Integrative Analyse gezielter genomischer Profilierung und Infiltration von Immunzellen bei der Prognose eines Lungenadenokarzinoms

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht die Integration von Next-Generation-Sequenzierung und mehrfarbiger Immunfluoreszenz zum Profilbild des Lungenadenokarzinoms. Es zielt darauf ab, die Beziehung zwischen genomischer Heterogenität und tumorinfiltrierender Immunzelldichte zu analysieren. Dieser multidimensionale Ansatz ermöglicht eine umfassende Bewertung des Tumormikroumfelds für die postoperative prognostische Beurteilung.

Zusammenfassung

Die Prognose eines Lungenadenokarzinoms (LUAD) wird traditionell mittels Tumor-Knoten-Metastase-(TNM)-Staging-Verfahren bewertet, das den Immunsystemstatus des Patienten nicht berücksichtigt. Dieses Protokoll integriert genomisches Profiling und Analyse der Immunmikroumgebung, um eine umfassendere postoperative prognostische Bewertung zu ermöglichen. Die Methode beinhaltet eine retrospektive Analyse von paraffin-eingebetteten Tumorgeweben mit zwei Haupttechniken. Zunächst wird die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) mit einem maßgeschneiderten 37-Gen-Panel durchgeführt, um Mutationen in Treibergenen und Varianten unsicherer Bedeutung zu identifizieren. Zweitens wird Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) genutzt, um Marker wie HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 und PanCK zu zielen. Dies ermöglicht die Quantifizierung der räumlichen Verteilung und Dichte spezifischer Immunzell-Subpopulationen über verschiedene Tumorregionen hinweg. Dieser integrierte Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Bewertung genomischer Heterogenität und tumorinfiltrierender Immunzellmerkmale. Die resultierenden Daten identifizieren spezifische Kombinationen von Mutationsprofilen – wie dem EGFR-Status – und der Dichte von Immunzellen. Diese integrierten Kombinationen ermöglichen die Untersuchung ihres gemeinsamen Einflusses auf das Überleben der Patienten und bieten einen vielversprechenden Ansatz für die Entwicklung zukünftiger prognostischer Lungenkrebsmodelle. Dieses Protokoll demonstriert eine robuste Methode zur Charakterisierung der komplexen biologischen Merkmale der LUAD-Tumor-Mikroumgebung.

Einleitung

LUAD ist der am häufigsten verbreitete Subtyp des Lungenkrebses, dennoch bleibt die durchschnittliche 5-Jahres-Überlebensrate mit etwa 15 ^{% niedrig}. Die aktuelle prognostische Bewertung stützt sich hauptsächlich auf das TNM-Staging-System; diese Methode übersieht jedoch oft den allgemeinen Immunstatus des Patienten, was die Vorhersagegenauigkeit einschränken kann. Hinweise deuten darauf hin, dass sowohl genomische Heterogenität als auch das Tumormikromilieu (TME) eine entscheidende Rolle bei der Tumorentstehung und dem Krankheitsverlauf von LUAD spielen ^2,3.

In den letzten Jahren hat der Übergang von traditioneller Sanger-Sequenzierung hin zu gezieltem NGS die hochsensitive, gleichzeitige Analyse mehrerer Treibergene wie EGFR, TP53 und KRAS ^4,5 ermöglicht. Während NGS eine hochauflösende Karte genetischer Veränderungen liefert, können genomische Daten allein die komplexen zellulären Interaktionen und räumlichen Organisationen innerhalb des TME nicht erfassen.

Um diese Komplexitäten zu bewältigen, bietet mIF erhebliche Vorteile gegenüber traditionellen Immunprofiling-Methoden. Während die Single-Plex-Immunhistochemie (IHC) auf einen Marker pro Schnitt beschränkt ist, ermöglicht mIF den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Proteinmarker bei gleichzeitiger Erhaltung der räumlichen Struktur des Gewebes. Im Gegensatz zur sequentiellen IHC, die Gewebeabbau verursachen kann, oder zur Durchflusszytometrie und Bulk-RNA-Sequenzierung, die zum Verlust räumlicher Lokalisierung und Einzelzellauflösung ^6,7,8 führt, ermöglicht mIF in Kombination mit räumlicher Regionsannotation eine in situ, mehrparametrige Charakterisierung der Immunlandschaft⁹.

Dieses Protokoll etabliert einen kombinierten Workflow, der gezielte NGS, mIF- und räumliche Regionbewertung integriert (einschließlich des gesamten Gewebes, der Tumorgrenze und des Tumorkerns). Ein solcher multidimensionaler Ansatz ist notwendig, um das Zusammenspiel zwischen genomischen Veränderungen und Immunzelldichte zu untersuchen – eine Beziehung, die Einzelmodalitätsansätze oft nicht erfassen können. Durch die Bewertung dieser integrierten Eigenschaften bietet dieses Protokoll eine ergänzende Strategie zur Charakterisierung der biologischen Merkmale von LUAD und bietet einen robusteren Rahmen für die postoperative prognostische Stratifizierung.

Protokoll

Diese retrospektive Studie wurde vom Medizinischen Ethikausschuss des Kunming Yan'an Krankenhauses genehmigt (Genehmigungsnummer 2021-140-01). Von allen Teilnehmern wurde eine informierte Zustimmung eingeholt.

Studiendesign und Stichprobenentnahme
Eine Kohorte von 63 Patienten mit pathologisch oder histologisch bestätigtem LUAD, die zwischen 2015 und 2021 eine chirurgische Resektion unterzogen hatten, wurde aufgenommen. Zu den Ausschlusskriterien gehörten die Erhalt einer neoadjuvanten Chemotherapie, Strahlentherapie oder Immuntherapie vor der Operation. Zusätzlich wurden Patienten mit gleichzeitigen Malignitäten, schweren Begleiterkrankungen, schlechter Gewebequalität oder unvollständigen klinischen Unterlagen aus der Analyse ausgeschlossen. Formalinfixierte, paraffin-eingebettete (FFPE) Tumorblöcke wurden zu 1-mm-Schnitten zur Deparaffinisierung verarbeitet. Wie im Arbeitsablauf (Abbildung 1) dargestellt, wurden diese Proben mit mIF und gezieltem NGS integriert analysiert. Dieser kombinierte Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Bewertung genomischer Veränderungen und der Eigenschaften der Immunmikroumgebung und bietet einen multidimensionalen Rahmen zur Charakterisierung der Tumorbiologie.

Nachfolge
Die gezielten Medikamente, die Immuntherapie sowie der Krankheitsverlauf oder der Tod des Patienten wurden telefonisch nachgefasst, und es wurden detaillierte Informationen über den Überlebensstatus, den Krankheitsverlauf oder -rückfall, die nach der Operation erhaltenen Adjuvansbehandlungen sowie neudiagnostizierte Begleiterkrankungen eingeholt. Die Nachbeobachtungszeit endete im Juli 2023, und der endgültige Beobachtungsendpunkt war Krankheitsprogression oder Tod. Das Gesamtüberleben wurde definiert als die Zeit vom Beginn der Operation bis zum Tod des Patienten. Bei der Nachsorge gingen keine Patienten verloren. Die Mindestnachsorgezeit betrug 21 Monate.

NGS-Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung
DNA-Extraktion aus FFPE-Gewebeschnitten
Entnehmen Sie FFPE-Gewebeschnitte (3–10 μm Dicke) aus pathologischen Proben. Setzen Sie Abschnitte in sterile Mikrozentrifugenröhren. Geben Sie Xylen zu jedem Röhrchen und inkubieren Sie 5–10 Minuten bei Zimmertemperatur, um Paraffin zu entfernen. Zentrifugiere bei 12.000 x g für 5 Minuten und entsorge vorsichtig das Supernatant. Wiederholen Sie die Xylenbehandlung einmal, um eine vollständige Deparaffinisierung sicherzustellen. Wasche das Pellet nacheinander zweimal mit 100 % Ethanol, um den Rest von Xylol zu entfernen. Lufttrocknen Sie das Pellet bei Raumtemperatur, bis das restliche Ethanol vollständig verdampft ist. Fügen Sie geeigneten Lysepuffer und Proteinase K (bereitgestellt im DNA-Extraktionskit) hinzu und inkubieren Sie bei 56 °C für 1–3 Stunden (oder bei Bedarf über eine Nacht), bis das Gewebe vollständig lysiert ist. Führen Sie eine zusätzliche Inkubation bei 90 °C für 1 Stunde durch, um die Formalinvernetzung umzukehren. Genomische DNA werden mit einem kommerziellen FFPE-DNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die DNA-Qualität von FFPE-Proben ist oft fragmentiert; daher sollte die DNA-Qualität minimale Integritätsschwellenwerte (z. B. DIN ≥ 5) erfüllen, um eine erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung für gezielte NGS sicherzustellen.

DNA-Quantifizierung und Normalisierung
Quantifizieren Sie DNA mit einer fluorometrischen Methode, um eine genaue Konzentrationsmessung sicherzustellen. Normalisieren Sie DNA-Proben auf eine Endkonzentration von etwa 5–10 ng/μL mit einem Tris-HCl-Puffer (pH 8,5). Führen Sie bei Bedarf schrittweise Verdünnungsschritte durch, um die Genauigkeit und Stabilität der DNA-Konzentration sicherzustellen.

Bibliotheksvorbereitung und Zielanreicherung
Bereite Sequenzierungsbibliotheken mit hybriden Capture-basierten gezielten NGS auf DNA vor, die aus FFPE-Gewebe¹⁰ extrahiert wurde. Führen Sie Zielanreicherung mit einem individuell angepassten Sondenpanel durch, das exonische Regionen ausgewählter Gene abdeckt, die mit der Tumorentwicklung assoziiert sind. Bewerten Sie die Qualität der Bibliothek und die Verteilung der Fragmentgröße bei Bedarf mit Standardmethoden (z. B. elektrophoresebasierten Systemen).

Bibliothekspooling und -sequenzierung
Quantifizieren Sie jede Bibliothek mit einem fluorometrischen Test. Poolbibliotheken bei äquimolaren Konzentrationen gemäß den Anforderungen des Sequenzierungskits. Laden Sie Pool-Bibliotheken auf die Illumina-Sequenzierungsplattform und führen Sie die Sequenzierung mit einem 150-bp-Pair-End-Sequenzierungsmuster durch.

Datenverarbeitung und Variantenerkennung
Roh-Sequenzierungslesungen wurden mit standardisierten bioinformatik-Pipelines verarbeitet, einschließlich Adaptertrimmung, Qualitätsfilterung und Ausrichtung auf das menschliche Referenzgenom (GRCh37/hg19). Die Qualitätskontrollkennzahlen waren wie folgt: Q20 > 85 %, durchschnittliche Sequenzierungstiefe > 2500-fach, On-Target-Rate > 65 % und Fold-80-Basisstrafe ≤ 2. Qualitätskontrolle und Ausrichtung: Rohdaten von FASTQ wurden mit FastQC und Trim Galore (oder Trimmomatic) Qualitätskontrolle unterzogen, um Adapterverunreinigungen und minderwertige Sequenzen zu entfernen. Saubere Lesungen wurden mit dem Burrows-Wheeler Aligner (BWA) auf das menschliche Referenzgenom GRCh37 (HG19) ausgerichtet. Post-Aligning-Verarbeitung: Sortierung, Duplikatmarkierung und Rekalibrierung des Basisqualitätsscores (BQSR) wurden mit Picard und dem Genome Analysis Toolkit (GATK) durchgeführt, um falsch-positive Aufrufe zu minimieren. Variantenaufrufe: Keimlinien-Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) und InDels wurden mit BWA MEM (0.7.16a - r1181) nachgewiesen. Somatische SNVs und InDels wurden durch einen Konsensansatz mit Mutect2 und VarScan2 identifiziert. Niederfrequente Mutationen wurden weiter mit dem Freebayes-(v 1.3.2)-Statistikmodell evaluiert. Annotation und Filterung: Varianten wurden mit ANNOVAR annotiert, wobei Daten von gnomAD, ClinVar und COSMIC integriert wurden. Keimbahnvarianten wurden von somatischen Mutationen unterschieden, indem hochfrequente Populations-SNPs herausgefiltert und variantische Allelfrequenzen (VAF) bewertet wurden. VAF-Schwellenwerte: Für klonale Ereignisse (z. B. ROS1 und ALK) wurde eine VAF-Schwelle von ≥5 % verwendet, während für Genmutationen (z. B. EGFR) eine 1%-Schwelle angewandt wurde, um die Erkennung niederfrequenter Veränderungen sicherzustellen, was durch die hohe durchschnittliche Sequenzierungstiefe von >500x möglich wurde. Keimbahnmutationen wurden von somatischen Mutationen anhand der 1000 Genomes Project (1000G)-Daten und einer lokalen Basisdatenbank gesunder Han-Chinesen in unserem Labor unterschieden. Die Bewertung der Pathogenität festgestellter somatischer Varianten erfolgte gemäß dem AMP/ASCO/CAP-Rahmenwerk¹¹, der die Evidenzbewertung für somatische Varianten durch einen gestuften, evidenzbasierten Ansatz verfeinert. Pathogene/wahrscheinlich pathogene (P/LP) Varianten werden beibehalten, wobei ihre Klassifikation auf Tier-I/II-Kriterien basiert, die A/B (FDA-Zulassung, klinische Studien) oder C/D (präklinische/Fallstudien) Nachweise für die Einstufung erfordern. Tier III (VUS) weist keine schlüssigen Belege auf, während Tier IV auf gutartige Varianten durch Populationshäufigkeit (z. B. gnomAD) oder funktionelle Studien hinweist; Diese Mutationen werden aus späteren Analysen ausgeschlossen. Die Pathogenitätsbewertung der nachgewiesenen Keimlinienvarianten wurde gemäß den ACMG/AMP-Richtlinien¹² durchgeführt. In dieser Studie wurden Varianten von pathogen (P), wahrscheinlich pathogen (LP) und unsicherer Bedeutung (VUS) dokumentiert. Nur hochkonfidenzielle Varianten, die Qualitätskontrollkriterien bestanden, wurden in nachgelagerten Analysen eingeschlossen (QUAL ≥1; Abdeckungstiefe >10 für Keimbahnmutation und Abdeckungstiefe >500x für somatische Mutation))

Probenvorbereitung aus FFPE-Gewebe
Herstellung von Paraffinschnitten
Schneide FFPE-Gewebeblöcke mit einem Mikrotom in 3 μm dicke Abschnitte. Schwimmteile auf einem 40–45 °C Wasserbad, um das Gewebe zu glätten. Befestige Abschnitte auf selbstklebende Objektträger und trockne sie bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Objektträger für 1 Stunde in einen 65 °C Trocknungsofen, um eine feste Haftung der Gewebeschnitte an den Objektträgern zu gewährleisten und überschüssiges Paraffin zu schmelzen.

Deparaffinisierung und Rehydrierung
Legen Sie die Objektträger in ein Beizerstell und tauchen Sie sie 5 Minuten lang in Reinigungslösung I. Überführen Sie die Slides nacheinander auf Clearing-Lösung II und Clearing-Lösung III, jeweils 5 Minuten, um Paraffin vollständig aufzulösen. Übertrage die Folien für 3 Minuten auf 100 % Ethanol, um die Reste des Klarierungsreagens zu entfernen. Rehydratieren Sie Gewebeschnitte durch eine graduierte Ethanolserie: 95 % Ethanol für 3 Minuten und 80 % Ethanol für 3 Minuten. Spüle die Gleiter zweimal in destilliertem Wasser, mit 3 Minuten Pause zwischen den Waschen. Xylen und Ethanol, die während der Deparaffinisation verwendet wurden, wurden aufgrund ihrer Flüchtigkeit und Toxizität in einer chemischen Abzugshaube behandelt. Alle Abfalllösungen, die organische Lösungsmittel enthalten, wurden separat gesammelt und gemäß den institutionellen Richtlinien zur Entsorgung gefährlicher Abfälle entsorgt.

HE-Fleckentrennwand
Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
Nach Deparaffinisierung und Rehydratation in Hämatoxylinlösung für 5–10 Minuten bei Zimmertemperatur wird die Träger untergetaucht. Spüle die Gleiter 5 Minuten unter laufendem Leitungswasser. Unterscheide die Objektträger in 1 % Salzsäurealkohol für einige Sekunden (3–10 Sekunden). Spüle sofort mit fließendem Leitungswasser ab. Blaue Kerne durch 5 Minuten in Leitungswasser eintauchen oder Bläulösung verwenden. Tauchen Sie die Objektträger 1–3 Minuten bei Raumtemperatur in Eosinlösung ein. Spülen Sie es bei Bedarf kurz in destilliertem Wasser ab.

Dehydrierung und Reinigung
Dehydrat gleitet durch gegraduertes Ethanol: 80 % Ethanol für 1 Minute; 95 % Ethanol für 1 Minute und 100 % Ethanol zweimal für 1 Minute. Durchsichtige Folien in Xylol I–II, jeweils 2–5 Minuten.

Montage
Trage einen Tropfen Neutral Balsam auf. Legen Sie vorsichtig einen Deckmantel an, um Luftblasen zu vermeiden. Lassen Sie die Objektträger vor der Bildnahme bei Raumtemperatur trocknen.

Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung von FFPE-Gewebeschnitten
Eine sequentielle multiplex-Immunfluoreszenzfärbung wurde durchgeführt, um mehrere Immun- und Tumormarker auf demselben Gewebeschnitt nachzuweisen. Dieser Ansatz ermöglicht eine In-situ-Visualisierung vielfältiger Zellpopulationen bei gleichzeitiger Erhaltung des räumlichen Kontexts¹³. Antigenentnahme: Füllen Sie ein Färbeglas mit Antigen-Rücknahmepuffer. Stellen Sie das Glas in eine Mikrowelle und erhitzen Sie es 3-5 Minuten auf hoher Leistung, bis die Lösung zu kochen beginnt. Übertragen Sie die Objektträger nach der Deparaffinisation und Rehydrierung vorsichtig in den beheizten Entnahmepuffer, wobei die Gewebeabschnitte vollständig untergetaucht sind. Die Wärme gleitet bei niedriger Mikrowellenleistung für 15 Minuten, um eine effiziente Entmaskierung des Antigens zu ermöglichen. Nach dem Erhitzen lassen Sie die Objektträger 30 Minuten bei Raumtemperatur natürlich abkühlen. Transferiere die Objektträger für 5 Minuten in Eiswasser, um den Antigenentnahme zu stoppen.

Waschen und hydrophobe Barrierevorbereitung
Spüle die Folien einmalig mit destilliertem Wasser, um den restlichen Rückholpuffer zu entfernen. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um einen Kreis um jeden Gewebeschnitt zu zeichnen. Spülen Sie die Gleiter erneut kurz mit destilliertem Wasser. Wasche Folien zweimal mit TBST-Puffer. Nach jeder Wäsche stellen Sie die Folien horizontal für 3 Minuten an, um den Puffer gründlich zu entfernen.

Blocken
Tragen Sie einen Blockpuffer auf, um den Gewebeschnitt vollständig zu bedecken (~100 μL pro Objektträger). Inkubiere die Objektträger 15 Minuten lang in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur.

Primäre Antikörperinkubation
Entfernen Sie den Blockpuffer, indem Sie sanft die Schlittenkante auf das saugfähige Papier klopfen. Primäre Antikörper gegen HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 und PanCK wurden bei optimierten Arbeitsverdünnungen von 1:100 bis 1:400 aufgetragen. Tragen Sie ~100 μL verdünnte primäre Antikörperlösung auf jeden Gewebeschnitt auf. Inkubieren Sie Objektträger in einer befeuchteten Kammer: 37 °C für 1 Stunde oder 4 °C über Nacht für erhöhte Empfindlichkeit.

Waschen
Waschrutsche dreimal mit TBST-Puffer, jeweils 3 Minuten pro Waschen. Stellen Sie nach jeder Wäsche die Rutschen horizontal an, um eine Pufferdrainage zu ermöglichen.

Sekundäre Antikörperinkubation
Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie 1:3 im TBST-Puffer verdünnen. Auf jeden Objektträger werden etwa 100 μL sekundäre Antikörperlösung aufgetragen. Inkubieren Sie die Objektträger bei 37 °C für 10 Minuten in einer befeuchteten Kammer. Wasch-Slides 3-mal mit TBST, jeweils 3 Minuten pro Wasch.

Verstärkung des fluoreszierenden Signals
Verdünnen Sie das fluoreszierende Verstärkungsreagenz um 1:100 im Verstärkungspuffer. Auf jeden Objektträger werden 100 μL verdünntes Reagenz aufgetragen. Inkubieren Sie Objektträger bei Raumtemperatur 10 Minuten im Dunkeln, um Photobleaching zu verhindern. Wasch-Slides 3-mal mit TBST, jeweils 3 Minuten pro Wasch.

Antigenrückgewinnung zwischen Markern
Führen Sie die Mikrowellen-Antigenentnahme wie beschrieben durch. Nach dem Erhitzen werden die kühlen Rutschen nacheinander gekühlt: 5 Minuten in warmem Wasser und 5 Minuten in Eiswasser.

Sequentielle Färbung zusätzlicher Marker
Wiederholen Sie die primären und sekundären Antikörper-Inkubationsschritte für jeden zusätzlichen Antikörpermarker. Stellen Sie sicher, dass die Antigenentnahme nach dem Färben jedes Markers erfolgt, bevor Sie zum nächsten Antikörper übergehen.

Nukleare Gegenfärbung
Wasch-Slides 1-mal mit TBST-Puffer. Trage DAPI-Nuklearfarbe auf. Brüte bei Zimmertemperatur 5 Minuten im Dunkeln aus. Wasche die Rutschen dreimal mit destilliertem Wasser. Endpunktsbestimmung: Die Kerne sollten unter Fluoreszenzmikroskopie klar gefärbt erscheinen.

Letztes Flecken-Flecken
Trage eine 1:200 verdünnte Biotinlösung in einem Amplifikationspuffer auf und inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wasch-Slides 3-mal mit TBST-Puffer. Führen Sie die Antigenentnahme wie beschrieben durch. Wasch-Slides 3-mal mit TBST-Puffer. Endogenes Biotin-Blockierreagenz auftragen, 37 °C 30 Minuten inkubieren. Trage die Färbungsfarbe 1:100 in TBST auf und brüte 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln ein. Spüle die Folien 1x mit TBST und lasse sie 3 Minuten abtropfen.

Montage
Gib einen Tropfen Antifade Mounting Medium auf den Gewebebereich. Legen Sie vorsichtig einen Deckdeckel über den Rutsch. Lassen Sie die Objektträger vor der Bildgebung trocknen.

Bildaufnahme der H&E- und mIF-Abschnitte
Ganz-Objektträger-Bilder (WSI) von H&E-gefärbten und mIF FFPE-Gewebeschnitten wurden mit einem Objektträger aufgenommen. Brightfield-Scanning wurde für H&E-Schnitte durchgeführt, während Fluoreszenz-Scanning für mIF-Schnitte verwendet wurde. Ziel: 20-fache Vergrößerung für Übersichtsscans; 40-fache Vergrößerung für hochauflösende regionale Bildgebung. Anregungs- und Emissionseinstellungen: Für jedes Fluorophor gemäß den Herstellerspezifikationen optimiert. Belichtungszeit und Verstärkung: Automatisch von Bildgebungssoftware angepasst, um eine ausreichende Signalintensität ohne Sättigung zu gewährleisten.

mIF Qualitätskontrolle und Bildbewertung
Um die Zuverlässigkeit der mIF-Ergebnisse sicherzustellen, wurde vor der Gewebeklassifikation und Zellquantifizierung mit dem digitalen Pathologiesystem HALO ein rigoroses QC-Protokoll implementiert. Artefaktentfernung und herausschätzbare Flächendefinition: Whole-Dia-Bilder (WSIs) wurden sorgfältig überprüft, um Bereiche mit Gewebefalten, Färbeartefakten und unspezifischen Hintergrundsignalen manuell auszuschließen. Dieser Schritt war unerlässlich, um falsch-positive Signale zu verhindern und die Genauigkeit der räumlichen Analyse sicherzustellen. Nach diesem Screening wurden im Durchschnitt 80 % (Bereich: 50 %–95 %) der Gewebefläche aller Proben als wertvolle mIF-Region eingestuft. Pathologische Verifikation und Trennung: Um Tumor- und Stromalkompartimente genau abzugrenzen, wurden mIF-Schnitte mit benachbarten Serienschnitten mit H&E gefärbt. Die Anmerkungen wurden unabhängig von zwei erfahrenen Pathologen überprüft, wobei eventuelle Unstimmigkeiten im Konsens behoben wurden. Proben mit einer Tumorgewebefläche von weniger als 30 % wurden aus der Studie ausgeschlossen, um die analytische Strenge aufrechtzuerhalten. Validierung nach der Quantifizierung: Nach automatisierter Zellphänotypisierung und Quantifizierung wurden die räumliche Verteilung und die Expressionsmuster der Immunzell-Subpopulationen von Pathologen neu bewertet. Diese Überprüfung stellte sicher, dass die digitalen quantitativen Daten mit den zugrunde liegenden histomorphologischen Eigenschaften übereinstimmten und so die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Ergebnisse garantierten.

Digitale Pathologieanalyse und Regionsannotation
Die panoramisch gescannten Bilder wurden zur Verarbeitung in die digitale Pathologie-Bildanalyseplattform importiert. Das HALO AI Nuclei Seg-Plugin wurde verwendet, um Zellen zu segmentieren und zu identifizieren. Anhand der H&E-Färbung als Referenz wurden die folgenden Interessenbereiche (ROIs) manuell annotiert: Ganze Tumorregion (WSIT); Tumorgrenze (TB); Tumorkern (TC). Die positive Signalerkennung wurde anhand der Fluoreszenzintensitätsschwellenwerte und der erwarteten subzellulären Lokalisierung jedes Markers bestimmt. Dieser kompartimentspezifische Ansatz wurde angewandt, um Hintergrundinterferenzen zu minimieren und die Genauigkeit der Immunzell-Identifikation zu verbessern. Die Dichte der Immunzellen wurde als Anzahl der markerpositiven Zellen pro ausgewählten Tumorregionen quantifiziert. Richten Sie mIF-Bilder mit entsprechenden H&E-abgeleiteten Annotationen basierend auf der Gewebemorphologie aus. Die Patienten wurden nach dem Medianwert der Immunzelldichte für jeden Marker in hochdichte und niedrigdichte Gruppen eingeteilt.

Statistische Analyse
Für die Analyse wurde die SPSS 17.0-Software verwendet. Normal verteilte Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben, und nicht-normal verteilte quantitative Daten als Median (25%-75% Quantilbereich). Die Korrelation zwischen jedem Genmutationstyp, der Dichte der Immunzellen und klinischen Eigenschaften wurde mit dem Cox-Proportional-Hazards-Regressionsmodell mithilfe des Python-Lifelines-Modells analysiert. Je nach Stichprobengröße und ob die Daten der Normalverteilung entsprachen, wurde der Studententest oder der Mann-Whitney-U-Test zum Vergleich zwischen kontinuierlichen Variablen verwendet. Der Wilcoxon-Zeichenranktest wurde zum Vergleich von Rangvariablen verwendet. Der Chi-Quadrat-Test oder Fishers exakter Test wurde für die Analyse ungeordneter kategorischer Variablen entsprechend Stichprobengröße und theoretischer Häufigkeit ausgewählt. Der Spearman-Test oder der Pearson-Test wurde für die Korrelationsanalyse verwendet. Die Gesamtüberlebensrate der Patienten wurde mit der Kaplan-Meier-Methode ermittelt, und der Log-Rang-Test wurde für die Tests verwendet. Überlebenskurven wurden mit der R-Sprache auf Basis der RStudio-Software gezeichnet. P-Wert <0,10 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Praktische Anwendbarkeit und Einschränkungen
Für die zuverlässige Umsetzung dieses integrierten Arbeitsablaufs müssen FFPE-Gewebeblöcke strenge Qualitätsstandards erfüllen, darunter eine ideale Tumorzellularität von ≥30 % und das Fehlen umfangreicher Nekrose oder bedeutender Gewebeartefakte. Der technische Erfolg von mIF hängt stark von der Gewebeerhaltung ab; Faktoren wie Überfixierung, übermäßige Schäden oder hohe Hintergrund-Autofluoreszenz können zu unzureichender Antikörperpenetration und suboptimaler Signalintensität führen. Darüber hinaus sollten mehrere inhärente Einschränkungen dieser Studie berücksichtigt werden. Erstens basiert die Analyse auf einer retrospektiven, einzentrigen Kohorte von 63 Patienten, was die statistische Stärke und die breite Verallgemeinerbarkeit der Ergebnisse auf andere Populationen einschränken könnte. Zweitens beschränkt sich der Umfang der Bewertung auf ein festes 37-Gen-NGS-Panel und einen spezifischen Satz von Immunmarkern (HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 und PanCK; Ergänzende Tabelle 1). Wie in den Quellen erwähnt, bietet dieser kombinierte Ansatz zwar einen robusteren Rahmen für die prognostische Stratifizierung, aber größere prospektive, multizentrische Studien sind notwendig, um diese Assoziationen weiter zu validieren und den prädiktiven Nutzen der identifizierten Biomarker zu verfeinern.

Ergebnisse

Klinische Merkmale von Patienten mit Lungenadenokarzinom
In dieser Studie wurden insgesamt 63 Patienten gesammelt, bei denen LUAD diagnostiziert wurde und von 2015 bis 2021in unserem Krankenhaus operiert wurde und die die Einschlusskriterien erfüllten. Die klinischen Merkmale der eingeschlossenen Patienten sind in Tabelle 1 dargestellt. Unter den eingeschriebenen Patienten betrug das mittlere Alter 60 Jahre (47–73 Jahre), darunter 30/63 männl...

Diskussion

Integrierte genomische und räumlich aufgelöste immunologische Profilierung von LUAD
Diese Studie demonstriert einen integrierten Workflow, der gezielte NGS und mIF kombiniert, um die multidimensionale Landschaft von LUAD zu charakterisieren. Unsere genomischen Ergebnisse stimmen mit der bisherigen Literatur überein, insbesondere hinsichtlich ethnischer Variationen in der Mutationshäufigkeit. Die beobachtete EGFR-Mutationsrate (etwa 40 %–60 %) entspricht den g...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AlphaTSA Multiplex-IHC-Kit	alphaxbio Technology Co., Ltd.	AXT36025011	Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
Antifade-Montagemedium	Leagene Technology Co., Ltd.	IH0252, Lot0525A17	Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
CD163	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd	ZM0428	RRID:AB_3714707; Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
CD206	Abcam, Inc	Kat# 5307-1	RRID:AB_10896526; Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
CD68	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd	ZM0060	RRID:AB_2904190; Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
Angepasstes Krebsgen-Panel	TWIST Co., Ltd.		NGS Bibliotheksvorbereitung
Deparaffinisationsbuffe	QIAGEN Co., Ltd.	19093	DNA-Extraktion HE-Färbung; Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung durch FFPE-Gewebeschnitte
Dynabead M-270 streptavidin	Thermo Co., Ltd.	65602	NGS Bibliotheksvorbereitung
Fluorometer	ThermoFisher Scientific Co., Ltd.	QUBIT 4.0	NGS Bibliotheksvorbereitung
HALO digitale Pathologie-Bildanalyseplattform	Indica Labs, Inc., Albuquerque	Version 3.6.4134	HE-Färbung und Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
Hämatoxylin-Eosin-Färbungsset	Wuhan elabscience Technology Co., Ltd.	E-IR-R117	HE-Fleck
HiPure FFPE DNA-Kit	Guangzhou Magen Biotechnology Co., Ltd.	D6323	DNA-Extraktion aus FFPE-Gewebeschnitten
HLA-DR	HUABIO Co., Ltd.	ET1610-66	RRID:AB_3069950; Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
Illumina DNA-Sequenzierer	Illumina,  Inc	550DX	Sequenzierung
Neutraler Balsam	Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590	HE-Fleck
Panck	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd	ZM0069	RRID:AB_2941997; Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
PD-L1	F&E-Systeme	Katalog # AF1019	RRID:AB_354540; Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
TBST-Puffer	abclonla Technology Co., Ltd.	RM00013	HE-Färbung und Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
UN-Blocker	homgen Co., Ltd.		NGS Bibliotheksvorbereitung
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme Co., Ltd.	N411	NGS Bibliotheksvorbereitung
VAHTS uniersale DNA-Bibliothek Vorbereitungsset für illumina	Vazyme Co., Ltd.	ND610	NGS Bibliotheksvorbereitung
Ganz-Objektbild-Bildgebungssystem	ZEISS Co., Ltd.	ZEISS AXIOSCAN 7 Version 3.3	HE-Färbung und Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung
xGen Hybridisierung und Waschkit	IDT Co., Ltd.	1080577	NGS Bibliotheksvorbereitung