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Der experimentelle Arbeitsablauf zur Bewertung der Wirksamkeit mikrobieller Inokulanten zur Verbesserung der Wasserstresstoleranz im Römersalat (Lactuca sativa L. var. Paspartu) ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Das Protokoll integrierte eine kontinuierliche Überwachung präziser Bewässerungsregime mit periodischer Erfassung physiologischer und thermischer Daten. Es wurden zwei unterschiedliche mikrobielle Produkte verwendet: (I) das mikrobielle Konsortium, ein komplexes Konsortium von 67 Stämmen, bestehend aus PGPR, Aktinomyceten und nützlichen Pilzen, das als physiologischer Puffer durch Wurzelbesiedlung und Exopolysaccharidsekretion (EPS) dient; und (II) Trichoderma harzianum, ein Einzelstamm-Inokulant von Trichoderma harzianum , das darauf abzielt, systemische Resistenz zu induzieren und die Wurzelarchitektur zu verändern. Die verwendeten Reagenzien, Ausrüstung und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Mikrobielle Impfung
Für beide mikrobiellen Behandlungen wurde ein standardisiertes Impfregime implementiert, bestehend aus sechs bodengetränkten Anwendungen, die die Rhizosphäre mit hochpräzisen Mikropipetten zur Simulation von Felddosierungen anvisieren. Die erste Phase trat während der Setzlingsphase 5 und 15 Tage nach der Aussaat auf (DAS). Bei 30 DAS wurden die Setzlinge in größere Höhlenschalen verpflanzt, wobei die zweite Impfphase einen Tag nach dem Umpflanzen (DAT) durchgeführt wurde, gefolgt von aufeinanderfolgenden Anwendungen bei 7, 15 und 20 DAT.
Für das mikrobielle Konsortium wurden die Dosierungen entsprechend der Pflanzenphänologie angepasst: Die ersten beiden Anwendungen wurden mit 500 g/ha (3 ml/Pflanze) angewendet, gefolgt von einer hochkonzentrierten Dosis von 2 kg/ha beim Umpflanzen und zum Abschluss mit drei Erhaltungsdosen von 300 g/ha. Ebenso wurde T. harzianum in den ersten beiden Phasen mit 1 L/ha, 3 L/ha beim Umpflanzen und 1 L/ha in den letzten drei Anwendungen aufgetragen. Dieser phasenweise Ansatz wurde entwickelt, um eine robuste Wurzelbesiedlung sicherzustellen und die Rolle der mikrobiellen Population als physiologischer Puffer während der kritischen Wachstums- und Stressinduzierungsphasen aufrechtzuerhalten.
2. Erntevorbereitung
Zertifizierte Römersalatsamen (Lactuca sativa L. var. Paspartu) wurden in Polystyrolschalen mit 311 Höhlen (11 ml pro Höhle) unter Verwendung eines professionellen Torfmoos-Substrats in einer Tiefe von 1 cm gekeimt. Die Keimung erfolgte in einer kontrollierten bioklimatischen Kammer, die bei einem Temperaturbereich von 15 °C bis 22 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % bis 70 % betrieben wurde. Nach Erreichen von 90 % Keimung (etwa 3–5 Tage nach der Aussaat) wurden die Setzlinge in größere Schalen mit einer Wurzelballkapazität von 55 ml verpflanzt, um eine uneingeschränkte Wurzelentwicklung zu ermöglichen (Abbildung 2 und Abbildung 3). Die Studie wurde in einem vollständig randomisierten Design (CRD) organisiert, mit 9 Versuchseinheiten (Schalen) und 20 Setzlingen pro Tablett. Diese Einrichtung war so strukturiert, dass sie eine 3 × 3 Fakultätsstrukturen (3 mikrobielle Behandlungen × 3 Bewässerungsregime) aufnehmen konnte. Detaillierte physikalisch-chemische Eigenschaften des Substrats und spezifische bioklimatische Kammerprogrammierung14sind in Abbildung 3, ergänzender Tabelle 1, ergänzender Tabelle 2 und ergänzender Tabelle 3 dargestellt.
Experimentelle Tabletts wurden mit einem vollständig randomisierten Layout innerhalb der bioklimatischen Kammer verteilt, um Randeffekte zu eliminieren und eine gleichmäßige Belichtung sicherzustellen. Die Kammer wurde so programmiert, dass sie dynamische feldähnliche Bedingungen simulierte, wobei ein Hochtemperaturregime genutzt wurde, um Offenfeld-Thermalspannung zu replizieren. Während der vegetativen Phase wurden Umweltparameter innerhalb eines variablen relativen Luftfeuchtigkeitsbereichs gehalten, und eine 9-Stunden-Photoperiode wurde durch hochintensive LED-Beleuchtung (über 50 % der maximalen Kapazität eingestellt, um ausreichende photosynthetisch aktive Strahlung sicherzustellen) bereitgestellt. Nach der Etablierungsphase wurde das Umweltprogramm angepasst, um die zunehmenden Anforderungen der Wasserdefizitbehandlungen widerzuspiegeln, wie in den schrittweisen atmosphärischen Übergängen15 (Abbildung 4 und Abbildung 5) dargestellt. Spezifische tags-/nächtliche Sollwerte für Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Lichtintensität sind in ergänzender Tabelle 1 und ergänzender Tabelle 2 detailliert dargestellt, um das Hauptprotokoll zu straffen.
Die Düngungsstrategie wurde entwickelt, um die spezifischen phänologischen Anforderungen von Römersalat zu erfüllen und während des gesamten vegetativen Zyklus einen ausgewogenen Nährstofffluss zu gewährleisten. Während der Setzlingsphase (12 bis 24 DAS) wurden Nährstoffe durch gezielte Anwendungen von Kaliumnitrat (KNO3), Monokaliumphosphat (KH2PO4) und Calciumnitrat (Ca(NO3)2) zugeführt. Um die frühe Etablierung zu fördern, wurde in den ersten 24 Tagen16 ein kommerzielles Biostimulans ergänzt.
Von 26 DAS bis zur abschließenden Bewertung bei 76 DAS wechselte das Fertigationsprogramm zu einem Erhaltungsregime, bei dem das Biostimulans eliminiert wurde, um die spezifischen Effekte der mikrobiellen Impfstoffe zu isolieren. Alle Anwendungen wurden kalibriert, um eine optimale elektrische Leitfähigkeit (EC) und den pH-Wert innerhalb der Rhizosphäre aufrechtzuerhalten. Der vollständige chronologische Ablauf der Mineralkonzentrationen und der spezifischen Dosierungsbände16ist in Ergänzungstabelle 3 detailliert dargestellt.
3. Behandlung mit Mikroorganismen
Um die Wirksamkeit biologischer Interventionen gegen hydrischen Stress zu bewerten, wurden drei verschiedene Behandlungen eingeführt: (I) mikrobielles Konsortium, ein hochdiverses mikrobielles Konsortium mit 67 nützlichen Stämmen, darunter Pflanzenwachstumsfördernde Rhizobakterien (PGPR), Actinomyceten und Pilze; (II) T. harzianum, eine spezialisierte Einzelstamm-Formulierung von Trichoderma harzianum; und (III) eine nicht geimpfte Kontrolle. Diese Behandlungen wurden aufgrund ihres Potenzials für indizierte systemische Toleranz (IST) ausgewählt, hauptsächlich durch Mechanismen wie Wurzelarchitekturmodifikation, ACC-Deaminaseproduktion und Exopolysaccharidsekretion (EPS).
Die Impfung folgte einem schrittweisen strategischen Ansatz. Die erste Anwendung (3 ml pro Pflanze) erfolgte mit hochpräziser Mikropipette direkt in die Rhizosphäre im zweiten echten Blattstadium, um eine frühzeitige Wurzelbesiedlung sicherzustellen. Nachfolgende Anwendungen wurden auf Feldgrößenäquivalente kalibriert (mit einer Dichte von 75.000 Pflanzen/ha). Für T. harzianum wurde eine Konzentration von 2 L/ha angewendet, während das mikrobielle Konsortium mit 1 kg/ha verabreicht wurde. Diese Formulierungen wurden im Bewässerungswasser gelöst und alle 15 Tage aufgetragen, um eine stabile mikrobielle Population als physiologischen Puffer während des gesamten vegetativen Zyklusaufrechtzuerhalten.
4. Verschiedene Bewässerungsbehandlungen
Um die physiologische und agronomische Plastizität von L. sativa unter unterschiedlichen hydrischen Bedingungen zu bewerten, wurden drei Bewässerungsregime auf Basis des Ersatzes der Pflanzenverdampfung (ETc) implementiert. Der volumetrische Wassergehalt wurde gegen die Feldkapazität (FC) des Substrats kalibriert, um eine präzise Spannungseinführung zu gewährleisten. Die Regime wurden wie folgt definiert: (I) Kontroll-/Brunnenbewässerung (CC-100 % ETc), bei der die vollständige Evapotranspiration wieder aufgefüllt wurde; (II) Mäßiges Wasserdefizit (75 % ETc), ausgelegt, um eine zwischenzeitliche hydraulische Begrenzung zu induzieren; und (III) Schweres Wasserdefizit (50 % ETc), das darauf abzielt, kritischen Wasserstress zu verursachen. Die Bewässerung erfolgte täglich nach der Aufnahme von Wärmebildern mit graduierten Pipetten, um eine genaue Erneuerung des durch Evapotranspiration verlorenen Wasservolumenssicherzustellen.
5. Daten- und Bildaufzeichnung
Um die thermische Verteilung und den Wasserzustand der Anlagen zu bewerten, wurden während des gesamten Versuchszeitraums täglich von Montag bis Freitag Infrarot-Wärmebilder aufgenommen. Alle fotografischen Aufnahmen wurden zwischen 12:00 Uhr und 14:00 Uhr durchgeführt, um die Messungen während der Zeit maximaler Transpiration und Sonnenintensität zu standardisieren. Es ist entscheidend, diese Bilder unmittelbar vor den täglichen Bewässerungsbehandlungen zu machen, um den kumulativen Wasserstress der Pflanzen im vorangegangenen 24-Stunden-Zyklus zu dokumentieren. Zur Bildaufnahme wurde die Infrarot-Wärmebildkamera an ein mobiles Gerät angeschlossen und hielt eine senkrechte Ausrichtung relativ zur Rückseite der Salatpflanzen in einem konstanten Abstand von 60–70 cm. Die Software war mit einer mehrfarbigen Wärmepalette konfiguriert, in der Temperaturgradienten vom niedrigsten bis zum höchsten dargestellt werden: beginnend mit Lila (kälter), übergehend in Königsblau, Türkis, Grün (Mittelpunkt), Gelb, Orange und schließlich Rot (heißeste). Innerhalb der Softwareschnittstelle wurde der spezifische Tray-Bereich mit dem Pflanzendach manuell ausgewählt, um die thermischen Daten zu erfassen. Diese Farbskala dient als physiologischer Indikator: Gut hydrierte Pflanzen zeigen aufgrund aktiver Transpiration kühlere Kronentemperaturen (lila/blau), während ausgetrocknete Pflanzen aufgrund des Spaltöffnungsverschlusses und verminderter Verdunstungsabkühlung höhere Kronentemperaturen (orange/rot) zeigen. Anschließend wurden diese hochauflösenden Bilder mit der Dreipunkt-Messfunktion über bestimmte Interessensgebiete (ROI) verarbeitet, um präzise Kronentemperaturwerte (Tc) für die Berechnung des Crop Water Stress Index (CWSI) zu extrahieren.
Wenn CWSI ist:
0, dann steht die Ernte nicht unter Wasserstress
1 dann steht die Ernte unter starkem Wasserstress
Wobei:
Tc ist die Temperatur des Kronendachs der Ernte, gemessen mit Infrarotbildgebung. Tw ist die Temperatur des Schirmdachs unter Bedingungen ohne Wasserstress. Td ist die Kronentemperatur unter maximalen Wasserbelastungsbedingungen 19.
Indikatoren für Pflanzenwachstum, Entwicklung und physiologischen Zustand, wie Höhe, Blattzahl und Blatttemperatur, bewertet mittels Infrarot-Thermografie, sind in ergänzender Tabelle 4 zusammen mit den Studienvariablen sowie den im Experiment verwendeten konzeptionellen und operativen Definitionen dargestellt. Die Kombination dieser Variablen ermöglichte eine umfassende Bewertung der Auswirkungen der experimentellen Behandlungen auf die physiologische Leistung und Entwicklung jeder Pflanze.
6. Datenanalyse
Physiologische und morphologische Daten wurden mit einer Einweg-ANOVA für jedes Bewässerungsregime analysiert, um die Wirkung der verschiedenen mikrobiellen Behandlungen zu bestimmen. Alle statistischen Verfahren wurden mit statistischer Software durchgeführt. Vor der Durchführung der inferenziellen Analyse wurden die grundlegenden Anforderungen für parametrische Statistiken überprüft, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Die Normalität der Residuen wurde mit dem Anderson-Darling-Test (S. > 0,100) bestätigt, was auf Normalität hinweist. Zusätzlich wurde die Homogenität der Varianzen mit dem Levene-Test (p = 0,989) validiert, was eine hohe Homoskedastik über Gruppen hinweg bestätigte. Da beide Annahmen erfüllt waren, wurde der Tukey HSD (Honestly Significant Difference) Post-hoc-Test verwendet, um signifikante Unterschiede (s. < 0,05) zwischen den Behandlungsmitteln zu identifizieren. Die einzelne Anlage wurde als Versuchseinheit für alle statistischen Bewertungen definiert.
