mm von der langen Kante entfernt, mit einer Pfostentiefe von 1 mm.
    3. Die Außenwanddicke beträgt 1,5 mm an der Breite und 2 mm an der Länge.
    4. Die Abmessungen des inneren Zellkulturbrunnens betragen 26 mm x 5,5 mm x 1 mm (L x B x H).
    5. Die Grunddicke beträgt 2 mm.
      HINWEIS: Die Formen wurden in SolidWorks entworfen, 3D-gedruckt mit einem FormLabs flüssiggrauen Harzsystem und im Makerspace der Northeastern University gefertigt.
  3. Anleitung nur für die erste Verwendung der Form
    1. Schleife die rauen Kanten des Formdrucks ab.
    2. Beschichten Sie den negativen Schimmel mit klarem Nagellack, um die spätere Entfernung des PDMS-Schimmels nach dem Aushärten zu erleichtern. Lass den Schimmel 24 Stunden an der Luft trocknen.

2. Herstellung von optisch klaren, elastischen Gelen mit abstimmbarer Substratsteifigkeit für Zellkultur

HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit PDMS und NuSil geeignete PSA (Handschuhe, Laborkittel, Augenschutz).

  1. Füge Sylgard 184 Basis und Härtemittel im Verhältnis 10:1 nach Gewicht in eine Kunststoffschale hinzu.
  2. Mische kräftig mit einem Zungenspatel (oder einem ähnlichen Werkzeug) für 2-3 Minuten.
  3. Entfetten Sie die Mischung 1 Stunde lang.
  4. Gießen Sie die PDMS-Mischung in die maßgefertigte Negativform (Abbildung 2A,B).
    1. Gib 1,3 g in die isotrope Form.
    2. Füge 0,5 g für die uniaxiale Form hinzu.
      HINWEIS: Achte darauf, das Gel gleichmäßig über die Form zu verteilen.
  5. Entgasen Sie die Form für 1 Stunde.
  6. Lass das Gel in der Form 2 Stunden lang auf einer flachen Oberfläche bei Zimmertemperatur absinken.
  7. Über Nacht bei 60 °C aushärten.
  8. Mischen Sie die Teile A und B von NuSil Gel-8100 15 Minuten lang in gleichen Portionen (1:1).
    1. Mischen Sie mit Sylgard 184 Quervernetzer bei 0,36 % des Gesamtvolumens, um ein Substrat mit einer Steifigkeit von 13 kPa 32 zu erhalten.
    2. Fügen Sie keinen Quervernetzer hinzu, um ein Substrat mit einer Steifigkeit von 0,3 kPa zu erzeugen.
  9. Entfette die Mischung 30 Minuten lang.
  10. Entferne das PDMS-Gel vorsichtig aus der maßgefertigten Form. Legen Sie das Gel auf einen 40-mm-Deckdeckel.
    HINWEIS: Achte darauf, die Gels nicht zu zerreißen, da sie zerbrechlich sind.
  11. Gieße die NuSil-Mischung auf den negativen Bereich des PDMS-Gels.
    1. Isotropes Gel: 100 μL.
    2. Uniaxiales Gel: 50 μL.
  12. Beschichten Sie die jeweiligen PDMS-Gele mit der NuSil-Mischung mit einem Spin-Coater für 50 Sekunden bei 7 x g, um eine gleichmäßige Substratdicke von 100 μm zu erreichen.
  13. Lassen Sie das Gel 2 Stunden auf einer ebenen, ebenen Oberfläche bei Raumtemperatur absetzen, bevor es über Nacht bei 60 °C aushärtet.
    HINWEIS: Bitte achten Sie darauf, dass alle Aushärtungsschritte auf einer ebenen Oberfläche durchgeführt werden. Ein ungleichmäßiges Gel lässt nicht zu, dass der gesamte interessierende Bereich in der Bildfläche des Mikroskops verbleibt. Wenn die Bildaufnahme eine Fokusvariation im gesamten Sichtfeld zeigt, könnte das Gel auf einer unebenen Oberfläche ausgehärtet sein und sollte neu hergestellt werden.
  14. Bewahren Sie die fertigen Zellkulturschalen bis zur Verwendung in abgedeckten Petrischalen auf (Abbildung 2D-E).

3. Matrix-Proteinbeschichtung

  1. Fügen Sie jedem Substrat 500 μL Poly-L-lysin (PLL, 500 μg/mL) hinzu.
  2. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
  3. Waschen Sie die Substrate 3 × mit 1 ml PBS, gefolgt von 3 × mit 1 ml 10 mM HEPES-Puffer (pH 8,0).
  4. Fügen Sie jedem Substrat 500 μL mPEG-SVA (50 mg/mL) hinzu.
  5. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
  6. Wasche die Substrate 3 × mit 1 ml PBS.
  7. Ersetzen Sie PBS durch 500 μL PLPP (14,5 mg/ml).
  8. Mit dem PRIMO-Mikropatterning-System und Leonardo-Software projizieren Sie das vordefinierte Muster mit UV-Licht 30 Sekunden lang auf die Substratoberfläche.
  9. Wasche die Substrate 3 × mit 1 ml PBS und stelle sie 15 Minuten unter UV-Strahlen zur Sterilisation.
  10. Fügen Sie jedem Substrat 500 μL 0,1 % fluorescein-konjugierte Gelatine hinzu.
  11. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
  12. Waschen Sie 3 × mit 1 ml PBS.
    HINWEIS: Um Muster zu visualisieren, inkubieren Sie 1 Stunde lang mit 0,1 % fluoresceinkonjugierter Gelatine bei Zimmertemperatur.
  13. Fahren Sie mit der Bildgebung fort.

4. Glatte Muskelzellkultur der menschlichen Atemwege in elastischen Schalen

HINWEIS: Führen Sie alle Zellkulturverfahren in einer Biosicherheitshaube unter Verwendung der standardisierten aseptischen Technik durch.

  1. Beziehen Sie primäre glatte Atemwegszellen (ASMCs) vom ATCC (Virginia) und stellen Sie sicher, dass Spenderinformationen gemäß den NIH-Richtlinien deidentifiziert werden. Bestätigen Sie die Genehmigung des Institutional Biosafety Committee vor Beginn der Experimente.
  2. Verwenden Sie Zellen von drei gesunden menschlichen Spendern unterschiedlichen Geschlechts und Alters ohne Vorgeschichte von Asthma oder Krankheit. Beispiel: eine Frau (18 Jahre) und zwei Männer (34 und 59 Jahre).
  3. Kultivieren Sie Zellen unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO ₂) und verwenden Sie Zellen bis Passage 6 für alle Experimente.
  4. Zellen in folgendem vollständigen Wachstumsmedium wachsen lassen:
    1. DMEM/F12 (500 mL)
    2. 10% fetales Rinderserum (FBS) (50 ml)
    3. 1× Penicillin/Streptomycin (5 ml)
    4. 1× MEM nicht-essentielle Aminosäuren (5 mL)
    5. Amphotericin B (0,5 ml)
  5. Wechseln Sie mindestens 24 Stunden vor den Messungen auf ein serumfreies Medium. Bereiten Sie serumfreies Medium vor:
    1. Hams F-12 Medium (500 mL)
    2. 1 × Penicillin/Streptomycin (5 ml)
    3. Amphotericin B (50 μg/L)
    4. 1× MEM nicht-essentielle Aminosäuren (5 mL)
  6. UV-sterilisieren dehnbare Zellkulturschalen für 15 Minuten.
  7. Inkubieren Sie sterilisierte Schalen mit 0,1 % Gelatine 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur vor dem Aussäen (Abbildung 2F).
    1. Für gemusterte Substrate:
      1. Samenzellen in elastischer Zellkultur versickern mit einer Dichte von 104 Zellen/cm².
      2. Inkubieren Sie 10 Minuten lang in 10 % Serummedium, um die Anhaftung an gemusterten Bereichen zu fördern.
      3. Wasche die Brunnen mit PBS, um lose Zellen zu entfernen.
      4. Fülle die Brunnen mit 10 % Serummedium und brüte 24 Stunden lang.
      5. Ersetzen Sie durch serumfreies Medium und inkubieren Sie 24 Stunden vor den Messungen.
    2. Für nicht gemusterte Substrate:
      1. Samenzellen mit der gewünschten Dichte: 102 Zellen/cm2 für isolierte Zellen. 103 Zellen/cm 2 für dünne Zellen. 104 Zellen/cm, 2 für konfluente Zellen.
      2. Inkubieren Sie 24 Stunden lang in einem 10%igen Serummedium.
      3. Ersetzen Sie durch serumfreies Medium und inkubieren Sie 24 Stunden vor den Messungen.

5. Fluoreszierende Kalziumbildgebung und -analyse

  1. Serum-mangelnde Atemwegs-ASMCs für 24 Stunden.
  2. Bereiten Sie den FLIPR Ca2+ 6 Farbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  3. Mische FLIPR Ca2+ 6 Farbstoff mit serumfreiem Medium im Verhältnis 1:1.
  4. Inkubieren Sie Zellen mit der FLIPR Ca ² ⁺ 6-Lösung bei 37 °C und 5 % CO ₂ für 2 Stunden.

6. Bildaufbau

  1. Verwenden Sie ein Leica DMi8 Invertiertes Mikroskop, ausgestattet mit:
    1. Leica DFC6000 Kamera
    2. Leica LED8 Lichtmotor
    3. 5×/0,12 trockenes Ziel
  2. Stelle die Anregung auf 480/40 nm und die Emission auf 527/50 nm ein.
  3. 16-Bit-Bilder mit einer Bildrate von 2 Hz während Stretch-Experimente aufnehmen.

7. Datenanalyse

  1. Bildsequenzen in Fiji importieren (ImageJ) 33.
  2. Definieren Sie manuell Bereiche von Interesse (ROIs) im Zytoplasma jeder Zelle.
  3. Extrahieren Sie die mittleren Graustufenintensitätswerte für jede ROI über die Zeit.
  4. Verarbeiten Sie Fluoreszenzintensitätsdaten mit einem individuellen MATLAB-Skript.
    HINWEIS: Die Fluoreszenzintensität ist proportional zur zytosolischen [Ca2+].

8. Messung und Analyse der Traktionskraft

HINWEIS: Alle Codes, einschließlich solcher für Bildanalyse, Traktionskraftmikroskopie und Motorsteuerung, sind in unserem GitHub-Repository verfügbar: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging

  1. Beschichten Sie PDMS-NuSil-Gelsubstrate mit einer Schicht fluoreszierender Perlen, um als fiduciale Marker für die Traktionskraftmikroskopie zu dienen.
  2. Bereiten Sie eine 0,025%ige Lösung aus 1 μm Durchmesser roten fluoreszierenden carboxylatmodifizierten Mikrosphären in HBSS vor, indem Sie auf ein Verhältnis von 1:4000 verdünnen.
  3. Vortex die Perlelösung für 10 Sekunden.
  4. Gib die Perlenlösung dem Gel zu.
    1. 880 μL auf isotropes Gel.
    2. 420 μL auf uniaxiales Gel.
  5. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur, damit die Perlen haften können.
  6. Nach 1 Stunde entferne die Lösung vorsichtig.
    HINWEIS: Gießen Sie die Perlelösung vorsichtig auf weiche Gels. Eine unsachgemäße Entfernung verhindert die richtige Verteilung der Perlen.
  7. Tupfen Sie vorsichtig die restliche Lösung mit einem Wattestäbchen oder Kimwipe ab.
  8. Stellen Sie sich die Perlen mit einem Leica-DMi8-Mikroskop vor, das mit einem 10x/0,32 Trockenobjektiv ausgestattet ist.
  9. Aufnahmen Sie Bilder im Vordehnungszustand und kontinuierlich während des Dehnungsverfahrens.
    HINWEIS: Führen Sie alle Bildgebungen im Zentrum des Substrats durch, wo die Dehnungsgleichmäßigkeit am höchsten ist. Falls nötig, fokussieren Sie das Mikroskop vor der Aufnahme der Bilder an der gestreckten Position neu.
  10. Analysieren Sie die Bilder mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Code, der auf Fourier-Traktionskraftmikroskopie basiert, um Verschiebungsvektoren und die entsprechenden planaren Dehnungsfelder 34 zu berechnen.
  11. Stellen Sie die Daten als Durchschnitt von N Studien dar.

9. Kalibrierung des Zelldehnungsgeräts

  1. Fügen Sie dem Brunnen 500 μL H₂O hinzu, um das Gewicht der Zellkulturmedien zu simulieren und das Proteinmuster feucht zu halten.
  2. Zum Protokoll zur Erstellung spezifischer Proteinmuster siehe Abschnitt 3 mit dem Titel "Matrix Protein Coating".
  3. Bilde Fluoresziermuster alle 400 μm Schritte des Motorverdrängens, steigen auf maximal 2800 μm an und kehren dann in umgekehrten 400 μm Schritten wieder auf null zurück.
  4. Charakterisieren Sie die Beziehung zwischen linearer Verschiebung vom Schrittmotor und isotroper Deformation der dehnbaren Zellkulturschüssel sowohl auf makroskopischer als auch auf regionaler Ebene, indem Sie die Veränderungen der Fläche und der Exzentrizität fluoreszierender proteinartiger Buchstaben, die "BREATHE" schreiben, während des Dehnens auf dem elastischen Substrat messen. Verwenden Sie eine rechteckige Begrenzungsbox, die alle Buchstaben umfasst, um die Fläche und Exzentrizität des gesamten Wortes zu berechnen.
  5. Wenden Sie die Bildsegmentierung in MATLAB an, um diese Parameter für jeden einzelnen Buchstaben zu quantifizieren.
  6. Definiere die Verschiebung von null durch die ungedehnten Dimensionen der Zellkulturschale.
  7. Wiederholen Sie jedes Experiment in zwei bis drei unabhängig vorbereiteten dehnbaren Zellkulturbrunnen, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

10. Datenpräsentation und statistische Tests

  1. Für Kalibrierungsexperimente auf der Keilleiste definieren Sie Versuche als die Anzahl der Zyklen.
  2. Zeigen Sie jede Prüfung einzeln, anstatt sie zu einer einzigen Kurve zu kombinieren, um die Systemwiederholbarkeit zu demonstrieren.
  3. Geben Sie Fehlerbalken als Standardabweichung an.
  4. Verwenden Sie eine Einweg-ANOVA, um signifikante Unterschiede in Datensätzen mit drei oder mehr Gruppen zu testen, die von einem unabhängigen Faktor beeinflusst werden.
  5. Verwenden Sie zweiseitige ANOVAs gefolgt von post-hoc-paarweisen Vergleichen, um signifikante Unterschiede in Datensätzen zu testen, die von zwei unabhängigen Faktoren beeinflusst werden.
  6. Wenden Sie den t-Test für paarweise Vergleiche an, wenn die Daten normal verteilt sind.
  7. Wenden Sie den Mann-Whitney-Rangsummentest an, um Medianwerte zu vergleichen, wenn die Daten nicht normal verteilt sind.
  8. Geben Sie die verwendeten spezifischen Tests, die Anzahl der Proben und die entsprechenden P-Werte zusammen mit den Ergebnissen an.
  9. Verwenden Sie einen P-Schwellenwert von 0,05, um statistisch signifikante Unterschiede zwischen Datensätzen zu bestimmen.
  10. Führen Sie statistische Tests in SigmaStat durch.
  11. Diagrammabbildungen in GraphPad Prism und MATLAB.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Zellstretcher induziert makroskopische Flächenänderungen, die lokale Deformationen widerspiegeln. Um das isotrope Verhalten zu bewerten, maßen wir die Flächenänderungen eines fluoreszierenden Gelatineproteinmusters, das das Wort "BREATHE" auf einem dehnbaren Zellkulturbrunnen bildet, zusammen mit seinen einzelnen Buchstaben auf einem isotropen Substrat. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl das Wort als auch die einzelnen Buchstaben äquivalente Flächenänderungen aufwiesen (

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll beschreiben wir das Design, die Entwicklung, Validierung und Implementierung eines neuartigen, mikroskop-kompatiblen Zellstreckers, der isotrope und uniaxiale Stämme nachahmen und gleichzeitig lebende Zellen bilden kann. Dieses Gerät ist kompakt und kann auf eine Leica DMi8-Mikroskopstufe passen, wobei alle beweglichen Teile auf eine einzige Ebene beschränkt sind, um eine Live-Bildgebung zu ermöglichen, während der Fokus auf das Substrat und die darunterliegenden Zell...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keiner der Autoren hat konkurrierende Interessen zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Herrn Noah Joseph für seine Hilfe bei der Herstellung der Formen. Die Autoren danken Heitor Mourato und Glenn Thayer von der Boston University Scientific Instrument Facility für ihre Hilfe bei der Bearbeitung des Geräts. Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation (NSF) Career Grant #2047207 unterstützt, der Harikrishnan Parameswaran verliehen wurde. H.P. entwickelte die Forschung. S.E.S. und S.R.P. entwickelten das Gesamtdesign des Geräts, und S.E.S. sowie H.P. entwarfen die isotropen Experimente. S.E.S führte die isotropen Formexperimente durch, analysierte die experimentellen Daten und interpretierte die Ergebnisse zusammen mit H.P. V.C., entworfen die einachsigen Formen, optimierte die Gelpräparation und das Perlen. B.M.G führte die uniaxialen Gel-Experimente durch, analysierte die experimentellen Daten und interpretierte die Ergebnisse zusammen mit H.P. und V.C. S.E.S. und B.M.G. erstellten die Abbildungen. B.M.G., S.E.S, V.C. und H.P trugen zur Entwurfs- und Redaktion des Manuskripts bei. H.P. genehmigte die endgültige Version des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
  Dulbecco' s modifizierte Adler' s medium/F12Fisher Scientific12634010500 mL 
(4-Benzoylbenzyl) Trimethylammoniumchlorid (PLPP)Alv&eakut; OleN/A14,5 mg/mL
0,1 % fluorescein konjugierte Gelatine InvitrogenG13187
0,1 % GelatinelösungSigma-AldrichES-006500 mL 
1 & mu; m-Durchmesser rot fluoreszierende Carboxylat-modifizierte MikrosphärenFluoSpheresF8816
1& Times; MEM nicht-essentielle AminosäurelösungSigma-AldrichM7145100 mL
1& Times; Penicillin/StreptomycinFisher Scientific15-140-122100 mL
10% fetales RinderserumThermowissenschaftlichA5256701500 mL 
15-mL-RöhreFisher Scientific14-959-53A
1x Glutamin Fisher ScientificMT10010CM
1x Insulin-Transferrin-Selenium-WachstumspräparatCorning Life Sciences25-800-CR
Amphotericin BSigma-AldrichA294225 & mu; g/Liter
KugellagerMcMaster-Carr N/A
Calciumchlorid-DihydratSigma-Aldrich223506
KutschbahnMcMaster-Carr N/A
FLIPR Ca2+ 6Molekulare BauelementeR8190
GraphPad-PrismaDotmatikN/A
Schinken' s F-12 medium Sigma-AldrichN8641500 mL 
Hanks' Balanced Salt Solution Thermowissenschaftlich14025092500 mL 
HEPES buffer Thermowissenschaftlich15630080100 mL
Leonardo SoftwareAlv&eakut; OleN/A
MatlabMathematikwerkeN/A
Methoxy-Polyethylenglykol & Ndash; Succinimidylvalerat (mPEG-SVA)Laysan Bio IncN/A50 mg/mL
Nusil Gel-8100Nusil N/A
PetrischalenThermowissenschaftlich26399190 mm 
phosphatgepufferte Kochsalzlösung  Sigma-Aldrich10010023500 mL 
poly-L-lysin (PLL)Sigma-AldrichP8920500μ g/mL
Primäre glatte Muskelzellen der menschlichen Atemwege ATCCPCS-130-011
PRIMO Optikmodul Alv&eakut; OleN/A
SchraubenMcMaster-Carr N/A
SigmaStatSystat-SoftwareN/A
Spin CoaterLaurellModell WS-650MZ-23NPPB
Trag- und Bühnenbefestigungskomponenten Wissenschaftliche Instrumenteneinrichtung der Boston UniversityN/AEdelstahl
Sylgard 184 Basis-Elastomer- und Aushärtungsmittel-KitDowH047J8Q026
T-25 Gewebekulturkolbe – Entlüftungskappe, sterilCellTreat229331
Zungenspatel Thermowissenschaftlich22-363-154

Referenzen

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