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Forschungsartikel
Dieses Protokoll integriert klinische Proben, kultivierte Makrophagen sowie ein Mäusemodell der Cecal-Ligation und -Punction (CLP), um zu untersuchen, wie die NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-Achse die Makrophagepolarisation und Entzündung bei Sepsis reguliert und so eine Schritt-für-Schritt-Anleitung bietet, die an andere lncRNA-vermittelte Immunwege angepasst werden kann.
Sepsis ist durch eine dysregulierte Immunantwort des Wirts gekennzeichnet und bleibt weltweit eine der führenden Todesursachen. Die lange nicht-kodierende RNA NEAT1 wurde mit entzündlichen Erkrankungen in Verbindung gebracht, aber ihre spezifische Rolle bei der Makrophagenpolarisation während der Sepsis ist noch nicht vollständig definiert. Hier untersuchen wir systematisch die NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-Achse über klinische Proben, kultivierte Makrophagen und ein CLP-Mausmodell. Quantitative PCR-, Western Blotting-, Dual-Luciferase-Reporter-Assays und RNA-Pull-down-Experimente werden verwendet, um die kompetitive endogene RNA (ceRNA)-Interaktion zwischen NEAT1, miR-181a-5p und HMGB1 zu bestätigen. Funktionelle Tests, einschließlich Immunfluoreszenz, Transwell-Migration und terminaler Deoxynukleotidyltransferase-dUTP-Nickend-Markierung (TUNEL)-Färbung, werden zur Bewertung der Makrophagenpolarisation, Migration und Apoptose eingesetzt. In vivo validiert das CLP-Modell in Kombination mit ELISA und Histopathologie die Auswirkungen des NEAT1-Knockdowns auf Zytokinprofile und Organschädigungen. NEAT1 und HMGB1 sind hochreguliert, während miR-181a-5p bei Patienten mit Sepsis und in lipopolysaccharidstimulierten Makrophagen herunterreguliert ist. Das Abschalten von NEAT1 fördert die Polarisation der M2-Makrophagen, reduziert proinflammatoriske Zytokine, beeinträchtigt die Makrophagemigration und lindert Gewebeschäden bei septischen Mäusen über die miR-181a-5p/HMGB1-Achse. Soweit wir wissen, ist dies das erste integrierte Protokoll, das den lncRNA-microRNA-HMGB1-Regulationskreislauf bei Sepsis mit harmonisierten klinischen, in vitro und in vivo Ansätzen charakterisiert. Es bietet einen methodischen Rahmen zur Zielsetzung von NEAT1-bezogenen ceRNA-Netzwerken als potenzielle therapeutische Strategien.
Sepsis wird definiert als lebensbedrohliche Organfunktionsstörung, die durch eine dysregulierte Wirtsreaktion auf eine Infektionverursacht wird. 1. Trotz Fortschritten in der klinischen Behandlung bleibt ihre Sterblichkeit hoch, und die molekularen Mechanismen, die dem Immunungleichgewicht zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden 2,3. Unter den Immunregulatoren haben sich lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) als wichtige Modulatoren der entzündlichen Signalgebung und der Makrophagenfunktionerwiesen 4,5. NEAT1, ein nuklear angereichertes reichhaltiges Transkript, ist eine strukturelle Komponente von Paraspeckles und wurde mit Immun- und Gewebeverletzungsantworten assoziiert 6,7. Frühere Studien haben NEAT1 mit Darmentzündungen, Ischämie-/Reperfusionsverletzungen und akutem Atemnotsyndromin Verbindung gebracht 8,9,10.
Im Zusammenhang mit der Sepsis deuten die zunehmenden Evidenz darauf hin, dass lncRNAs die Makrophagenpolarisation und die entzündliche Signalübertragung regulieren und so den Krankheitsverlauf und das Ergebnisbeeinflussen 11,12. Beispielsweise wurde berichtet, dass lncRNAs KCNQ1OT1 und SNHG1 sepsisbedingte Myokardschäden über mikroRNA-vermittelte Signalwegemodulieren 13,14. Ob NEAT1 die Makrophagenpolarisation über die miR-181a-5p/HMGB1-Achse bei Sepsis reguliert, ist jedoch nicht systematisch definiert. Um diese Lücke zu schließen, haben wir ein Protokoll eingeführt, das Blutproben der Patienten, lipopolysaccharid-stimulierte RAW264.7-Makrophagen sowie ein Modell der Kettenligation und Punktionsmaus kombiniert, um die NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-Achse15,16 zu untersuchen. Mit quantitativer PCR, Western Blotting, Dual-Luciferase-Reporter-Assays, RNA-Pull-Down und funktionellen Auswertungen der Polarisation, Migration und Apoptose von Makrophagen M1/M2 bietet dieses Protokoll einen reproduzierbaren experimentellen Rahmen, um NEAT1 als Regulator der Makrophagefunktion bei Sepsis zu definieren und die Entwicklung von lncRNA-gezielten Strategien zu unterstützen17,18.
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Alle Verfahren mit menschlichen Teilnehmern wurden vom Ethikausschuss des angeschlossenen Krankenhauses der Universität Hebei genehmigt (Genehmigungsnummer HDFY-LL-2021-232). Eine schriftliche informierte Zustimmung wurde von allen Teilnehmern oder, falls zutreffend, von ihren gesetzlichen Stellvertretern eingeholt. Alle Tierversuche wurden gemäß institutionellen Richtlinien und nationalen Vorschriften durchgeführt und vom selben Ethikkomitee genehmigt. Das genehmigte Protokoll spezifizierte Details zum Verfahren zur Ligation und Punktion (CLP), zur adenoviralen Verabreichung, zum Anästhetikum und zu humanen Endpunkten.
Patientenprobenentnahme
Patienten mit Sepsis wurden zwischen Februar 2022 und Juli 2024 prospektiv im angeschlossenen Krankenhaus der Universität Hebei rekrutiert. Insgesamt erfüllten 50 Patienten die Einschlusskriterien, darunter 26 Männer und 24 Frauen im Alter von 24 bis 69 Jahren (Durchschnitt 52,4 ± 10,2 Jahre). Die Sepsis wurde nach den Sepsis-3-Kriterien diagnostiziert, wobei eine vermutete oder bestätigte Infektion sowie eine Erhöhung des Sequential Organ Failure Assessment (SOFA)-Scores um ≥ 2 Punkte erforderlich waren. Für jeden Patienten wurden die primäre Infektionsquelle (wie pulmonale, intraabdominale, Harnwegs- oder Blutbahninfektion) und der Krankheitsschwere (Sepsis oder septischer Schock) erfasst, und die Verteilung der SOFA-Werte wurde zusammengefasst, um die Krankheitslast zu charakterisieren. Als Kontrollgruppe wurden 39 gesunde Personen ohne klinische Hinweise auf eine Infektion oder systemische Entzündung aufgenommen (20 Männer und 19 Frauen, im Alter von 26 bis 70 Jahren, Durchschnitt 50,7 ± 11,0 Jahre), und es gab keine signifikanten Unterschiede im Alter oder Geschlecht zwischen den Gruppen.
Peripheres venöses Blut wurde von Patienten mit Sepsis vor Beginn einer sepsisspezifischen Behandlung entnommen, wann immer möglich. Blut (typischerweise 5–10 ml) wurde in mit Ethylendiamintetraetsäure (EDTA) beschichtete Röhren entnommen und mehrmals sanft umgedreht, um das Antikoagulans zu mischen. Die Proben wurden innerhalb von etwa 1 Stunde Entnahme verarbeitet. Das Plasma wurde durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur gewonnen, in beschriftete Mikroröhren aliquotiert und bei -80 °C für spätere Zytokinmessungen gelagert. Für RNA- und Proteinextraktion wurden periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) aus einem Teil derselben Proben mit einem Dichtegradienten-Trennmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die Zellen wurden dann zweimal in PBS gewaschen, gezählt und als Zellpellets bei -80 °C gelagert.
Zellkultur und Transfektion
RAW264.7 Mausmakrophagenzellen wurden in RPMI-1640-Medium erhalten, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber durchführt, bevor sie eine Überkonfluenz erreichten, um einen stabilen Phänotyp zu erhalten.
Für die Transfektion wurden RAW264,7-Zellen mit 5 × 105 Zellen pro Bohrloch in 6-Well-Platten in 2 ml vollständigem Medium etwa 24 Stunden vor der Reagenzexposition ausgesät. Wenn Kulturen eine Konfluenz von 70–90 % erreichten, wurden Nukleinsäuren (wie NEAT1- oder HMGB1-Expressionsplasmide, Kurzhaarnadelkonstrukte, miR-181a-5p-Mimiker oder Inhibitoren sowie deren entsprechende Kontrollen) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz in serumfreiem Medium komplexiert. Typischerweise wurden 2–3 μg Plasmid-DNA oder 50–100 pmol kleine RNA mit dem empfohlenen Volumen des Reagens gemischt, bei Raumtemperatur 10–15 Minuten Komplexe bilden und anschließend tropfenweise in antibiotikafreiem Medium an die Zellen gegeben. Nach 4–6 Stunden wurde das Medium durch frisches, vollständiges Medium ersetzt, und die Zellen wurden weitere 24–48 Stunden inkubiert, bevor sie stromabwärts getestet wurden.
Induktion der Makrophagenpolarisation
Um eine entzündliche Makrophagepolarisation zu induzieren, durften RAW264.7-Zellen mindestens 4 Stunden in einem vollständigen Medium in 6-Well-Platten haften. Das Medium wurde dann durch DMEM ersetzt, das 100 ng/mL Lipopolysaccharid (LPS) enthält, und die Zellen wurden 6 Stunden lang bei 37 °C mit 5 %CO2 inkubiert. Nach der Stimulation wurden die Zellen sofort für RNA- und Proteinextraktion, Immunfluoreszenzfärbung, Migrationstests oder Apoptose-Analyse verarbeitet, abhängig vom experimentellen Design.
Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)
Total-RNA wurde aus kultivierten Zellen, PBMCS oder Mausgeweben mit einem phenol-guanidiniumbasierten monophasischen Reagenz gemäß Standardverfahren extrahiert. Kurz gesagt: Die Proben wurden in 1 ml Reagenz pro 106 Zellen oder 50–100 mg Gewebe lysiert, 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend kräftig mit Chloroform (0,2 ml pro 1 ml Reagenz) vermischt. Nach der 2–3 Minuten Inkubation wurden Lysate bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die wässrige Phase wurde in eine neue Röhre übertragen, und RNA wurde mit einem gleichen Volumen Isopropanol ausgefällt. Das Gemisch wurde dann etwa 10 Minuten inkubiert und erneut bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde mit 75 % Ethanol gewaschen, bei 7.500 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, kurz an der Luft getrocknet und in RNase-freiem Wasser gelöst. RNA-Konzentration und Reinheit wurden mittels UV-Spektrophotometrie bewertet, und Proben mit einemA-260/A-280-Verhältnis von etwa 1,8–2,0 wurden für nachgelagerte Analysen verwendet. Bei Bedarf wurde die Integrität durch Agarosegel-Elektrophorese überprüft.
Komplementäre DNA (cDNA) wurde aus Gesamt-RNA mithilfe eines kommerziell erhältlichen Reverse-Transkriptions-Kit nach den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Für miR-181a-5p wurden wie empfohlen genspezifische oder Stem-Loop-Primer verwendet. Quantitative Echtzeit-PCR wurde mit einem Echtzeit-PCR-System und einer geeigneten Mastermischung (wie SYBR Green- oder Sondenchemie) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μL durchgeführt, das cDNA-Vorlage und 0,2–0,4 μM jedes Primers enthielt. Typische Zyklusbedingungen umfassten eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 10 Sekunden und 60 °C für 30 Sekunden, mit einer Schmelzkurvenanalyse, wenn angebracht, um die Amplicon-Spezifität zu bestätigen. Die Expressionswerte von NEAT1 und HMGB1 wurden auf GAPDH normalisiert, und die Expression von miR-181a-5p wurde auf U6-kleine Kern-RNA normalisiert. Die relative Expression wurde mit der 2-ΔΔCt-Methode berechnet und als Faltungsänderung im Vergleich zu Kontrollgruppen ausgedrückt. Primer-Sequenzen und Amplicon-Größen wurden in einer separaten Tabelle zur Einreichung als ergänzende Tabelle 1 zusammengestellt.
Westliche Blotting
Für Western Blotting wurden die Zellen zweimal mit eiskalten PBS gewaschen und in einem geeigneten RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitoren lysiert. Lysate wurden 15–30 Minuten auf Eis inkubiert, gelegentlich sanft gemischt, und bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. Die Supernatanten wurden gesammelt, und die Proteinkonzentrationen wurden mittels eines Bicinchinainsäure-(BCA)-Tests bestimmt.
Gleiche Mengen Protein (typischerweise 40 μg pro Lane) wurden mit Ladepuffer gemischt, bei 95 °C für 5–10 Minuten gekocht, um Proteine zu denaturieren, und auf Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelen mit entsprechender Acrylamidkonzentration getrennt (zum Beispiel 10–12 % für HMGB1). Die Proteine wurden mit einem feuchten oder halbtrockenen Transfersystem unter für den interessierenden Molekulargewichtsbereich empfohlenen Bedingungen auf Polyvinylidenfluorid-(PVDF)-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch oder Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen HMGB1 (zum Beispiel 1:500 Verdünnung) und GAPDH (zum Beispiel 1:1.000 Verdünnung) im Blockpuffer inkubiert. Nach drei Waschen in TBST wurden die Membranen mit geeigneten Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach weiteren Wascharbeiten wurden die Proteinbänder mit einem verbesserten chemilumineszenzierten Substrat visualisiert und mit einem digitalen Bildgebungssystem erfasst. Bandintensitäten wurden mittels Bildanalysesoftware quantifiziert, HMGB1-Signale auf GAPDH normalisiert und die relative Expression zwischen den Gruppen verglichen.
Dual-Luciferase-Reporter-Assay
Wildtyp- und mutierte Fragmente von NEAT1 und der HMGB1 3′-unübersetzten Region (3′-UTR), die die vorhergesagten miR-181a-5p-Bindungsstellen enthalten, wurden in einen Luciferase-Reportervektor19 geklont. Alle Konstrukte wurden durch Sanger-Sequenzierung verifiziert, um die Insertion und die Mutationsstellen20 zu bestätigen. RAW264.7-Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät und über Nacht haften lassen. Die Zellen wurden anschließend mit Reporterplasmiden und entweder miR-181a-5p-Inhibitoren, Mimiken oder entsprechenden negativen Kontrollpersonen mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz co-transfektiert, wie für das allgemeine Transfektionsverfahren beschrieben.
Nach etwa 24–48 Stunden Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen, in einem geeigneten passiven Lysepuffer (zum Beispiel 20 μL pro Brunnen) lysiert und vorsichtig bewegt, um eine vollständige Lyse sicherzustellen. Die Luciferase-Aktivität wurde mit einem Dual-Luciferase-Testkit und einem Luminometer gemessen, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Luciferase-Aktivität von Glühwürmchen wurde auf die Aktivität von Renilla Luciferase normalisiert, um die Transfektionseffizienz zu kontrollieren, und die relative Luciferase-Aktivität jeder Gruppe wurde mit der entsprechenden Kontrollgruppe verglichen.
Transwell-Migrations-Assay
Die Makrophagemigration wurde mit Transwell-Kammern untersucht, die mit einem extrazellulären Matrixgel vorbeschichtet waren, das für Zellinvasionstests geeignet ist. Das Gel wurde 1:6 in serumfreiem Medium auf Eis verdünnt, und 50 μL der verdünnten Lösung wurden auf die Oberseite jedes Einsatzes gegeben. Die Platte wurde etwa 4 Stunden bei 37 °C inkubiert, damit das Gel erstarren konnte. Transfektierte oder behandelte RAW264.7-Zellen wurden entnommen, in serumfreiem Medium mit 1 × 106 Zellen/ml neu suspendiert, und 100 μL der Zellsuspension (1 × 105 Zellen) wurden der oberen Kammer hinzugefügt. Die untere Kammer wurde mit 600 μL vollständigem Medium gefüllt, das 10 % fetales Rinderserum als Chemoattractant enthielt.
Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5 % CO2für 24 Stunden inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die nicht wandernden Zellen auf der Oberseite der Membran vorsichtig mit einem Wattestäbchen entfernt. Migrierte Zellen, die an der unteren Membranoberfläche haften, wurden etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 95 % Ethanol fixiert und anschließend 10–15 Minuten mit 0,5 % Kristallviolettlösung gefärbt. Überschüssige Farbe wurde durch Waschen mit PBS entfernt, und die Membranen wurden an der Luft getrocknet. Migrierte Zellen wurden unter einem Lichtmikroskop untersucht, und Zellen in mehreren zufällig ausgewählten Feldern pro Einsatz wurden geblendet gezählt, um die Migrationskapazität zu quantifizieren.
TUNEL-Apoptose-Assay
Zur Apoptose-Detektion wurden RAW264.7-Zellen auf Glasabdeckfolien kultiviert und den angezeigten Behandlungen oder Transfektionen unterzogen. Die Zellen wurden 30–60 Minuten bei Zimmertemperatur mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit PBS abgespült. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde durch 20 Minuten Inkubation in 0,3 % Wasserstoffperoxid blockiert, gefolgt von PBS-Waschungen. Ein TUNEL-Testkit wurde verwendet, und die Markierungsmischung wurde aufgetragen, um die Zellen zu bedecken. Die Proben wurden etwa 60 Minuten lang bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer inkubiert, und die Reaktion wurde gemäß der Kit-Anleitung gestoppt. Nach der Inkubation mit Streptavidin-HRP oder einem gleichwertigen Nachweisreagenz für 30 Minuten bei 37 °C wurden die Kerne mit einem chromogenen Substrat wie 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) visualisiert, bis braun gefärbte apoptotische Kerne sichtbar wurden. Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin kontrafärbt, durch gradiertes Ethanol dehydriert, mit Xylol behandelt und mit einem permanenten Medium montiert. Apoptotische Zellen und Gesamtkerne wurden unter einem Lichtmikroskop beobachtet, und der apoptotische Index wurde als Prozentsatz der TUNEL-positiven Zellen berechnet.
Immunfluoreszenz
Zur Immunfluoreszenz wurden paraffineingebettete Gewebeschnitte in Xylol entwachst und durch eine graduierte Ethanolserie zu Wasser rehydriert. Die Antigenentnahme erfolgte mit einem geeigneten Puffer (wie Citratpuffer, pH 6,0) und der hitzeinduzierten Epitopenentnahme per Mikrowelle oder Schnellkochtopf, entsprechend den Antikörperempfehlungen. Nach dem Abkühlen und Ausspülen wurden die Abschnitte mit 5 % normalem Serum in PBS für eine Stunde bei 37 °C blockiert, um die unspezifische Bindung zu reduzieren. Die Gewebe wurden dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Marker der Makrophagenpolarisation und entzündlichen Zytokinen inkubiert, darunter CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), IL-4, IL-10 und Arg-1 (üblicherweise bei 1:500-Verdünnung), verdünnt im Blockpuffer.
Am folgenden Tag wurden die Abschnitte in PBS gewaschen und mit geeigneten fluorophorkonjugierten sekundären Antikörpern für eine Stunde bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Die Kerne wurden 5 Minuten lang mit 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) gegenfärbt. Nach den Endwäschen wurden die Abschnitte mit einem Antifade-Montagemedium montiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtersätzen untersucht. Die Bilder wurden mit konsistenten Belichtungseinstellungen über Gruppen hinweg aufgenommen, und in allen Figurentafeln und Legenden wurden Skalabalken (zum Beispiel 20 μm) und Vergrößerungen angegeben.
CLP-induziertes Sepsis-Mausmodell
Männliche C57BL/6 Mäuse (24–32 g) wurden mindestens eine Woche vor der Operation akklimatisiert und dann zufällig den Sham-, CLP-, CLP-plus-negativ-Kontroll-Kurzhaarnadel- oder CLP-plus-NEAT1-Kurzhaarnadel-Gruppen zugeteilt (n = 6 pro Gruppe). Mäuse wurden etwa 1–3 Minuten lang durch Atmung von Äther in einer geschlossenen Kammer betäubt, bis der Verlust des Aufrichtenden Reflex-Äthers oder eines anderen institutionell zugelassenen Anästhetikums bei einer Dosis und Expositionsdauer, die den Verlust des Aufrichtenden Reflexes bei aufrechter Atemfunktion verursachte, betäubt wurde. Die Bauchhaare wurden rasiert und die Haut mit einer geeigneten antiseptischen Lösung desinfiziert. Eine Mittellinien-Laparotomie von etwa 1–2 cm wurde durchgeführt, um das Äkum mit seinem angrenzenden Darm freizulegen.
Bei CLP wurde das Dekum vorsichtig nach außen geführt und mit einer sterilen Naht von etwa zwei Dritteln seiner Länge ligiert, wobei darauf geachtet wurde, die ileozekale Klappe nicht zu blockieren oder den mesenterischen Blutfluss nicht zu beeinträchtigen. Das ligierte Dekum wurde zweimal mit einer sterilen Nadel der im genehmigten Protokoll angegebenen Gauge (zum Beispiel 21 G) durchbohrt, und eine kleine Menge Stuhlmaterial wurde vorsichtig extrudiert, um die Öffnung der Stichstellen zu gewährleisten. Das Dekum wurde dann in die Peritonealhöhle zurückgeführt, und die Bauchwand sowie Haut wurden schichtweise mit Nähten verschließt. Sham-operierte Mäuse unterzogen sich derselben Laparotomie und der Exposition des Äussers, ohne Ligatur oder Punktion.
Um eine in vivo Knockdown von NEAT1 zu erreichen, wurden ein adenoviraler Vektor, der shNEAT1 codiert, und ein entsprechender negativer Kontrollvektor an einem definierten Titer hergestellt (zum Beispiel 1 × 109 plaquebildende Einheiten/mL). Ein festes Volumen viraler Suspension (wie 100 μL pro Maus) wurde über die Schwanzvene zu einem festgelegten Zeitpunkt relativ zum CLP (zum Beispiel 1 Stunde nach der Operation) verabreicht, wie im experimentellen Design beschrieben und vom Ethikkomitee genehmigt. Nach der Operation erhielten die Mäuse eine standardmäßige postoperative Versorgung, einschließlich subkutaner Flüssigkeitsreanimation, falls angezeigt, und wurden auf klinische Anzeichen von Sepsis und Belastung überwacht. Zum vorgegebenen Zeitpunkt wurden Tiere human durch Überdosis von Äther in einer geschlossenen Kammer eingeschläfert, wobei etwa 5–10 ml Äther verwendet wurden, um eine schnelle Beatmung zu beenden, gefolgt von der Bestätigung des Todes, Blutentnahme für die Zytokinanalyse und Organe für Histopathologie, Immunfluoreszenz und molekulare Tests entnommen.
Statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde mit SPSS Version 23.0 oder einer gleichwertigen statistischen Software durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt, sofern nicht anders angegeben. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde ein ungepaarter Studenten-t-Test verwendet, wenn die Daten normalverteilt mit homogenen Varianzen waren. Für Vergleiche zwischen drei oder mehr Gruppen wurde eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) angewandt, gefolgt von geeigneten Post-hoc-Tests für Mehrfachvergleiche, wenn ein signifikanter Gesamteffekt festgestellt wurde. Ein zweiseitiger p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Bedeutung statistischer Symbole (zum Beispiel p < 0,05, *p < 0,01) wurde in den Abbildungslegenden definiert, und die Anzahl der biologischen Replikationen wird im entsprechenden Text oder in den entsprechenden Legenden angegeben.
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Detektion der NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-Expression und Interaktionen bei Sepsis
Im Serum von Patienten mit Sepsis waren die NEAT1- und HMGB1-Werte signifikant höher als bei gesunden Kontrollen, während miR-181a-5p deutlich reduziert war. Ähnliche Expressionsmuster wurden in PBMCs und in RAW264.7-Makrophagen beobachtet, die mit Lipopolysaccharid stimuliert wurden, was darauf hindeutet, dass diese Achse bei Sepsis- und sepsisähnlichen Entzündungszuständen konstant verändert ist (<...
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Sepsis ist durch eine tiefgreifende und oft langanhaltende Immunregulation gekennzeichnet, in der Phasen von Hyperentzündung und Immunsuppression koexistieren und gemeinsam zu Organversagen und schlechten Ergebnissen beitragen21,22. Zunehmende Evidenz deutet darauf hin, dass lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) an diesen Prozessen teilnehmen, indem sie die entzündliche Signalierung und die Makrophagenpolarisation
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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Die Autoren danken dem klinischen und Laborpersonal des angeschlossenen Krankenhauses der Universität Hebei für ihre Unterstützung bei der Patientengewinnung, Probenverarbeitung und Tierpflege. Diese Arbeit wurde von der Gesundheitskommission der Provinz Hebei (Zuschuss Nr. 20220640) unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Adenoviraler Vektor (shNEAT1) | 10692-V5 | Vigene Biosciences | Adenovirus, das zur Senkung der NEAT1-Expression in vivo und in vitro verwendet wird. |
| BCA-Protein-Assay-Kit | 23227 | Thermo Fisher | Kit wird verwendet, um die Proteinkonzentration in Zelllysaten zu quantifizieren. |
| Dual-Luciferase-Reporter-Testkit | E1910 | Promega | Kit, das für Dual-Luciferase-Reporter-Assays zur Messung der MIR-181a-5p-Wechselwirkung verwendet wird. |
| ELISA-Kits (Zytokine) | N/A | R& D-Systeme | Kits, die zur Messung der Zytokinspiegel in Serum- und Gewebeproben verwendet werden. |
| Fetales Rinderserum (FBS) | 16000-044 | Gibco | Nahrungsergänzungsmittel, das in Kulturmedien für das Zellwachstum verwendet wird. |
| GAPDH-Antikörper | 2118S | Zell-Signaltechnik | Primärer Antikörper gegen GAPDH wird als Lastkontrolle im Western Blot verwendet. |
| Hämatoxylin- und Eosin-Färbungsset | N/A | Thermo Fisher | Kit, das zur histologischen Färbung von Gewebeschnitten für pathologische Analysen verwendet wird. |
| Immunfluoreszenz-Antikörper (CD206) | 14693-1-AP | Proteintech | Antikörper zur Erkennung des M2-Makrophagenmarkers CD206 in Gewebeschnitten verwendet. |
| Lipopolysaccharid (LPS) | L2630 | Sigma-Aldrich | LPS wurde verwendet, um eine entzündliche Makrophagepolarisation in RAW264.7-Zellen zu induzieren. |
| miR-181a-5p Mimic | N/A | N/A | Synthetisches miR-181a-5p-Mimik, das zur Modulation der miR-181a-5p-Pegel verwendet wird. |
| NEAT1-Expressionsplasmid | N/A | N/A | Plasmid wird für eine Überexpression von NEAT1 in RAW264.7-Makrophagen verwendet. |
| RAW264.7 Makrophagenzellen | TIB-71 | ATCC | Maus-Makrophagenzelllinie, die für In-vitro-Experimente verwendet wird. |
| RIPA Lysis-Puffer | 89901 | Thermo Fisher | Puffer, der zur Lysierung von Zellen verwendet wird, um das gesamte Protein zu extrahieren. |
| RPMI-1640 Medium | 11875-093 | Gibco | Kulturmedium für RAW264.7-Makrophagen. |
| SYBR Green Master Mix | 4385612 | Thermo Fisher | Reagenz wird für quantitative Echtzeit-PCR-Analysen verwendet. |
| Transwell-Migrationsprüfkammern | 3422 | Corning | Kammern werden für Transwell-Migrationstests zur Bewertung der Makrophagenwanderung verwendet. |
| TUNEL Apoptose-Assay-Kit | ab66110 | Abcam | Kit zur Erkennung von Apoptose in RAW264.7-Zellen mittels TUNEL-Färbung. |
| Westliche Blotting-Antikörper (HMGB1) | ab18256 | Abcam | Primärer Antikörper gegen HMGB1, der beim Western Blotting verwendet wird. |
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