Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung

1.2K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/69853

⸱

20. März 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Single-Antibody-Markierung (SAL), um die nanoskalige räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu klären. Durch die Nutzung kumulativer Antikörper-Epitope-Interaktionen auf Einzelmolekülebene kartiert Membran-SAL (mSAL) lokale Epitope-Verteilungen und erfasst gleichzeitig das Antikörperbindungsverhalten in der nativen zellulären Umgebung.

Zusammenfassung

Die Plasmamembran definiert die Zellform und dient als Schnittstelle, die die interzelluläre Kommunikation steuert. Membranproteine bilden eine Hauptklasse therapeutischer Ziele; Daher birgt die Superauflösung der Zellmembran durch ihre konstitutiven Proteine großes Potenzial für die Weiterentwicklung der Zellbiologie und Antikörpertherapien. In diesem Zusammenhang ermöglicht die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) die nanoskalige Visualisierung von Proteinorganisationen auf biologischen Strukturen. Trotz seiner Bedeutung stellt die Anwendung von SMLM auf Plasmamembranproteine besondere Herausforderungen dar. In diesem Protokoll präsentieren wir einen effektiven Ansatz unter Verwendung von Zeitraffer-Single-Antikörper-Labeling (SAL), genannt Membran-SAL (mSAL). Wir bieten detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen, einschließlich Optimierung der Antikörperkonzentration, der Laserenergiedichte, der Dauer der Nicht-Beleuchtungsintervalle, Bildrekonstruktion und dichtebasierter Clusteranalyse, um die nanoskalige Membranproteinverteilung und Membranmorphologie zu klären. Wir verwenden das Tetraspanin-Protein CD81 als Modellmembranprotein, um die Leistungsfähigkeit von mSAL sowohl auf adhärenten als auch auf suspendierenden Säugetierzellen zu demonstrieren. Neben der Superauflösung der Zellmembran und der Verteilung von Membranproteinen ermöglicht unsere Technik die Untersuchung der Pharmakodynamik therapeutischer Antikörper, die mit ihren Membranzielen in der natürlichen Membranumgebung interagieren.

Einleitung

Die Plasmamembran enthält eine Vielzahl von Proteinen, die die Zellmobilität, Adhäsion, Wahrnehmung und interzelluläre Kommunikation regulieren. Das Verständnis der nanoskaligen Verteilung von Plasmamembranproteinen ist wichtig, da die Funktion des Proteins oft nicht nur durch das Expressionsniveau, sondern auch durch ihre räumliche Organisation auf derMembran 1,2 bestimmt wird. Bemerkenswert ist, dass viele therapeutische Antikörper auf Membranproteine 3,4 abzielen, was nanoskalige Untersuchungen unerlässlich macht, um zu verstehen, wie Antikörperinteraktionen von der lokalen Membranproteinorganisation beeinflusst werden. Eine präzise Kartierung der Membranproteinverteilung, die Einzelmolekülprofilierung ihrer Häufigkeit und die Echtzeitüberwachung ihrer dynamischen Interaktionen mit Bindungspartnern bleiben jedoch herausfordernd.

Weit verbreitete Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopietechniken (SMLM), wie die direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)5,6 und DNA-basierte Punktakkumulation zur Bildgebung in der nanoskaligen Topographie (DNA-PAINT)7 verwenden Immunfluoreszenzfärbung (IF) zur Probenkennzeichnung. Sie erreichen laterale Auflösungen von ~ 10 nm und haben umfassende Einblicke in die nanoskalige Organisation therapeutischer Membranziele geliefert, darunter der humane epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2)8,9, CD2010, T-Zell-Rezeptoren 11,12,13, programmierter Todesligand 1 14, B-Zell-Rezeptoren 15,16,17 und CD19 17.18. So haben d-STORM-Studien, die den therapeutischen monoklonalen Antikörper Trastuzumab verwenden, um HER2, einen Schlüsselrezeptor, der mit Brustkrebs in Verbindung gebracht wird, direkt zu erkennen, unterschiedliche Clusterzustände bei HER2-positiven Patientenaufgezeigt 8, während verschiedene therapeutische Antikörper gezeigt wurden, dass sie HER2-Clustering9 modulieren. DNA-PAINT in Kombination mit der Gitterlichtblattmikroskopie hat die oligomeren Zustände und Interaktionsprofile von CD20 in B-Zellen mit therapeutischen monoklonalen Antikörpern Rituximab, Ofatumumab und Obinutuzumab10 aufgeklärt. Obwohl konventionelles SMLM wertvolle Einblicke in die nanoskalige Organisation liefert, ist sein volles Potenzial durch traditionelle IF-Färbemethoden begrenzt. Die Qualität des SMLM-Bildes hängt von der IF-Färbung ab, die wiederum von der Spezifität und Affinität des Markierungsantikörpers bestimmt wird. Traditionelles SMLM verwendet Antikörper mit hoher Affinität, die typischerweise eine bessere IF-Färbung und Bildqualität erreichen. Allerdings interagieren die meisten therapeutischen Antikörper mit Membranrezeptoren lebender Zellen mit moderater Affinität, um abweichende Nebenwirkungen zu minimieren19. Zum Beispiel zeigen bispezifische T-Zell-Engagere (TCEs) eine geringere Affinität für CD3, was die TCR-Internalisierungverhindert 20,21,22. Solche Wechselwirkungen können mit herkömmlichen IF-Techniken nicht genau erfasst werden.

Wir haben zuvor eine Strategie entwickelt, die direkt Einzelmolekül-Antikörper-Epitope-Interaktionen nutzt, die als Einzel-Antikörper-Markierung (SAL) bezeichnet werden. SAL ermöglicht eine Hochdichte-Kartierung von Antikörper-Epitope-Interaktionen und erhält dabei native Bindungsgleichgewichte23. Obwohl wir zuvor ein Protokoll für intrazelluläre zytoskelettale und mitochondriale Proteine24 berichtet haben, wurde SAL auf Membranproteinen nicht nachgewiesen. In diesem Protokoll bieten wir einen Schritt-für-Schritt-Ablauf zur Anwendung von SAL auf Membranproteine, der durch die Markierung des Tetraspanins CD81, einem berichteten therapeutischen Zielkandidaten 25,26,27,28, sowohl in Suspensions- als auch in Adhärentzellen demonstriert wurde. Mit fluoreszenzmarkierten Anti-CD81-Antikörpern zur direkten Untersuchung der räumlichen Verteilung von CD81 an U2OS- und Jurkat-T-Zellen, demonstrieren wir die Anwendung von SAL-Nanoskala-Studien an Membranproteinen. Wir haben diese Strategie als Membran-SAL (mSAL) bezeichnet. Abschließend beschreiben wir eine clusterbasierte Strategie, um die isolierten Einzelmolekül-Nachweise außerhalb der Zelle zu reduzieren.

Im Wesentlichen nutzt SAL Zeitraffer-Einzelmolekül-Markierung, um einzelne Antikörper-Epitope-Interaktionen zu erfassen, und die anschließende Dekonvolution des Einzelemitters liefert ein Superauflösungsbild basierend auf SMLM. Durch Anpassung der Antikörperkonzentration und die Auswahl eines geeigneten nicht-beleuchtenden Intervalls (NII) zwischen aufeinanderfolgenden Bildframes passt SAL die Antikörper-On-Rate an die Detektionsrate eines einzelnen Moleküls an, wodurch eine Lokalisierung von Einzelmolekülen ermöglicht wird. SAL erfordert längere NIIs aufgrund der von Natur aus langsamen Bindungskinetik von Antikörpern, die die Bildaufnahmezeit verlängert (~3–17 H). SAL eignet sich am besten für Anwendungen, die eine präzise nanoskalige Kartierung von Epitopen und die Bewertung individueller Antikörper-Epitope-Interaktionsdynamiken erfordern. Trotz seines geringeren Durchsatzes bietet SAL einzigartige Einblicke in die Organisation von Epitopen und die Beteiligung von Antikörpern unter nahezu physiologischen Bedingungen, was es besonders wertvoll macht, um therapeutische Antikörper in situ zu charakterisieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Dieses Protokoll verwendet die etablierten Jurkat E6.1- und U2OS-Zelllinien und beinhaltet keine primären menschlichen oder lebenden Tiermaterialien.

1. Zellsäung/-landung und Fixierung

HINWEIS: Die Probevorbereitung folgt den standardisierten Immunfluoreszenz-(IF)-Färbungsprotokollen, die optimiert sind, um die subzelluläre Organisation von Plasmamembranproteinen über verschiedene Zelltypen hinweg zu erhalten. Wenn ein etabliertes Immunfärbungsprotokoll für das gewünschte Ziel existiert, können Nutzer dieses Protokoll bis zum probenblockierenden Schritt 1.2.14 befolgen. Die Single-Antibody-Markierung (SAL) basiert auf der kumulativen Detektion fluoreszenzmarkierter Antikörper, während sie auf Einzelmolekülebene an ihr Antigen binden. Fluoreszenzmarkierte Antikörper, die in einem Bildpuffer verdünnt sind, werden den Proben auf der Mikroskopstufe zugesetzt, und die fluoreszierende Markierung erfolgt dynamisch im Verlauf der Bildaufnahme. Während der Probenvorbereitungsphase wird keine fluoreszierende Markierung durchgeführt.

  1. Bereite adhärente Zellen vor, wie die U2OS-Zelllinie, wie in einem zuvor veröffentlichten Protokoll24 beschrieben.
  2. Zellsuspensionen
    1. Halten Sie Jurkat-T-Zellen bei einer Dichte von 1 x 105 bis 10 x 106 Zellen/mL in 10 ml vollständigem RPMI-Medium (RPMI 1640 ergänzt mit 10 % (v/v) fetalem Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator, der mit 5 % CO ergänztwird.
      HINWEIS: Die empfohlenen 10 mL vollständigen Medien gelten für T25-Kolben; Nutzer sollten das Volumen entsprechend skalieren, wenn sie verschiedene Kulturgefäße verwenden.
    2. Bereiten Sie die Glasoberfläche vor, indem Sie 200 μL 0,01 % Poly-L-Lysin (PLL)-Lösung zu den Bohrungen geben, die für die Verwendung in einem 8-Kammer-Deckglas vorgesehen sind. Über Nacht bei 4 °C oder 2 Stunden bei 37 °C inkubieren.
    3. Zählen Sie die Zellen aus der Kultur mit einem Hämozytometer und übertragen Sie dann 3,5 x 104 Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
      HINWEIS: Die Zellanzahl muss möglicherweise angepasst werden, um eine gute Verteilung einzelner Zellen zu erreichen. Ein Aussetzbereich von 30.000–60.000 Jurkat-T-Zellen erreicht eine ideale Dichte, bei der einzelne Zellen klar voneinander getrennt sind, ohne zu dünn verteilt zu sein. Die Zellzahl muss möglicherweise für einen neuen Zelltyp angepasst werden.
    4. Zentrifugiere mit 300 x g für 3 Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten. Entsorgen Sie das Supernatant und lassen Sie das Zellpellet in 200 μL vorgewärmtem (37 °C) 1x Dulbeccos Phosphatpuffersalzlösung (DPBS) wieder suspendieren. Das resultierende Zellpellet ist als kleine, weiße Ablagerung am Boden des Mikrozentrifugenrohrs sichtbar.
      HINWEIS: Entsorgen Sie biologisch gefährliche Abfälle gemäß den Richtlinien der Institution und allen geltenden lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften.
    5. Saugen Sie die PLL-Lösung aus dem vorbereiteten Kammerdeckglas ab (Schritt 1.2.2). Wenn die PLL-Inkubation über Nacht bei 4 °C stattfindet, wird das 8-Kammer-Deckglas auf 37 °C vorgeheizt, bevor die Lösung aspiriert wird.
    6. Fügen Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.2.4 hinzu. auf das PLL-beschichtete Kammerschacht. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C, ergänzt mit 5 %CO2 für 30 Minuten, damit die Zellen an der Oberfläche anhaften können. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich vor dem Plattieren und pipeten Sie auf und ab, um die Zellklumpen aufzulösen und eine gleichmäßige Verteilung im Brunnen sicherzustellen.
    7. Überprüfen Sie die Zellbefestigung an der Glasoberfläche mit einem Lichtmikroskop. Bei einer 10-fachen Vergrößerung fokussieren Sie das Mikroskop auf den Boden des Deckglases.
      HINWEIS: Ein sanftes Klopfen auf das Kammerdeckglas während der Betrachtung unter dem Mikroskop kann helfen, festzustellen, ob die Zellen an der Oberfläche angeheftet sind oder noch schwimmen.
    8. Bereiten Sie 200 μL des Fixationspuffers (4 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd in DPBS) vor und erwärmen Sie es in einem Wasserbad auf 37 °C vor.
      HINWEIS: Der bereitgestellte Fixationspuffer ist für CD81 optimiert und im Allgemeinen zur Konservierung von Membranproteinen geeignet. Für neue Membranprotein-Ziele muss die Pufferzusammensetzung möglicherweise angepasst werden, um eine optimale Erhaltung zu erreichen. Nutzer werden ermutigt, die Literatur nach Fixationsbedingungen zu konsultieren, die auf neue Ziele zugeschnitten sind.
      VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig und krebserregend. Glutaraldehyd ist giftig und korrosiv. Tragen Sie beim Umgang mit diesem Reagenz geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA). Bei Hautkontakt sollten Sie die betroffene Stelle sofort gründlich mit Seife und Wasser waschen. Entsorgen Sie das Reagenz gemäß den Richtlinien der Institution des Nutzers und allen geltenden lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften.
    9. Aspiratieren Sie das DPBS aus jedem Probenbohrloch (aus Schritt 1.2.6) mit einer Mikropipette.
      HINWEIS: Es ist entscheidend, alle Lösungsaustauschschritte langsam durchzuführen, um zu vermeiden, dass Zellen vom Deckglas gelöst werden. Entsorgen die biologisch gefährlichen Abfälle gemäß den Richtlinien der Einrichtung des Nutzers und allen geltenden lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften.
    10. Fügen Sie 200 μL vorgewärmten 37 °C Fixationspuffer in eine Ecke des Brunnens hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.
      VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig und krebserregend. Glutaraldehyd ist giftig und korrosiv. Tragen Sie beim Umgang mit diesen Reagenzien geeignete PSA. Bei Hautkontakt sollten Sie die betroffene Stelle sofort gründlich mit Seife und Wasser waschen. Entsorgen Sie das Reagenz gemäß den Richtlinien der Institution des Nutzers und allen geltenden lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften.
    11. Waschen Sie die fixierten Zellen dreimal mit 500 μL DPBS. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn Sie mit Schritt 1.2.12 fortfahren.
    12. Optional: Die Fixationslösung langsam entfernen und 200 μL frisch zubereitetes 0,1%iges Natriumborhydrid in DPBS hinzufügen, dann 7 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren. Überspringen Sie diesen Schritt und fahren Sie mit Schritt 1.2.14 weiter, wenn Sie keine Natriumborhydridreduktion verwenden.
      HINWEIS: Die Reduktion mit Natriumborhydrid hilft, die von Glutaraldehyd erzeugte Autofluoreszenz abzuschrecken und neutralisiert nicht reagierte Aldehyde. Die Freisetzung von Wasserstoffgas durch die Reaktion von Natriumborhydrid mit der wässrigen Lösung manifestiert sich als Freisetzung von Blasen. Wenn keine Freisetzung von Wasserstoffgas festgestellt wird, verwenden Sie eine frisch hergestellte Lösung aus Natriumborhydrid.
      VORSICHT: Natriumborhydrid ist giftig und korrosiv. Tragen Sie beim Umgang mit diesem Reagenz geeignete PSA. Bei Hautkontakt sollten Sie die betroffene Stelle sofort gründlich mit Seife und Wasser waschen. Entsorgen Sie das Reagenz gemäß den Richtlinien der Institution des Nutzers und allen geltenden lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften.
    13. Aspiratiere die Natriumborhydridlösung aus jedem Brunnen und wasche dann dreimal mit 500 μL DPBS.
    14. Bereiten Sie 200 μL des Blockpuffers vor und fügen Sie es dem Bohrloch hinzu. 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren. Verwenden Sie kein Permeabilisierungsreagenz (z. B. TritonX-100, Saponin), da es Membranproteine entfernen kann. Das hier für CD81 vorgestellte Membran-SAL-(mSAL)-Protokoll enthielt keinen Blockierungsschritt.
      HINWEIS: Ein Blockpuffer mit 5 % (w/v) Bovines Serumalbumin (BSA) in DPBS wird für mSAL mit neuen Zielen empfohlen. Bei Verwendung von sekundären Antikörpern wird das entsprechende Serum zur Blockierung verwendet. Zum Beispiel 10 % (v/v) Ziegenserum in DPBS bei Verwendung eines Ziegen-Wirt-Sekundärantikörpers. Wenn ein etabliertes Blockierungspuffer-Rezept und ein Protokoll für das Ziel existieren, können Nutzer diesem Protokoll folgen. Der Blockpuffer kann optional mit Isotyp-Kontrollantikörpern oder Serum-abgeleiteten Antikörpern ergänzt werden, um Off-Target-Bindungen von Antikörpernzu reduzieren 23,24. Fügen Sie ein Permeabilisierungsreagens nur dann in den Blockpuffer ein, wenn der Antikörper auf ein intrazelluläres Epitop des Membranproteins abzielt.
    15. Für mSAL mit farbstoffkonjugierten primären Antikörpern fahren Sie direkt mit Schritt 1.2.20 fort.
    16. Bereiten Sie 150 μL der primären Antikörperfärbungslösung vor (Antikörper in gewünschter Konzentration, verdünnt im Blockpuffer). Überspringen Sie diesen Schritt für mSAL mit farbstoffkonjugierten primären Antikörpern.
      HINWEIS: Für die primäre Antikörperfärbung konsultieren Sie das Datenblatt des Anbieters für empfohlene Bedingungen. Wenn keine Konzentrationsinformationen bereitgestellt werden, beginnen Sie mit 4 μg/mL (27 nM) für das vollständige IgG23,24.
    17. Ersetzen Sie den Blockierungspuffer durch die primäre Antikörperlösung. Inkubieren Sie bei Zimmertemperatur für 2 Stunden oder bei 4 °C über Nacht in einer feuchten Kammer. Überspringen Sie diesen Schritt für mSAL mit farbstoffkonjugierten primären Antikörpern.
    18. Waschen Sie die Probe zweimal mit 400 μL DPBS. Fügen Sie dem Brunnen 200 μL Blockpuffer hinzu.
    19. Optional: Ersetzen Sie den Blockpuffer durch 200 μL Postfixationspuffer (4 % Paraformaldehyd) und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die Nachfixierung hilft, die Probenblockierung für SAL23,24 zu erhalten. Dieser Schritt sollte jedoch weggelassen werden, wenn er die Epitope-Zugänglichkeit verringert. Um die Wirkung der Postfixation auf die Epitope-Erkennung durch Antikörper zu bewerten, führen Sie eine Standard-Immunfluoreszenzfärbung mit und ohne Postfixierung durch und vergleichen Sie die Färbungsqualität.
    20. Optional: Die Probe zweimal mit DPBS waschen.
    21. Fügen Sie 200 μL DPBS in jede Mulde hinzu und decken Sie die Kammer mit einer transparenten Folie ab, um Verdunstung zu verhindern. Proben können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden. Wenn mSAL unmittelbar nach Schritt 1.2.14 oder 1.2.19 ohne Nachfixierung durchgeführt wird, bewahren Sie die Probe im Blockpuffer und fahren Sie direkt mit Schritt 2.2 fort.
      HINWEIS: Die Aufbewahrung der Probe in DPBS, ergänzt mit 5 mM Natriumazid, verhindert das Bakterienwachstum während der Lagerung.
      VORSICHT: Natriumazid ist akut giftig und kann bei Einnahme tödlich sein. Tragen Sie beim Umgang mit diesem Reagenz geeignete PSA. Bei Hautkontakt sollten Sie die betroffene Stelle sofort gründlich mit Seife und Wasser waschen. Entsorgen Sie das Reagenz gemäß den Richtlinien der Institution des Nutzers und allen geltenden lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften.

2. Bildaufnahme

HINWEIS: Das Bildgebungsverfahren für Adhärent- und Suspensionszellen ist ähnlich und wird mit einer Total Internal Reflection Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie durchgeführt. Allerdings sollten die Bildgebungsbedingungen für jeden Zelltyp optimiert werden.

  1. Lassen Sie die gelagerten Proben (bei 4 °C) vor der Bildnahme auf Raumtemperatur kommen, um Kondensation am Glas zu verhindern. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn Sie direkt mit der Bildgebung nach der Probenvorbereitung beginnen.
  2. Strom auf das Mikroskopsystem: Mikroskop, sCMOS-Kamera, Lasereinheit und der Computer mit Bildaufnahmesoftware. Lassen Sie das Mikroskopsystem nach dem Einschalten 5–10 Minuten stabilisieren, damit die Systemkomponenten Betriebstemperaturen erreichen und thermische Driften minimieren.
    HINWEIS: mSAL kann mit jedem TIRF-Mikroskop-Setup und kompatibler Software durchgeführt werden. Schalten Sie das System gemäß den Anweisungen des Instruments ein.
  3. Trage Immersionsöl auf ein TIRF-Objektiv auf (z. B. 100x/1,49) auf und montiere das Kammerdeckglas auf der Mikroskopstufe.
    HINWEIS: Wenn das Objektiv mit einem Korrekturkragen ausgestattet ist, stellen Sie sicher, dass es auf die korrekte Dicke des Deckglases bei 23 °C eingestellt ist. Das in dieser Studie verwendete Deckglas hatte eine Dicke von 0,13–0,17 mm.
  4. Wenn ausgerüstet, aktivieren Sie das Perfect Focus System (PFS), heben Sie das Objektiv vorsichtig an das Deckglas und bringen Sie die Probe in den Fokus.
  5. Bereiten Sie Goldkolloide als Fiduzialmarker vor (1:2-Verdünnung in ultrareinem Wasser). Sonikieren Sie die Goldkolloide vor der Verdünnung für 3 Minuten, um die Aggregate zu verteilen.
  6. Saugen Sie den Speicherpuffer (DPBS oder Blockpuffer) vorsichtig aus dem Probenbrunnen ab und geben Sie 200 μL der Goldkolloidlösung zur Probe. Inkubiere 1 Minute und entferne die Lösung.
  7. Verwenden Sie Hellfeldbeleuchtung, um sicherzustellen, dass genügend Goldkolloide abgelagert wurden, bevor die Lösung aspiriert wird. Eine ideale Dichte besteht aus 5 bis 10 Goldkolloiden innerhalb des festgelegten Interessenbereichs (ROI).
    HINWEIS: Alternativ können fluoreszierende Mikrosphären (siehe Materialtabelle) mit einer Verdünnung von 1:1.000 in DPBS verwendet werden.
  8. Waschen Sie es einmal mit 500 μL ultrareinem Wasser, um überschüssige Goldkolloide zu entfernen, und fügen Sie dann 200 μL DPBS hinzu.
  9. In der Bildgebungssoftware wird die optische Konfiguration für das Fluorophor (der Antikörpersonde) erstellt, einschließlich der passenden Dichroik, der Laseranregungswellenlänge und Leistungsdichte, der Kamera-Integrationszeit, dem Emissionsfilter und der Kamerapixel-Binning (falls zutreffend). Eine Pixelgröße von 150–160 nm wird empfohlen, um eine optimale Auflösung zu erreichen.
  10. Erstellen Sie eine optische Konfiguration für einen Photobleaching-Schritt. Eine Laserleistung von 380 W/cm2 oder mehr mit einer Kamera-Integrationszeit von 1 s wird empfohlen.
    HINWEIS: Photobleaching während der Aufnahme hilft, Überlappungen zwischen einzelnen fluoreszierenden Antikörperbindungsereignissen zu minimieren. Das gesammelte Licht kann durch einen Emissionsfilter mit nicht passender Wellenlänge geleitet werden, um eine Kamerasättigung zu vermeiden.
  11. Stellen Sie den Laserwinkel an, um eine TIRF-Beleuchtung herzustellen. Mit Hellfeldbeleuchtung identifizieren Sie eine Zelle für mSAL. Stellen Sie sicher, dass mindestens 5 Goldkolloide innerhalb des ROI sichtbar sind, um Stufendrift während der Bildrekonstruktion zu korrigieren. Bestätigen Sie die Autofluoreszenz der Goldkolloide bei der Bildverarbeitungslaser-Leistungsdichte.
  12. Stellen Sie die Bildparameter ein: Nicht-Beleuchtungsintervall (NII), Anzahl der Bilder und die Häufigkeit des Photobleaching-Schritts (falls erforderlich) in der Bildaufnahmesoftware. Für mSAL von CD81 auf U2OS- und Jurkat-T-Zellen mit CD81-Antikörper waren die optimalen Einstellungen ein NII von 5 Sekunden, insgesamt 2.000 Frames und ein Photobleaching-Schritt alle 5. Frames.
    HINWEIS: Diese Parameter müssen für jedes interessierte Protein, den für mSAL verwendeten Antikörper und den Zelltyp optimiert werden. Weitere Details zur Optimierung finden Sie Schritt 3. Die optimale Anzahl der Frames kann je nach Antikörperziel und Zelltyp variieren. Für neue Zielsysteme wird empfohlen, 2.000–3.000 Bilder als Ausgangspunkt zu erfassen. NIIs verlängern die Dauer der Bildaufnahme. Zum Beispiel führt eine 3.000-Frame-mSAL-Erwerbung mit einem 20-S-NII zu ~17 Stunden Aufnahmezeit.
  13. Bereiten Sie den Bildpuffer vor, indem Sie den CD81-Antikörper auf eine Konzentration von 1 μg/mL in 200 μL mit 5 % BSA (w/v) in DPBS verdünnen. Für mSAL von CD81 betrug die endgültige Antikörperkonzentration 0,5 nM für Jurkat-T-Zellen und 2 nM für U2OS-Zellen.
    HINWEIS: Die Antikörperkonzentration hängt von der lokalen Substrathäufigkeit und der Affinität des Antikörpers ab. Es ist entscheidend, die Antikörperkonzentrationen für jedes Proteinziel, jeden für die Bildgebung verwendeten Antikörper und jeden Zelltyp zu optimieren. Weitere Details zur Optimierung finden Sie Schritt 3.1.
  14. Fügen Sie den vorbereiteten Bildpuffer in den Brunnen ein und beginnen Sie mit der Aufnahme.

3. Optimierung von Bildparametern

HINWEIS: mSAL-Bildgebende Parameter werden von der Proteinexpression, ihrer lokalen Organisation und der Wahl des für die Bildgebung verwendeten Antikörpers beeinflusst. Das Ziel der Optimierung der Bildgebungsparameter ist es, die Antikörperkonzentration und NII zu identifizieren, die räumlich aufgelöste Einzelmolekülereignisse erzeugen, während ausreichend hohe Dichten erhalten bleiben, um die Epitopprobenentnahme zu maximieren.

  1. Antikörperkonzentration
    1. Verdünne den Antikörper auf 0,5 nM für Jurkat-Zellen und 2 nM für U2OS-Zellen in 200 μL 5 % (w/v) BSA in DPBS und gib die Antikörperlösung in den Brunnen. Für die optimale Kennzeichnung von Einzel-Antikörpern verwenden Sie eine Antikörperkonzentration bei oder nahe ihrer Gleichgewichtsdissoziationskonstante (Kd); wenn Kd unbekannt ist, wird empfohlen, bei 1 nM zu beginnen.
    2. Verwenden Sie die Live-View-Funktion in der Bildgebungssoftware, die für mSAL konfiguriert ist, um die Antikörperbindung zu überwachen.
    3. Passen Sie den TIRF-Winkel und die Bildparameter an, um ein Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) von ≥ 3 zu erreichen.
      HINWEIS: Ein optimaler TIRF-Winkel verbessert das SNR, indem er die unscharfe Fluoreszenz durch diffundierende Antikörper im Bildpuffer begrenzt. Eine Laserleistungsdichte von 100–200 W/cm2 und eine Kamera-Integrationszeit von 50 ms können zu Beginn verwendet werden. Wenn der SNR niedrig ist, erhöhen Sie die Laserleistung und/oder die Kamera-Integrationszeit schrittweise und überwachen Sie die Änderungen am SNR, bis sie einen optimalen Wert erreicht.
    4. Konfigurieren Sie die Bildparameter in der Bildaufnahmesoftware so, dass mindestens eine 10-Bild-Aufnahme mit einem NII von 5 s erreicht wird (siehe Schritt 2.12).
      HINWEIS: Ein 5 s NII wird als Ausgangspunkt empfohlen. Ein NII-Scan sollte durchgeführt werden, um den optimalen NII für ein neues Antikörper-Zielsystem zu identifizieren (Schritt 3.2).
    5. Beginnen Sie mit der Übernahme. Bewerten Sie die Sparsamkeit der Einzelmolekül-Lokalisierungen des aufgenommenen Films.
      HINWEIS: Detaillierte Schritte zur Bestimmung der Lokalisierungsdichte sind in einer früheren Veröffentlichung24 beschrieben. Eine Einzelmolekül-Lokalisierungsdichte zwischen 0,02 und 0,15 Ereignissen/μm2 wurde als optimal für mSAL erwiesen.
    6. Wenn unmittelbar nach dem Hinzufügen des Bildgebungspuffers mehrere überlappende Antikörperbindungsereignisse beobachtet werden oder sich im Laufe der Zeit Einzelmoleküllokalisierungen im Verlauf der Aufzeichnung ansammeln, wird die Aufnahme abgebrochen. Reduziere die Antikörperkonzentration um das Zweifache und wiederhole die Aufnahme an einer neuen Probe. Wiederholen Sie diesen Vorgang, die Antikörperkonzentration um das Zweifache zu reduzieren und die Anzahl der Ereignisse pro Flächeneinheit neu zu bewerten, bis die gewünschte Dichte der Einzelmolekül-Lokalisationsereignisse erreicht ist.
      HINWEIS: Überlappende Ereignisse äußern sich als mehrere große Puncta, die bei der Bindung eines neuen Antikörpers innerhalb der Beugungsgrenze des ersten Antikörpers heller oder größer werden.
    7. Ist die Ereignisdichte gering, erhöhen Sie die Antikörperkonzentration im Bildpuffer um das Zweifache und wiederholen Sie die Aufnahme an einer neuen Probe. Wiederholen Sie diesen Vorgang, die Antikörperkonzentration um das Zweifache zu erhöhen und die Anzahl der Bindungsereignisse pro Flächeneinheit neu zu bewerten, bis die gewünschte Dichte der Einzelmoleküllokalisierung erreicht ist.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, für jede Konzentrationsoptimierungsprobe eine frische Probe zu verwenden, um potenzielle Interferenzen durch vorgebundene Antikörper bei nachfolgenden Bewertungen der Lokalisationsdichte zu vermeiden.
  2. NII-Optimierung
    1. Konfigurieren Sie die Bildparameter in der Bildaufnahmesoftware, um eine 50-Frame-Aufnahme zu erhalten (siehe Schritt 2.12). Setze den NII auf 0 (keine Verzögerung).
    2. Bereiten Sie den Bildpuffer auf die optimierte Antikörperkonzentration aus Schritt 3.1 vor und fügen Sie ihn dem Probenschacht hinzu. Beginnen Sie mit der Übernahme.
    3. Wiederhole die Schritte 3.2.1-3.2.2 und passe die NIIs auf 1, 3, 5, 10 oder 20 S an. Führen Sie jede Aufnahme an einer neuen Probe durch.
    4. Bewerten Sie die Dichte und Sparsamkeit einzelner Moleküllokalisierungen des aufgezeichneten Films (siehe Schritte 3.1.5-3.1.7). Der niedrigste NII mit der optimalen Dichte eines einzelnen Molekülereignisses wird als optimaler NII bestimmt.
      HINWEIS: Die Antikörperkonzentration muss möglicherweise weiter optimiert werden, um eine optimale Einzelmolekül-Lokalisierungsdichte für das entsprechende NII zu erreichen. Siehe Schritt 3.1. Frühere Berichte zeigen, dass längere NIIs (10–20 s) selektiver gegenüber höherdichten Bindungsereignissen waren, aber die Verlängerung des NII über 20 s hinaus keine weitere Verbesserungbrachte. Wenn räumlich überlappende Bindungsereignisse im Verlauf der Bildaufnahme auftreten, wird ein Photobleaching-Schritt in ausreichenden Abständen eingeführt, um Fluoreszenz aus gebundenen Antikörpern zu entfernen. Wenn zum Beispiel überlappende Ereignisse bereits im fünften Bild auftreten, wenden Sie Photobleaching alle fünfte Bilder an. Das Auftreten räumlich überlappender Ereignisse wird in der Notiz von Schritt 3.1.6 beschrieben.

4. Datenanalyse

HINWEIS: Die mSAL-Bildrekonstruktion verwendet die kostenlose NIH-Software Fiji29 mit dem ThunderSTORM30-Plugin . Fiji Version v1.54r und ThunderSTORM Version 1.3 wurden in diesem Protokoll verwendet. Eine detaillierte Bildanalyse wurde in einem früheren Protokoll 24 beschrieben. In diesem Abschnitt skizzieren wir den Analyse-Workflow, der speziell für mSAL verwendet wird. Die in diesem Protokoll präsentierte Analyse verwendete eine Prime95B sCMOS-Kamera (Seriennummer A18B203004) mit Photoelektronen pro A/D von 0,98 und einem Kamerabasisniveau von 100. Die Bildpixelgröße ist auf 147 nm gesetzt.

  1. Setzen Sie die Parameter für die Rekonstruktion im Fenster Analysieren ausführen. Die für CD81 mSAL-Bildrekonstruktionen verwendeten Parameter werden unten beschrieben. Die Vorschaufunktion sollte verwendet werden, um die detektierten Einzelmolekül-Bindungsereignisse im ausgewählten Rahmen zu bewerten, bevor die vollständige Analyse durchgeführt wird.
    Bildfilterung:
    Filter: Wavelet-Filter (B-Spline)
    B-Spline-Reihenfolge: 2
    B-Spline-Skala: 4
    Ungefähre Lokalisierung von Molekülen:
    Methode: Lokales Maximum
    Schwelle für maximale Intensität: std(Welle.F1)
    Anbindung: 8-Viertel
    Subpixel-Lokalisierung von Molekülen:
    Methode: PSF: Integriertes Gauß
    Anpassungsradius [px]: 2
    Fitting-Methode: Maximum Likelihood
    Anfängliches Sigma [px]: 0,75
    Multi-Emitter-Fitting-Analyse: nicht ausgewählt
    Visualisierung der Ergebnisse:
    Methode: Normalisierter Gaußscher
    Vergrößerung: 7,3
    Aktualisierungsfrequenz [Frames]: 50
    Seitliche Unsicherheit: 20
    HINWEIS: Die Vorfilterparameter werden verwendet, um die Erkennung von Einzel-Emittern im Hintergrund zu verbessern. Sie dienen als Ausgangspunkte, sollten aber für jeden Datensatz optimiert werden. Die approximativen Lokalisierungs- und Detektionsmethoden werden für Einzelmolekül-Bindungsereignisse verwendet. Die Verwendung lokaler Intensitätsmaxima mit 8-Nachbarschafts-Konnektivität liefert eine zuverlässige Leistung31. Die integrierte Gaußsche Methode mit Maximum-Likelihood-Fitting wurde gewählt, da sie weit verbreitet ist und eine zuverlässige Annäherung der Punktstreuungsfunktion (PSF) in Einzelmolekülbildgebungsanwendungenliefert 32,33,34,35. Die in diesem Protokoll verwendete Visualisierungsmethode ist Normalisierter Gauß. Nutzer können die Visualisierungsmethode wählen, die am besten zu ihren Daten passt. Die Vergrößerung wurde so eingestellt, dass sie eine rekonstruierte Pixelgröße von 20 nm ergibt, was für die erwartete Lokalisierungspräzision mit antikörperbasierter Markierung angemessen ist, bei der der Verknüpfungsfehler etwa ~10 nm liegt. Der Vergrößerungsfaktor von 7,3 wurde berechnet, indem die beugungsbegrenzte Pixelgröße durch die gewünschte rekonstruierte Pixelgröße geteilt wurde (147 nm / 20 nm = 7,3). Die Aktualisierungshäufigkeit bestimmt, wie oft das rekonstruierte Bild während der Verarbeitung aktualisiert wird, hat aber keinen Einfluss auf das Endergebnis. Die laterale Unsicherheit ist auf 20 gesetzt (aber nicht erzwungen), sodass die Rekonstruktion die berechneten Lokalisierungsunsicherheiten einbezieht. Weitere Details zu verfügbaren Optionen finden Sie im ThunderSTORM User Guide30 oder klicken Sie auf das Fragezeichen neben dem Eingabefeld.
  2. Beginnen Sie die ThunderSTORM-Analyse mit einem anfänglichen Sigma von 1,6 Pixeln und einem passenden Radius von 3. Verfeinere die Parameter bei Bedarf. Multi-Emitter-Fitting wurde nicht verwendet, da die Ereignisdichten in den beugungsbegrenzten Bildern nicht überlappend blieben.
  3. Klicken Sie auf Ok, um die Rekonstruktion durchzuführen. Nach Abschluss öffnet sich das Ergebnisfenster automatisch.
  4. Verwenden Sie die Funktion Diagramm-Histogramm , um das Peak-Sigma zu finden. Konvertiere diesen Wert (nm) in Pixel, indem du durch die Pixelgröße der Rohdaten teilst, und führe dann die ThunderSTORM-Analyse erneut durch, indem du den neuen Wert für das Anfangs-Sigma und den Anpassungsradius auf eine ganze Zahl nahe dem 3-fachen Anfangs-Sigma30 setze.
  5. Bestimmen Sie die Driftkorrektur mit dem gewählten fiduzialen Marker24.
  6. Führen Sie eine Bildrekonstruktion über das gesamte Sichtfeld durch und wenden Sie die berechnete Driftkorrektur an.
  7. Zur Nachbearbeitung des Bildes klicken Sie auf den Reiter Filter im Ergebnisfenster. Wenden Sie Filter an, um schlecht lokalisierte Ereignisse zu entfernen. In den angezeigten Ergebnissen für CD81 wurden Ereignisse mit Sigma größer als 200 nm und Unsicherheit über 20 nm entfernt. Verwenden Sie die Plot-Histogramm-Funktion, um die Sigma-Verteilung zu untersuchen und einen geeigneten Cutoff zu bestimmen.
    HINWEIS: Einzelmolekül-Lokalisierungen mit hohen Sigma-Werten entstehen typischerweise durch schwache Fluorophore mit niedrigen Photonenzahlen oder durch sich überlappende Emitter. Lokalisierungen mit einer Unsicherheit von mehr als 20 nm wurden ebenfalls entfernt, da eine Unsicherheit, die die Endpixelgröße übersteigt, auf eine schlechte Lokalisierungsgenauigkeit hinweist. Weitere Hinweise zu Filterparametern finden Sie im ThunderSTORM User Guide30.
  8. Speichern Sie die Ergebnistabelle mit Einzelmolekül-Lokalisierungsdaten für nachgelagerte Analysen, indem Sie Export auswählen. Die exportierte Datei befindet sich in .csv Dateiformat und wird in diesem Protokoll als mSAL.csv bezeichnet. Speichere das resultierende Normalisierte Gaußsche Bild.

5. Clusteranalyse

HINWEIS: Während des Epitopen-Probings interagieren Antikörper mit ihren beabsichtigten Zielen (spezifischen Interaktionen) sowie mit Off-Target-Molekülen (unspezifische Interaktionen). Da mSAL auf der kumulativen Detektion einzelner Antikörper-Antigen-Bindungsereignisse basiert, tragen einige unspezifische Interaktionen zwangsläufig zum rekonstruierten Bild bei. Antikörper-Epitope-Interaktionen zeigen unterschiedliche kinetische Fingerabdrücke, die prinzipiell spezifische von nicht-spezifische Bindungen unterscheiden können, wobei spezifische und unspezifische Ereignisse durch ihre lokalen Wechselwirkungsdichten unterschieden werden, anstatt durch einzelne Molekül-Verweilzeiten mal36. Hier wird eine dichtebasierte räumliche Clustering von Anwendungen mit Rauschen (DBSCAN)37-Analyse beschrieben, um Ereignisse mit niedriger Dichte zu entfernen und dabei hochdichte Ereignisse zu behalten, die eher eine spezifische Antikörperbindung widerspiegeln. Darüber hinaus kann dichtebasierte Clusterbildung auch quantitative Einblicke in die nanoskalige räumliche Organisation von Proteinen liefern, insbesondere solche, die sich natürlich in Cluster organisieren, wie CD81 in tetraspaninangereicherte Mikrodomänen 38,39,40,41,42. Die bereitgestellte DBSCAN-Analyse wurde mit MATLAB 2025a durchgeführt. Für Nutzer ohne Zugang zu MATLAB wird empfohlen, ähnliche DBSCAN-Analysen mit Open-Source-Alternativen wie Python oder R 43,44,45 durchzuführen. Der in diesem Protokoll verwendete Code kann gewonnen werden: https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. Ausführung des Codes
    1. Laden Sie die MATLAB-Datei vom oben genannten GitHub-Link herunter.
    2. Starte MATLAB und öffne den Code. Auf den Zeilen 37 und 38 wird die Mindestanzahl der Punkte (minPTS) und Epsilon für die Clustering-Parameter festgelegt. Folgende Parameter wurden verwendet:
      Jurkat-T-Zellen:
      minPTS: 7
      Epsilon: 60
      U2OS-Zellen:
      minPTS: 7
      Epsilon: 80
      HINWEIS: Siehe Schritt 5.2 für weitere Details zur Optimierung dieser Parameter.
    3. Setze den Dateipfad in der MATLAB-Software auf den Ordner, der die rekonstruierte mSAL.csv Datei enthält.
    4. Führe den Code aus, indem du auf Ausführen klickst. Der Code fordert den Benutzer auf, eine Datei auszuwählen. Wählen Sie die mSAL.csv-Datei und klicken Sie auf Öffnen.
    5. Die clusterten Daten werden automatisch in dem Ordner namens MATLAB Data im im Code vorgesehenen Dateipfad gespeichert. Öffnen Sie diese Datei in ThunderSTORM, indem Sie auf Plugins > ThunderSTORM klicken > Ergebnisse importieren/exportieren > importieren.
    6. Speichere das resultierende Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopiebild.
  2. Optimierung der Clustering-Eingaben
    HINWEIS: Die beiden Eingabeparameter für den DBSCAN-Algorithmus sind minPTS und Epsilon. Epsilon definiert den Radius um einen Punkt, um dessen Umgebung zu bestimmen, während minPTS die minimale Anzahl von Punkten innerhalb dieser Umgebung angibt, die erforderlich ist, um eine dichte Region zu bilden. Punkte, die diese Dichteanforderung erfüllen, werden als Kernpunkte klassifiziert, und ihre Nachbarschaften werden rekursiv dem Cluster hinzugefügt. Punkte, die die Dichteanforderung nicht erfüllen, aber in der Umgebung eines Kernpunktes liegen, werden als Grenzpunkte bezeichnet, während alle übrigen Punkte als Rauschpunkte gelten.
    1. Führe die Analyse mit den oben beschriebenen Eingaben (Schritt 5.1.2) als Ausgangspunkt durch. Wählen Sie einen minPTS-Wert, der höher ist als die Anzahl der Rauschlokalisierungen, aber niedriger als die Anzahl der Lokalisierungen auf der Zelle. Nach Auswahl von minPTS wird Epsilon so angepasst, dass diese Anzahl der Lokalisierungen innerhalb des Nachbarschaftsradius für repräsentative On-Cell-Regionen erfasst werden kann.
      HINWEIS: minPTS und Epsilon können unabhängig voneinander angepasst werden. Ein praktischer Ansatz zur Auswahl dieser Parameter besteht darin, zunächst das Streudiagramm der Rauschpunkte außerhalb der Zelle zu untersuchen und sie mit der Anzahl der Lokalisationen innerhalb ähnlich großer Bereiche der Zelle zu vergleichen.
    2. Bewerten Sie das Fenster mit Abbildung 2 , das die geclusterten Daten darstellt. Wenn die Daten Cluster auf der Zelle mit dem erwarteten Phänotyp und minimierten Lokalisierungen außerhalb der Zelle behalten, sind die Clustering-Eingaben ausreichend.
      HINWEIS: Die geclusterten Daten sollten die Struktur der mit mSAL erworbenen Daten beibehalten. Wenn die Cluster klein erscheinen, nur auf die sehr hochdichten Regionen der ursprünglichen Daten beschränkt und eine signifikante Anzahl von Bindungsereignissen ausschließen, die mit dem erwarteten Phänotyp korrelieren, könnten die Clustering-Parameter zu restriktiv sein. Wenn die unspezifische Bindung außerhalb der Zelle bei großen Clustern nicht ausreichend reduziert ist, können die Clustering-Parameter zu inklusiv sein.
    3. Wenn die Clustering-Parameter zu restriktiv sind, senken Sie das MinPTS und erhöhen Sie das Epsilon, um mehr Punkte in die geclusterten Daten einzuschließen. Wenn die Clustering-Parameter zu umfassend sind, erhöhen Sie das MinPTS und verringern Sie das Epsilon.
    4. Nachdem du die MinPTS und Epsilon angepasst hast, führe den Code erneut aus. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.2-5.2.3, bis die optimale Clusterbildung erreicht ist.

6. Validierung der Antikörperbindung an sein Ziel

HINWEIS: Bei Membranproteinen ohne klar definierte Morphologie kann die Validierung der Genauigkeit der aufgelösten Strukturen schwierig sein. Um die Spezifität der Antikörper zu validieren, können Nutzer eine fluoreszierende Proteinfusion (FP) des Zielproteins exprimieren. Als erste Überprüfung kann eine konventionelle Immunfluoreszenzfärbung an Zellen durchgeführt werden, die die FP-Fusion exprimieren. Für eine präzisere Validierung bei der Bewertung neuer Antikörper kann mSAL an den FP-exprimierenden Zellen durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass lokale Bindungsereignisse mit dem fluoreszenz-markierten Ziel übereinstimmen. Hier wird ein Protokoll zur Transfektion von U2OS-Zellen mit CD81-mStayGold als Beispiel beschrieben, das bestätigt, dass CD81-mSAL-Lokalisierungen mit dem FP-markierten CD81 auf der Zelloberfläche korrespondieren. Benutzer können jedes geeignete fluoreszierende Protein ersetzen, sofern seine Emission nicht mit dem Fluoreszenzkanal des zu validierenden Antikörpers überlappt.

  1. Säen Sie U2OS-Zellen in einem 8-Wellen-Kammer-Slide und wachsen Sie auf ~70 % Konfluenz. Erhaltung der Zellen in 200 μL vollständigem Wachstumsmedium (DMEM ergänzt mit 10 % (v/v) fetalem Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin).
  2. Kombinieren Sie 100 ng des DNA-Konstrukts, das das Protein codiert, mit einem fluoreszierenden Reporter mit 5 μL Lipofectamin 2000. Vortex 30 Sekunden lang und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Diese Studie verwendete CD81 mit mStayGold fusioniert. Standard-molekulare Klontechniken wurden zur Erzeugung von DNA-Plasmiden eingesetzt, obwohl diese in diesem Protokoll nicht beschrieben sind. Die DNA: Die bereitgestellten Lipofektamin-Verhältnisse sind für Zellen optimiert, die in 8-Well-Kammer-Objektträgern eingesät werden und müssen möglicherweise entsprechend den Anweisungen des Herstellers für andere Probenformate angepasst werden.
  3. Gib 5 μL DNA/Lipofektamin-Lösung zu den Zellen. Inkubieren Sie den Kammer-Schlitten 4 Stunden bei 37 °C, ergänzt mit 5 % CO2in feuchter Umgebung.
  4. Ersetzen Sie die Medien durch vorgewärmte Vollwachstumsmedien. Inkubieren Sie > 8 Stunden bei 37 °C, ergänzt mit 5 % CO2in einer feuchten Umgebung, um nachweisbare Proteinexpressionsniveaus zu ermöglichen.
  5. Bewerten Sie die Fluoreszenz-Expressionswerte der Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Bildgeber. Eine Transfektionseffizienz von ≥ 30 % wird empfohlen. Wenn die Fluoreszenz-Expressionswerte suboptimal sind, optimieren Sie das DNA-Lipofectamin-Verhältnis gemäß den Richtlinien des Herstellers.
    HINWEIS: Vorübergehend exprimierende Zellen sollten innerhalb von 24–48 Stunden nach der Transfektion zur Antikörpervalidierung verwendet werden.
  6. Um die Zellen zu beheben, folgen Sie bitte den Schritten 1.2.8-1.2.13.
  7. Bewahren Sie die festen Proben in 200 μL DPBS mit 5 mM Natriumazid auf, bis sie für die Bildgebung bereit sind. Proben können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.
    VORSICHT: Natriumazid ist akut giftig und kann bei Einnahme tödlich sein. Tragen Sie beim Umgang mit diesem Reagenz geeignete PSA. Bei Hautkontakt sollten Sie die betroffene Stelle sofort gründlich mit Seife und Wasser waschen. Entsorgen Sie das Reagenz gemäß den Richtlinien der Institution des Nutzers und allen geltenden lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften.
  8. Befolgen Sie die Schritte 2.1-2.12, um das Mikroskop einzurichten und die Probe zu montieren. Identifizieren Sie eine Zelle, die das Protein von Interesse ausdrückt, anhand des Fluoreszenzsignals.
  9. Zur Orientierung: Machen Sie ein TIRF-Bild der Zelle. Wenn ein fluoreszierendes Protein im selben Bildungskanal wie der mSAL-Antikörper verwendet wird, wird das fluoreszierende Protein gebleicht. Um das Protein zu photobleichen, nutzen Sie die maximale Laserleistung für > 10 Minuten, bis kein Signal mehr beobachtet wird.
  10. Fügen Sie den vorbereiteten Bildpuffer in die Bohrung ein und beginnen Sie mit der Bildgebung. Die Analyse sollte wie zuvor beschrieben abgeschlossen werden (Schritt 4).
  11. Öffnen Sie sowohl das rekonstruierte Bild als auch das TIRF-Bild des fluoreszierenden Proteins, das vor der mSAL-Aufnahme aufgenommen wurde. Beurteile die Bindungsorte von mSAL-Antikörpern durch Vergleich des Aussehens und der Lokalisationen des exprimierten Proteins, das im beugungsbegrenzten TIRF-Bild dargestellt ist, mit dem mSAL-Bild.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die in diesem Protokoll beschriebene mSAL-Technik ermöglicht die Visualisierung einzelner Antikörperbindungsereignisse an die entsprechenden Plasmamembranprotein-Ziele und erzeugt so eine Superauflösungskarte der Membranproteinverteilung. CD81 wird hier als repräsentatives Beispiel verwendet, wobei der Ansatz jedoch leicht an andere Membranproteine anpassbar ist.

Die Immobilisierung von Jurkat-T-Zellen mit ausreichendem Abstand zwischen den Zellen gewährleiste...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die Organisation der Plasmamembranproteine spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Zellfunktion. Konventionelle Fluoreszenzmikroskopietechniken sind durch die Beugungsgrenze des Lichts begrenzt, wodurch ihre nanoskalige Organisation verschleiert wird. SMLM überwindet diese Einschränkung, indem es räumliche Auflösungen von 10–20 nm47 erreicht, was die Charakterisierung ihrer nanoskaligen Baugruppen 10,48,49 ermöglicht.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Alle Autoren geben an, dass sie keine Interessenkonflikte offenzulegen haben.

Danksagungen

Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter Award Number R35GM146786 und vom College of Liberal Arts and Sciences der University of Illinois Chicago unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht notwendigerweise die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
anti-CD81 Alexa Fluor 488 AntikörperThermo Fisher ScientificMA5-44132Bildgebende Antikörper
TischzentrifugeEppendorf5424
RinderserumalbuminMilliporeSigmaA7906-100G
Kammer-Deckglas, 8-SchachtCellvisC8-1-N
DMEM MediaThermo Fisher Scientific11960069
Dulbeccos phosphatgepufferte KochsalzlösungThermo Fisher Scientific14190-144
Fetales RinderserumMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldehyd, 10 %Elektronenmikroskopiewissenschaften16120
Goldkolloide, 100 nmTed Pella15711 & minus; 20Treuhänder
Immersionsöl Cargille Laboratories16245
Invertiertes Mikroskop  ausgestattet mit einem TIRF-ModulNikon InstrumentsEclipse Ti2-EMikroskop
Jurkat E6.1 ZelllinieMilliporeSigma88042803-1VLSuspensionszellen
Laserstart, 6 LinienOxxiusL6CC-CS8-1511Anregungslaser
Lipofectamin 2000Thermo Fisher Scientific11668019Transfektionsreagenz
Mikrozentrifugenröhre, 1,5 mL&nbl;VWR89000-028
Mikroskopie-BildgebungssoftwareNikon InstrumentsNIS-Elements Fortgeschrittene ForschungBildakquisitionssoftware
Ziel, 100x/1,49 CFI APO TIRF Nikon InstrumentsMRD01991Mikroskopobjektiv
Paraformaldehyd, 16 %Elektronenmikroskopiewissenschaften15710
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140-122Antibiotika
Poly-L-Lysin-Lösung, 0,01% MilliporeSigmaP4707-50ML
Prime 95B sCMOS-KameraTeledyne Vision Solutions01-PRIME-95B-R-M-16-CKamera
RPMI 1640-MedienThermo Fisher Scientific11875-093Medien für Suspensionszellen
NatriumazidThermo Fisher Scientific19038-1000
NatriumborhydridMilliporeSigma213462-25G
T25-KulturkolbenThermo Fisher Scientific169900
TetraSpeck-MikrosphärenTreuhänder
Gewebekulturschale, 100 mm & nbspoon;Corning353003
U2OS-ZelllinieATCCHTB-96Adhärente Zellen

Referenzen

  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulation of membrane protein structure and function by their paralipidomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (2), 107(2022).
  3. Stephens, A. D., Wilkinson, T. Discovery of Therapeutic Antibodies Targeting Complex Multi-Spanning Membrane Proteins. Biodrugs. 38 (6), 769(2024).
  4. Chan, A. C., Martyn, G. D., Carter, P. J. Fifty years of monoclonals: the past, present and future of antibody therapeutics. Nat Rev Immunol. 25, 745-765 (2025).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  7. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  8. Tobin, S. J., et al. Single molecule localization microscopy coupled with touch preparation for the quantification of trastuzumab-bound HER2. Sci Rep. 8 (1), 15154(2018).
  9. Wakefield, D. L., et al. Using quantitative single molecule localization microscopy to optimize multivalent HER2-targeting ligands. Front Med. 10, 1064242(2023).
  10. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  11. Lillemeier, B. F., et al. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11 (1), 90-96 (2010).
  12. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  13. Rossboth, B., et al. TCRs are randomly distributed on the plasma membrane of resting antigen-experienced T cells. Nat Immunol. 19 (8), 821-827 (2018).
  14. Civita, S., et al. Nanoscale engagement of programmed death ligand 1 (PD-L1) in membrane lipid raft domains of cancer cells. FEBS J. 292 (22), 5979-5997 (2025).
  15. Lee, J., Sengupta, P., Brzostowski, J., Lippincott-Schwartz, J., Pierce, S. K. The nanoscale spatial organization of B-cell receptors on immunoglobulin M- and G-expressing human B-cells. Mol Biol Cell. 28 (4), 511(2017).
  16. Ferapontov, A., et al. Antigen footprint governs activation of the B cell receptor. Nat Commun. 14 (1), 976(2023).
  17. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  18. Nerreter, T., et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun. 10 (1), 3137(2019).
  19. Slaga, D., et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3. Sci Transl Med. 10 (463), eaat5775(2018).
  20. Haber, L., et al. Generation of T-cell-redirecting bispecific antibodies with differentiated profiles of cytokine release and biodistribution by CD3 affinity tuning. Sci Rep. 11 (1), 14397(2021).
  21. Abdelmotaleb, O., Schneider, A., Gassner, C., Märsch, S., Klein, C. The impact of CD3 affinity-attenuation on T cell engaging bispecific antibodies: is it really that simple. Expert Opin Drug Discov. 20 (8), 943-949 (2025).
  22. Dang, K., et al. Attenuating CD3 affinity in a PSMAxCD3 bispecific antibody enables killing of prostate tumor cells with reduced cytokine release. J Immunother Cancer. 9 (6), e002488(2021).
  23. Gunasekara, H., et al. Superresolution Imaging with Single-Antibody Labeling. Bioconjugate Chem. 34 (5), 825-833 (2023).
  24. Perera, T., Gunasekara, H., Hu, Y. S. Single-Molecule Localization Microscopy Using Time-Lapse Imaging of Single-Antibody Labeling. Curr Protoc. 3 (10), e908(2023).
  25. Küppers, R. CD81 as target for B cell lymphomas. J Exp Med. 216 (7), 1469-1470 (2019).
  26. Vences-Catalán, F., et al. CD81 is a novel immunotherapeutic target for B cell lymphoma. J Exp Med. 216 (7), 1497-1508 (2019).
  27. Vences-Catalán, F., et al. Targeting the tetraspanin CD81 reduces cancer invasion and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (24), e2018961118(2021).
  28. Bailly, C., Thuru, X. Targeting of Tetraspanin CD81 with Monoclonal Antibodies and Small Molecules to Combat Cancers and Viral Diseases. Cancers. 15 (7), 2186(2023).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  31. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. Image analysis for single-molecule localization microscopy. In: Super-Resolution Imaging in Biomedicine. , 79-94 (2016).
  32. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  33. Stallinga, S., Rieger, B. Accuracy of the Gaussian point spread function model in 2D localization microscopy. Opt Express. 18 (24), 24461-24476 (2010).
  34. Huang, F., Schwartz, S. L., Byars, J. M., Lidke, K. A. Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging. Biomed Opt Express. 2 (5), 1377-1393 (2011).
  35. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nat Methods. 7 (5), 373-375 (2010).
  36. Chatterjee, T., et al. Direct Kinetic Fingerprinting and Digital Counting of Single Protein Molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (37), 22815-22822 (2020).
  37. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Int Conf Knowledge Disc Data Mining, 240, 226-231 (1996).
  38. Termini, C. M., Gillette, J. M. Tetraspanins Function as Regulators of Cellular Signaling. Front Cell Dev Biol. 5, 242379(2017).
  39. Levy, S., Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology. 20, 218-224 (2005).
  40. Rubinstein, E., et al. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol. 26 (11), 2657-2665 (1996).
  41. Schmidt, S. C., Massenberg, A., Homsi, Y., Sons, D., Lang, T. Microscopic clusters feature the composition of biochemical tetraspanin-assemblies and constitute building-blocks of tetraspanin enriched domains. Sci Rep. 14 (1), 2093(2024).
  42. Zuidscherwoude, M., et al. The tetraspanin web revisited by super-resolution microscopy. Sci Rep. 5, 12201(2015).
  43. Comparative performance analysis of K-means and DBSCAN clustering algorithms on various platforms. Shahriar, N., Akib Al Faisal, S. M., Pinjor, M. M., Sharif Zobayer Rafi, M. A., Rahman Sarkar, A. Proceedings of the 22nd International Conference on Computer and Information Technology (ICCIT), , 1-6 (2019).
  44. Hahsler, M., Piekenbrock, M., Doran, D. dbscan: Fast Density-Based Clustering with R. J Stat Softw. 91 (1), 1-30 (2019).
  45. Pedregosa, F., et al. Machine Learning with PyTorch and Scikit-Learn: Develop machine learning and deep learning models with Python. J Mach Learn Res. 12, 2825-2830 (2011).
  46. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci Rep. 1, 28(2011).
  47. Bond, C., Santiago-Ruiz, A. N., Tang, Q., Lakadamyali, M. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82 (2), 315-332 (2022).
  48. Garcia-Parajo, M. F., Cambi, A., Torreno-Pina, J. A., Thompson, N., Jacobson, K. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization. J Cell Sci. 127 (23), 4995-5005 (2014).
  49. Tan, H. L., Bungert-Plümke, S., Kortzak, D., Fahlke, C., Stölting, G. Determination of oligomeric states of proteins via dual-color colocalization with single molecule localization microscopy. eLife. 11, e76631(2022).
  50. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  51. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  52. Shivanandan, A., Deschout, H., Scarselli, M., Radenovic, A. Challenges in quantitative single molecule localization microscopy. FEBS Lett. 588 (19), 3595-3602 (2014).
  53. Endesfelder, U., Heilemann, M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images. Nat Methods. 11 (3), 235-238 (2014).
  54. Lambert, T. J., Waters, J. C. Navigating challenges in the application of superresolution microscopy. J Cell Biol. 216 (1), 53-63 (2017).
  55. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Quantitative photo activated localization microscopy: unraveling the effects of photoblinking. PloS One. 6 (7), e22678(2011).
  56. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  57. Unterauer, E. M., Jungmann, R. Quantitative Imaging With DNA-PAINT for Applications in Synaptic Neuroscience. Front Synaptic Neurosci. 13, 798267(2021).
  58. Stein, J., Stehr, F., Jungmann, R., Schwille, P. Calibration-free counting of low molecular copy numbers in single DNA-PAINT localization clusters. Biophys Rep. 1 (2), 100032(2021).
  59. Youn, Y., et al. Quantitative DNA-PAINT imaging of AMPA receptors in live neurons. Cell Rep Methods. 3 (2), 100408(2023).
  60. Yin, H., Flynn, A. D. Drugging Membrane Protein Interactions. Annu Rev Biomed Eng. 18, 51-76 (2016).
  61. Jin, S., et al. Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 39(2022).
  62. To'a Salazar, G., Huang, Z., Zhang, N., Zhang, X. -G., An, Z. Antibody therapies targeting complex membrane proteins. Engineering. 7 (11), 1541-1551 (2021).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

PlasmamembranSuper-Resolution-MikroskopieCD81-Proteindichteabhängiges ClusteringAntikörperbindungDriftkorrekturtherapeutische Antikörper
Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.