Biologische Standardisierung der humanen ASC-basierten Biofabrikation für reproduzierbare makroskalige Gewebekonstrukte

Zusammenfassung

Diese Studie präsentiert einen reproduzierbaren Biofabrikations-Workflow unter Verwendung von fettabgeleiteten Stammzellsphäroiden und 3D-gedruckten GelMA-Gerüsten. Es demonstriert räumliche Kontrolle, Fusionskapazität und Qualitätskontrollkennzahlen, was zu transplantierbaren makroskaligen Gewebekonstrukten mit potenziellen Anwendungen in der regenerativen Medizin führt.

Zusammenfassung

Das Fehlen standardisierter Protokolle in verschiedenen Laboren stellt eine erhebliche Hürde für die Vergleichbarkeit experimenteller Ergebnisse und den effizienten Transfer von Biofabrikationstechnologien dar. Eine strenge biologische Standardisierung verbessert nicht nur die Reproduzierbarkeit, sondern erleichtert auch die Ausrichtung an nationale und internationale regulatorische Rahmenbedingungen, die für die klinische Umsetzung von Tissue Engineering Strategien unerlässlich sind. Diese Studie führt einen standardisierten Biofabrikations-Workflow ein, der Monolayer-Kultur von hADSCs, Sphäroidbildung, 3D-Druck von Gelatine-Methacryloyl-(GelMA)-Gerüsten und Sphäroid-Bioassemblierung umfasst. Qualitätskontrollkennzahlen wurden integriert, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Das 3D-gedruckte GelMA-Gerüst wurde mit zwei zentralen Poren konstruiert, die jeweils Hunderte von Sphäroiden aufnehmen können. Die Druckgenauigkeit wurde durch den Vergleich der Gerüstmaße mit dem CAD-Modell bestätigt, mit geringfügigen, nicht signifikanten Abweichungen. hADSCs bildeten innerhalb von 24 Stunden einheitliche Sphäroide in Agarose-Mikroformen. Wenn sie in Gerüstporen eingepflanzt wurden, unterzogen sich die Sphäroide über 72 Stunden einer kontinuierlichen Fusion und bildeten makroskalige Konstrukte, die durch konfokale Bildgebung bestätigt wurden. Gerüstkonstruktion und Druckgenauigkeit sorgten für strukturelle Unterstützung, während die Gleichmäßigkeit der Kugeln eine vorhersehbare Konstruktion ermöglichte. Die Verschmelzung der Sphäroide innerhalb der Gerüstporen ergab Gewebekonstrukte, die für eine Transplantation geeignet sind, mit oder ohne Gerüst, was die Vielseitigkeit dieses Bioassemblierungsansatzes unterstreicht. Die Ergebnisse unterstreichen die entscheidende Rolle der biologischen Standardisierung bei der Weiterentwicklung reproduzierbarer Methoden für die Biofabrikation lebender Gewebekonstrukte, mit vielversprechenden Auswirkungen auf zukünftige klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin.

Einleitung

Bioassembly und Bioprinting sind komplementäre Biofabrikationsansätze in der Tissue Engineering, die sich auf den Aufbau komplexer Gewebe und Organe im Makromaßstab mit automatisierten Technologien 1,2,3,4 konzentrieren.

Sphäroide wurden in die Biofabrikation als Bausteine hauptsächlich für Bioassemblierungsansätze⁵ integriert. Sphäroide gelten als Mikrogewebe, die Interaktionen zwischen Zellen und der umgebenden Gewebe-Mikroumgebung in vivo reproduzieren. Unter den für die Sphäroidbildung verwendeten Zellquellen stechen fett-abgeleitete Stammzellen (ADSC) durch ihre einfache Isolierung, langfristige Kulturerhaltung und Differenzierungspotenzial ^6,7,8 hervor.

Aufgrund ihrer intrinsischen Fähigkeit, größere Aggregate zu bilden, können Sphäroide bei Bioassemblierungsmethoden komplexere Gewebekonstrukte erzeugen. Diese fusionsgetriebene Organisation verbessert das Regenerations- und Differenzierungspotenzial von Stammzellsphäroiden ^9,10.

Die Sphäroid-Bioassemblierung kann durch Biomaterialien¹¹ unterstützt oder sogar gesteuert werden, was diese Strategie für skalierbare und automatisierte Biofabrikation^12,13 geeignet macht.

Bestehende Biofabrikationsstrategien lassen sich grob in gerüstfreie Sphäroidmontageansätze und hydrogel-eingebettete Biodrucksysteme ^2,5,14 einteilen. Gerüstfreie Methoden basieren ausschließlich auf spontaner zellulärer Selbstassemblierung und intersphäroider Fusion und nutzen intrinsische Zell-Zell-Interaktionen. Da sie jedoch ohne äußere architektonische Steuerung oder geometrische Einschränkung auftreten, weisen diese Ansätze eine verminderte räumliche Kontrolle und eine geringere strukturelle Vorhersehbarkeit^auf. ^5,15. Im Gegensatz dazu setzt die hydrogelbasierte Kapselung Zellen in Bulk-Matrizen an, um strukturelle Unterstützung und vordefinierte Architektur^16,17 zu bieten, die den direkten Zell-Zell-Kontakt während früher Fusionsstadien teilweise einschränken und die Zellmigrationsdynamik beeinflussen^{kann 18}. In diesem Rahmen zeigen druckbare Biomaterialien wie Gelatinemethacryloyl (GelMA) Zelladhäsionsmotive und können als Gerüste dienen, um die sphäroide Bioassemblierung¹⁹ zu erleichtern. Ein 3D-gedrucktes GelMA-Gerüst wird angenommen, dass es geometrische Eingrenzung und räumliche Orientierung für Sphäroide bietet und so die kontrollierte Gewebebildung durch Fusion zu größeren, strukturell definierten Konstrukten fördert. Dieser Ansatz zielt darauf ab, die räumliche Kontrolle und die strukturelle Reproduzierbarkeit während der sphäroiden Bioassemblierung zu verbessern, indem eine gerüstgesteuerte Organisation mit sphäroider Fusion innerhalb einer definierten Hydrogel-Architektur kombiniert wird. Der derzeitige Arbeitsablauf konzentriert sich jedoch auf Prozessstandardisierung und strukturelle Biofabrikationsparameter und behandelt nicht langfristige Gewebereifung, funktionelle Differenzierung oder groß angelegte automatisierte Produktion.

Die biologische Standardisierung ist nicht nur unerlässlich, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit sicherzustellen, sondern auch um die funktionale Integrität biogefertigter Gewebe^{zu bewahren 19,20}. Daher ist eine präzise Kontrolle technischer, geometrischer und struktureller Parameter entscheidend, da diese Faktoren die biologische Leistungsfähigkeit direkt beeinflussen, einschließlich Gewebefunktion und Reifung ^5,21. Ein standardisierter und reproduzierbarer Biofabrikations-Workflow wird präsentiert, der die folgenden Schlüsselschritte umfasst: (1) ASC-Monolayer-Kultur; (2) ASC-Sphäroidformation; (3) 3D-Druck des GelMA-Gerüsts; und (4) sphäroide Bioassemblierung (Abbildung 1). In diesem Workflow wurden objektive Qualitätskontrollkennzahlen festgelegt, darunter sphäroide Einheitlichkeit und Sphärizität, Druckgenauigkeit und Gerüstformintegrität.

Protokoll

Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von Agarose-Mikroformen und Herstellung von GelMA 3D-gedruckten Gerüsten

1. Herstellung des 2%igen Agarose-Mikroschimmels in 0,9%iger Natriumchloridlösung (NaCl) (siehe Abbildung 2A)
   HINWEIS: Alle chemischen Abfälle müssen gemäß institutionellen Vorschriften zur Chemikaliensicherheit und den Richtlinien für gefährliche Abfälle behandelt und entsorgt werden.
   1. Bereiten Sie eine 0,9%ige NaCl-Lösung in ultrareinem Wasser und Autoklaven für 30 Minuten bei 121 °C vor. Halten Sie sie unter sterilen Bedingungen bis zur Anwendung aufrecht.
   2. Verdünnen Sie 1 g sterile ultrareine Agarose in 50 ml 0,9 % NaCl-Lösung. Homogenisieren und depolymerisieren Sie die Agarose in einer Mikrowelle in 10-sek-Intervallen für 3–5 Zyklen, bis sie vollständig gelöst ist.
   3. In einem biologischen Sicherheitsschrank wird eine kommerziell erhältliche Silikonform mit 81 runden Vertiefungen auf steriler Mull platziert.
   4. Geben Sie vorsichtig 600 μL Agarose in der Mitte der Silikonform auf und lassen Sie sie 40 Minuten ruhen, um eine vollständige Polymerisation sicherzustellen.
   5. Entforme vorsichtig die vollständig polymerisierte Agarose-Mikroform und übertrage sie in einen Brunnen einer 12-Well-Mikrotiterplatte.
   6. Stellen Sie die Position des Agarose-Mikroforms ein und fixieren Sie ihn am Boden des Brunnens, indem Sie ihn mit 600 μL Agarose füllen.
   7. Inkubieren Sie den Mikroschimmel vor, indem Sie mit Dulbeccos Modified Eagle Medium Low Glucose (DMEM, 2 mL/Well) für 15 Minuten inkubieren. Wiederholen Sie dieses Verfahren zweimal und ersetzen Sie in der dritten Inkubation durch das dreidimensionale (3D) Kulturmedium, das aus DMEM besteht, ergänzt mit Ascorbinsäure (50 μg/mL), humanem Serumalbumin (1,25 μg/mL), Penicillin-Streptomycin (PS, 1× aus einer 100× Lagerlösung) und ITS-Ergänzung (1×, aus einer 100× Lagerlösung).
      HINWEIS: Das 3D-Kulturmedium unterscheidet sich vom Monolayer-Expansionsmedium durch das Fehlen eines fetalen Rinderserums (FBS) und durch die Einbeziehung definierter Nahrungsergänzungsmittel, die die Zell-Zell-Interaktion und die Unterstützung der extrazellulären Matrix fördern und so eine korrekte sphäroide Selbstassemblierung und Stabilisierung begünstigen. Wenn Schimmelbildung und Zellbeschichtung an verschiedenen Tagen durchgeführt werden, kann das Verfahren nach der zweiten DMEM-Inkubation pausiert werden, und die Schimmel sollten unter sterilen Bedingungen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C bis zu 5 Tage gelagert werden. Die dritte Brutzeit mit 3D-Kulturmedium darf nur am Tag des Anrichten durchgeführt werden. Entferne vor dem Aussäen der Zellen das Medium sowohl aus dem Brunnen als auch aus dem Mikroschimmel vollständig.
2. Herstellung von Gelatine-Methacryloyl (GelMA) Hydrogel
   HINWEIS: Der gesamte Eingriff sollte im Dunkeln durchgeführt werden, da die Reagenzien lichtempfindlich sind. In dieser Studie wurden GelMA (Gelstärke 300 g Bloom, Substitutionsgrad 60%) und der Photoinitiator Lithiumphenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinat (LAP) verwendet. Zur Herstellung von 10 mL einer 10 % gew/v GelMA-Lösung mit 0,5 % w/v LAP:
   1. Lösen Sie 50 mg LAP-Pulver in 1 ml DMEM auf und mischen Sie es vorsichtig mit einer Pipette, bis eine klare, homogene Lösung entsteht.
   2. Übertragen Sie die LAP-Lösung in ein Zentrifugenrohr mit 9 ml DMEM und mischen Sie gründlich.
   3. In einem biologischen Sicherheitsschrank wird die resultierende Lösung durch Filtration durch einen 0,22-μm-Filter sterilisiert.
   4. Fügen Sie der Lösung 1 g GelMA hinzu und homogenisieren Sie sie mit magnetischem Rühren bei 50 °C für etwa 3 Stunden oder bis eine klare und homogene Lösung erreicht ist. Halten Sie den Kolben ans Licht, um sicherzustellen, dass die Lösung frei von sichtbaren Partikeln und Trübung ist.
   5. Füllen Sie das resultierende Hydrogel in eine 10-mL-Spritze für den späteren Druck oder, falls nicht sofort verwendet, lagern Sie es bei 2–8 °C, geschützt vor Licht, bis zur Benutzung.
      HINWEIS: Die GelMA- und LAP-Lösungen wurden etwa 24 Stunden nach der Vorbereitung verwendet. Eine längere Lagerung dieser Lösung wird nicht empfohlen. Sowohl GelMA- als auch LAP-Pulver sollten gemäß den Anweisungen des Herstellers bei 2–8 °C gelagert werden. Der LAP-Photoinitiator ist gemäß Normen wie ABNT NBR 14725 und Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 als nicht gefährlich eingestuft. Der Hersteller empfiehlt jedoch, persönliche Schutzausrüstung zu verwenden, um Atemwegs-, Haut- und Augenreizungen zu verhindern. Die Verwendung von Schutzbrillen, die gemäß relevanten staatlichen Standards geprüft und genehmigt sind, wie NIOSH (National Institute for Occupational Safety and Health – US) oder EN 166 (EU), sowie Nitrilgummihandschuhe mit einer Mindestdicke von 0,11 mm wird empfohlen. Atemschutz ist nur erforderlich, wenn Staub entsteht. Die Empfehlungen des Herstellers zum Atemschutz mit einem Filter basieren auf Normen wie DIN EN 143, DIN EN 14387 und anderen ergänzenden Standards, die sich auf das jeweilige Atemschutzsystem beziehen. Der Hersteller empfiehlt die Verwendung eines P1-Typ-Filters.
3. 3D-Modelldesign, Slicing und Generierung der G-Code-Datei
   HINWEIS: Das 3D-Gerüstmodell wurde mit der Online-3D-Computer-Aided-Design-(CAD)-Software Tinkercad entwickelt. Für dieses Protokoll wurde ein zylindrisches Gerüst mit einem Durchmesser von 15 mm, einer Bodendicke von 1 mm und zwei kreisförmigen Poren erzeugt, jeweils mit einem Durchmesser von 5,50 mm und einer Tiefe von 2 mm.
   1. Sobald das 3D-Modelldesign abgeschlossen ist, exportieren Sie es als *.stl-Datei (Supplementary File 1).
   2. Öffnen Sie die Software Repetier-Host V2.3.2, die verwendet wird, um das entworfene Modell zu slicen.
   3. Im Tab "Slicer" wähle die gewünschte Slicer-Option aus. In dieser Studie wurde die CuraEngine verwendet.
   4. Konfigurieren Sie das entsprechende Parameterprofil. In diesem Werk war die Geschwindigkeit 10 mm/s; Schichthöhe 0,2 mm; Infill-Muster: Raster; Ein Düsendurchmesser von 0,41 mm wurde verwendet.
   5. Lade die *.stl-Datei des zu druckenden 3D-Modells.
   6. Im Tab "Slicer" wählen Sie die zuvor erstellte Konfiguration aus.
   7. Klicken Sie auf "Slice with CuraEngine". Das geschnittene 3D-Modell wird dann in der Softwareoberfläche visualisiert.
   8. Klicken Sie auf "In Datei speichern", um die G-Code-Datei an der gewünschten Stelle zu speichern.
4. 3D-Druck von Gelatine-Methacryloyl (GelMA) Hydrogel-Gerüsten für sphäroide Bioassemblierung
   HINWEIS: 3D-Druck muss unter sterilen Bedingungen erfolgen. Überprüfen Sie daher vor Beginn des Druckvorgangs, ob der biologische Sicherheitsschrank mit dem Drucker eingeschaltet ist und der Luftstrom ordnungsgemäß funktioniert. Überprüfen Sie, dass die Höhe des Schutzglases des Schranks auf der Höhe der Markierung des Gerätsensors liegt.
   1. Entferne die Sicherheitsverriegelungen vom Bioprinter.
   2. Entferne die Glasplatte vom Druckbett, indem du die Metallklammern lösst.
   3. Befestigen Sie eine entsprechend geformte Acrylführung, um die Fixierung der Kulturplatte auf der Druckplattform mit Metallklammern zu unterstützen.
   4. Schließen Sie den Drucker an die Stromquelle an. Beachten Sie, dass dieses Gerät eine Doppelspannung (110/220 V) unterstützt.
   5. Verbinde das USB-Kabel des Druckers mit dem Computer.
   6. Drücke den Ein/Aus-Knopf , um den Drucker einzuschalten.
   7. Öffnen Sie Repetier-Host V2.3.2 Software, die verwendet wird, um das 3D-Modell anzusehen und zu drucken.
   8. Klicken Sie in der Softwareoberfläche auf die Option "Verbinden".
   9. Mit der manuellen Softwaresteuerung wählen Sie den Extruder (1 oder 2) und schicken Sie den Druckkopf in die Heimatposition (X = 0, Y = 0, Z = 0).
   10. Stellen Sie den ausgewählten Extruder für eine korrekte Spritzenanpassung mit dem entsprechenden manuellen Bedieninstrument in Repetier ein.
   11. Führe die Spritze vorsichtig in den Extruder, der bereits mit Hydrogel beladen und an einer Extrusionsdüse befestigt ist (in dieser Studie verwendeten wir eine konische Polypropylendüse mit einem Innendurchmesser von 0,41 mm).
   12. Setzen Sie die Kulturplatte in die Acrylführung, die am Druckbett befestigt ist.
   13. Stellen Sie die Z-Heimposition (Z = 0) mit der Z-Endstoppschraube auf der linken Seite des Bioprinters ein. Das heißt, stellen Sie den gewünschten Abstand zwischen der Extrusionsdüse und der Druckfläche ein. Idealerweise sollte die Düse leicht das Substrat berühren, das in dieser Studie die Kulturplatte war.
   14. Setze den Druckkopf in die Ausgangsposition zurück.
   15. Lade die zuvor generierte G-Code-Datei.
   16. Mit dem entsprechenden manuellen Steuerungswerkzeug in der Software extrudieren Sie etwas Hydrogel aus der Spritze, um den Materialfluss durch die Düse zu gewährleisten.
   17. Starte den Druckvorgang.
   18. Nach dem Drucken führen Sie Photocrosslinking des resultierenden Gerüsts mit dem UV-Lichtsystem des 3D-Biodruckers durch, das mit zwei LEDs bei 395–400 nm ausgestattet ist. Setzen Sie das Gerüst 5 Minuten lang UV-Licht aus (Lichtintensität 20 mW/cm^²).
   19. Verwenden Sie dieselbe depolymerisierte 2%-Agaroselösung wie zur Herstellung der Mikroformen, um die 3D-gedruckten Gerüste an den Brunnen einer 12-Well-Kulturplatte zu befestigen. Das Befestigen der Gerüste am Boden der Brunnen ist notwendig, um mehr Stabilität zu gewährleisten und eine Verschiebung während der Sphäroidaussaat und während der gesamten Kultur zu verhindern.
       HINWEIS: Bei Schritt 4.16 prüfen Sie, ob das Hydrogel während der Extrudion ein kontinuierliches Filament bildet. Typischerweise wird die Gelatinelösung noch im flüssigen Zustand (ca. 37 °C) in die Spritze geladen. Innerhalb weniger Minuten bei Raumtemperatur (22–25 °C) beginnt dieses Biomaterial, sich zu einer gelartigen Konsistenz zu entwickeln. Das Material sollte beim Extrudieren nicht tropfen, da dies die Druckqualität negativ beeinflusst. Die kontinuierliche Filamentbildung während der Extrusion zeigt, dass das Hydrogel eine optimale Konsistenz für den Druck erreicht hat. Die in DMEM verdünnte GelMA- und LAP-Lösung zeigt eine leicht orangefarbene Färbung. Nach UV-induzierter Photocrosslinking wird häufig eine Farbveränderung beobachtet, bei der das Material weißlich oder durchsichtig wird, wie in Abbildung 3D,E dargestellt. Beim Betrieb des UV-Systems sind Schutzbrillen zwingend erforderlich, um einen ausreichenden Augenschutz gegen ultraviolette Strahlung zu gewährleisten.
5. Analyse der Druckgenauigkeit
   HINWEIS: Die 3D-Druckgenauigkeitsanalyse von GelMA-Gerüsten berücksichtigt folgende Parameter: Gerüstdurchmesser, Porendurchmesser und Gerüstdicke. Zur Durchführung der Messungen wurde die Software ImageJ Version 1.54 verwendet.
   1. Zuerst nehmen Sie Bilder der Gerüste auf, die mit einem Stereomikroskop betrachtet werden. Verwenden Sie ein Lineal oder einen Bremssattel als Referenz.
   2. Bevor Sie die Bilder analysieren, kalibrieren und stellen Sie die Skala in ImageJ ein, um die Messungen durchzuführen.
   3. Verwenden Sie das Geradeaus-Werkzeug, um die Messungen durchzuführen.
   4. Da sowohl das Gerüst als auch die Porenform kreisförmig sind, verwenden Sie für die statistische Analyse den arithmetischen Mittelwert des Gerüsts und der Porendurchmesser.
   5. Für die Analyse der Druckgenauigkeit vergleichen Sie die von ImageJ von den gedruckten Gerüsten erhaltenen Messungen mit den im von Tinkercad generierten 3D-Modell definierten Werten.
      HINWEIS: Die gemessene Druckgerüstdicke wird mit der Summe der in Tinkercad projizierten Porentiefen- und Bodendickenwerte verglichen.
   6. Führen Sie eine statistische Analyse der gewonnenen Daten durch. In diesem Fall kann zum Vergleich der gemessenen Gerüstwerte mit den erwarteten Werten der Mann-Whitney-U-Test (nichtparametrisch) verwendet werden. Der Shapiro-Wilk-Test wird verwendet, um die Normalität zu beurteilen. Unterschiede gelten als statistisch signifikant, wenn p < 0,05.

2. Vorbereitung von hADSCs und Sphäroidbildung

HINWEIS: Kommerziell erhältliche humane, fettabgeleitete mesenchymale Stammzellen (hADSCs) wurden in zellspezifischem Wachstumsmedium kultiviert und bei 80–90 % Konfluenz gemäß den Herstellerempfehlungen durchführt. Zellen wurden bis Passage 7 für dieses Protokoll verwendet. Alle biologischen Abfälle müssen vor der Entsorgung ordnungsgemäß dekontaminiert oder sterilisiert und gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien behandelt werden. Für eine anschließende konfokale Visualisierung sollte die Monoschicht vor der Sphäroidbildung mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekennzeichnet und wie vom Hersteller empfohlen inkubiert werden. Die Sphäroidbildung kann 30 Minuten nach der Markierung eingeleitet werden.

1. Trypsinisierung der ASC-Monoschicht
   1. In einem biologischen Sicherheitsschrank öffnen Sie die Kulturflasche und geben Sie ihren Inhalt in einen Abfallbehälter.
   2. Waschen Sie die Monoschicht zweimal mit 1× Phosphatpuffersalzlösung (PBS) und entsorgen Sie die Lösung.
   3. Fügen Sie 0,125 % Trypsin/EDTA-Lösung hinzu, die ausreichen, um die Monoschicht zu bedecken. Schließe die Flasche und brüte bis zu 5 Minuten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C.
   4. Inaktiviere das Trypsin/EDTA, indem du ein gleiches Volumen DMEM hinzufügst, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS).
   5. Sammeln Sie die Zellsuspension mit einer serologischen Pipette oder übertragen Sie sie in Zentrifugenröhren. Zentrifugiere bei 400 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C).
   6. Entsorge das Supernatant vorsichtig.
   7. Das Zellpellet in DMEM wieder suspendieren und homogenisieren. Nehmen Sie einen Aliquot für Zellzählung und Lebensfähigkeitsbewertung.
2. Sphäroidenkultur (siehe Abbildung 2B)
   1. Trennen Sie die passende Anzahl der für jede Form zu plattierenden Zellen in ein 15-mL-Zentrifugenrohr. Für hADSCs sollte jede Agarose-Schimmel mit 81 Vertiefungen 1 × 10^{6 Zellen erhalten} – in jedem Mikrowell bildet sich ein Sphäroid, was 81 Sphäroide pro Mikroschimmel ergibt.
   2. Gib 1× PBS hinzu und zentrifugiere bei 500 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorge das Supernatant und füge 1× PBS hinzu. Wiederhole diesen Schritt zweimal.
   3. Nach der dritten Zentrifugation entsorgen Sie das Überlagerungsmittel vorsichtig und trocknen Sie die Röhrenöffnung mit sterilem Gaze, bevor Sie sie wieder in eine vertikale Position bringen.
   4. Das Zellpellet in 120 μL 3D-Kulturmedium für die Sphäroidkultur wieder suspendieren und homogenisieren. Stellen Sie das Aufhängungsvolumen auf 200 μL mit zusätzlichem 3D-Kulturmedium ein, falls nötig.
      HINWEIS: Jede Form mit 81 Resektionen hat eine Kapazität von 200 μL.
   5. Saugen Sie 200 μL ab und beschichten Sie es vorsichtig in der Mitte der Form, um Blasenbildung zu vermeiden.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann mit einem robotischen Pipettiersystem automatisiert werden, wie bereits²² beschrieben.
   6. Lass die Platte 5 Minuten im biologischen Sicherheitsschrank, damit sich die Zellen in die Resektionen eingewöhnen können.
   7. Stellen Sie den Teller für 40 Minuten in einen befeuchteten Inkubator.
   8. Nach dieser Phase geben Sie vorsichtig 2 ml 3D-Medium zu jedem Brunnen. Bringen Sie die Platte bei 37 °C zurück in den befeuchteten Inkubator.
3. Kugeloidmessung und statistische Analyse
   1. Aufnahmen der Sphäroide, die entlang der beiden Diagonalen des Agarose-Mikroforms positioniert sind und ein "X"-Muster bilden, mit einem invertierten optischen Mikroskop ausgestattet mit einer Digitalkamera und einem 10×-Objektiv. Verwenden Sie die 100-μm-Leiste, um die Bildskala vor der Messung der Durchmesser zu kalibrieren.
   2. Um die Haupt- und Nebendurchmesser der Sphäroide zu bestimmen, verwenden Sie das "Linien"-Werkzeug der Software und führen für jede fotografierte Sphäroide zwei senkrechte Messungen mit einem ungefähren 90°-Winkel dazwischen durch.
   3. Berechnen Sie den mittleren Durchmesser jedes Sphäroids als den arithmetischen Mittelwert der beiden zuvor gemessenen senkrechten Durchmesser. Berechnen Sie die Sphärizität als das Verhältnis des größten zum kleinsten Durchmessers jedes Sphäroids, wobei Werte näher an 1 eine größere Gleichmäßigkeit und eine sphärischere Form anzeigen.
   4. Führen Sie statistische Analysen unter Verwendung der erhaltenen Durchmesser- und Sphärizitätswerte durch.

3. Aussäung von Sphäroiden auf GelMA-Gerüsten für die Sphäroidfusion und Bioassemblierung

1. Nach 24 Stunden Sphäroidbildung entnehmen Sie sie aus den Agarose-Mikroformen mit einer Pipette mit breiten Bohrenden und übertragen sie in 2-ml-Mikroröhren.
2. Wenn sich die Sphäroide am Boden der Mikroröhren absetzen, entsorgen Sie den Überstandsmittel.
3. Die Sphäroide werden in 50 μL 3D-Medium wieder suspendiert.
4. Mit einer Pipette mit breiten Bohrenden sammeln Sie die Kugeln und setzen Sie sie vorsichtig in die Poren des GelMA-Gerüsts ein.
   HINWEIS: In einer GelMA-Stützpore mit etwa 5,50 mm Durchmesser und 2 mm Tiefe werden etwa 480 bis 640 Sphäroide (entsprechend 6–8 Agarose-Mikroformen, die jeweils 81 Kugeln mit Durchmessern von 200 bis 400 μm erzeugen) in 50 μL gesät. Diese Schätzung basierte auf dem Porenvolumen und dem mittleren Sphäroiddurchmesser, wobei die Quantifizierung anhand der Anzahl der vollständigen Mikroformen durchgeführt wurde, anstatt durch individuelle Sphäroidzählung, was eine praktische und reproduzierbare Schätzung der Sphäroiddichte innerhalb der Pore sicherstellte.
5. Nachdem die Sphäroide in die GelMA-Stützpore abgelagert wurden, warten Sie 20–40 Minuten, damit die Kugeln sich absetzen können. Gib jedem Brunnen 1 ml 3D-Medium hinzu.
6. Nach 24 Stunden geben Sie 1 ml 3D-Medium zu jedem Brunnen.
7. Überwachen Sie die Fusion der Sphäroide in den Poren von GelMA-Gerüsten mittels Phasenkontrastmikroskopie und Stereomikroskopie. Nehmen Sie die Bilder alle 24 Stunden auf, von Tag 0 (unmittelbar nach der Aussaat) bis Tag 3 (72 Stunden).
8. Fixieren Sie die biologische Konstruktion in 4 % Paraformaldehyd nach 72 Stunden zur Visualisierung mittels Konfokalmikroskopie. Behandeln Sie Paraformaldehyd in einer zertifizierten chemischen Abzughaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz) aufgrund seiner giftigen und reizenden Eigenschaften und entsorgen Sie Abfälle gemäß den institutionellen Chemikalienschutzrichtlinien. Zur konfokalen Beobachtung sollten die Zellen in der Monoschicht mit einem fluoreszierenden Farbstoff vorgekennzeichnet werden, bevor die Sphäroiden entstehen.
   HINWEIS: Wenn die Entfernung des Konstrukts aus der GelMA-Pore für Analyse oder in vivo-Anwendung erforderlich ist, entnehmen Sie es vorsichtig mit einer Präzisionspinzette oder einem entsprechend dimensionierten Biopsie-Punch.

Ergebnisse

Humane fett-abgeleitete Stammzellen (hASCs), die in einer Monoschicht kultiviert wurden (Abbildung 2C), wurden innerhalb von 24 Stunden nach der Aussäung in Agarose-Mikroformen erfolgreich dazu gebracht, Sphäroide zu bilden (Abbildung 2D). Die resultierenden Sphäroide wiesen eine kompakte und gut definierte Morphologie auf. Morphometrische Analyse zeigte einen mittleren Durchmesser von 239,8 μm ± 87,0 μm bei 24 Stunden (

Diskussion

Die in dieser Studie gezeigten Ergebnisse unterstreichen die erfolgreiche Integration von Qualitätskontrollkennzahlen in einen standardisierten Biofabrikations-Workflow, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Der Einsatz von 3D-gedruckten Gerüsten, die auf vorgefertigten Entwürfen basieren, bietet strukturelle Unterstützung für die Sphäroid-Bioassemblage^19,23. Als Konzeptnachweis wurde ein massives Gerüst mit zwei zentralen p...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Im Labor hergestellt		-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead	593iCAN	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	16500-500	-
Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	A4544-100MG	-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert	Zeiss	-	415510-1101-000
Celldiscover	Zeiss	-	LSM 900 with Airyscan 2
Celltracker	Invitrogen	C7025	-
Zentrifuge	Eppendorf	-	5702
Biologischer Sicherheitsschrank Klasse II	Streamline	-	Modell SC2-4E3
CO2-Inkubator für Zellkultur	Thermo Fisher Scientific	-	Serie 8000 WJ
Konischer Polypropylen-Düse 0,41 mm	593iCAN	-	-
Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium mit niedriger Glukose	Sigma-Aldrich	D2902-10L	-
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	12657-029	-
Gelatine-Methacryloyl-Gelstärke 300 g Bloom, Substitutionsgrad 60%	Sigma-Aldrich	900622	Lot-/Chargennummer: MKCS2673. Dokumentation für jede Charge, einschließlich des Sicherheitsdatenblatts (SDS) und des Analysenzertifikates (CoA), kann von der Website des Herstellers abgerufen werden.
GraphPad Prism 6.0 Software	GraphPad Inc	-	-
Magnetrührer mit Heizplatte	IKA	Z671797	Modell C-MAG HS7
Humanes Serumalbumin 100 mg/ml	FUJIFILM Irvine Scientific	9988	-
ITS (Insulin-Transferrin-Natriumselenit)-Supplement 100x	Sigma-Aldrich	I3146-5ML	-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP)	Sigma-Aldrich	900889
Luxoeo 4Z Stereozoom Mikroskop	Labomed	-	-
MicroTissues® 3D Petrischale® Mikro-Form für Sphäroide	Sigma-Aldrich	Z764019	-
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma-Aldrich	15140122	-
Poietics™ humane fettgewebeabgeleitete Stammzellen (ADSC)	Lonza	PT-5006
Natriumchlorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	71382-500G	-
Trypsin/EDTA	Gibco	27250018	-