Herstellung von Speicheldrüsenorganoiden aus menschlichen kleinen Speicheldrüsen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll erzeugt menschliche Organoide der kleinen Speicheldrüse durch die Selbstorganisation menschlicher Stammzellen der kleinen Speicheldrüse (hMSG-SCs) und der mesenchymalen Stammzellen der menschlichen kleinen Speicheldrüsen (hMSG-MSCs) innerhalb eines 3D-Matrigelsystems.

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Konstruktion menschlicher Organoide der kleinen Speicheldrüse (hMSG), um ein reproduzierbares Modell für die Forschung zur Geweberegeneration zu etablieren. Speicheldrüsenstamm-/Vorläuferzellen (hMSG-SCs) und mesenchymale Stammzellen (hMSG-MSCs) wurden aus pädiatrischen kleinen Speicheldrüsengeweben isoliert, erweitert und gemeinsam in einem matrigelbasierten dreidimensionalen (3D) System ausgesät. Die Selbstorganisation führte zur Bildung von Organoiden mit ductal-acinarähnlichen Strukturen, wodurch die native zelluläre Heterogenität effektiver repapituliert wurde als reine epitheliale Modelle. Das aktuelle Protokoll legt Wert auf optimierte Kulturbedingungen zur Erhaltung von Zellphänotypen und standardisierte Schritte zum Durchführen, Verhältnismischung und Handhabung von Matrigel (einer kommerziellen Kellermatrix), wodurch die Reproduzierbarkeit verbessert wird. Wichtig ist, dass das Vorhandensein von mesenchymalen Zellen eine unterstützende Mikroumgebung bietet, die das Überleben, die Proliferation und die Morphogenese im Epithel fördert und damit die Einschränkungen geringer Effizienz und unvollständiger Struktur überwindet. Dieser Ansatz ermöglicht eine konsistente Bildung von Speicheldrüsenorganoiden und bietet ein robustes Modell zur Untersuchung von Entwicklung, funktioneller Wiederherstellung und Krankheitsmechanismen, während er zudem potenzielle translationale Anwendungen in regenerativen Therapien unterstützt.

Einleitung

Speicheldrüsen sind essentielle exokrine Drüsen in der Mundhöhle, die für die Speichelabscheidung verantwortlich sind, um die Mundfeuchtigkeit zu erhalten, die Verdauung zu unterstützen und antimikrobielle Abwehr zu^bieten. Eine Funktionsstörung dieser Drüsen, wie etwa beim Sjögren-Syndrom oder nach der Bestrahlung, kann zu schweren Mundgesundheitsproblemen führen, und wirksame regenerative Behandlungen fehlen derzeit². Die Organoidtechnologie, eine aufkommende Methode zur Herstellung von Zellersatzprodukten, die die Struktur und Funktion von Geweben und Organen in einem dreidimensionalen (3D-)Kultursystem nachahmen, bietet ein vielversprechendes Werkzeug^{für die Forschung} zur Regeneration der Speicheldrüsen.

In den letzten Jahren wurden Organoidkultursysteme von Maus- und menschlichen Speicheldrüsen erfolgreich^{etabliert 4,5}. Verschiedene Stammzelltypen, darunter Speicheldrüsenstamm-/Vorläuferzellen ^4,5, pluripotente^{Stammzellen 6,7} und epithelial abgeleitete Stammzellen wie dentale Follikelstammzellen⁸, wurden zur Bildung dieser Organoide verwendet. Dennoch bleiben mehrere technische Herausforderungen bestehen. Primäre menschliche Speicheldrüseepithelzellen (hSG-epiS/PCs) zeigen eine begrenzte Proliferation und ein geringes Überleben in vitro, was die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Organoidbildung einschränkt⁹. Zudem fehlen Organoide, die ausschließlich aus Epithelzellen stammen, oft keine mehrzellige Heterogenität und können die verzweigte Architektur und funktionale akinar-duktale Organisation der natürlichen Drüsen nicht vollständig wiedergeben^.

Vor diesem Hintergrund zielt diese Studie darauf ab, eine standardisierte Methode zur Konstruktion menschlicher kleiner Speicheldrüsenorganoide zu etablieren. Zuerst isolierten wir Stammzellen (hMSG-SCs) und mesenchymale Stammzellen (hMSG-MSCs) aus menschlichen kleinen Speicheldrüsengeweben 11,12,13. Organoide wurden anschließend über einen selbstassemblierenden Mechanismus initiiert, indem hMSG-SCs und hMSG-MSCs in Matrigel gemeinsam ausgesaat wurden. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Grundlage für die organoide Kultur der Speicheldrüse und legt eine wichtige Grundlage für zukünftige Forschungen zur Speicheldrüsenregeneration und Krankheitsmodellierung.

Protokoll

Humane Proben der kleinen Speicheldrüse (hMSG) wurden von Patienten entnommen, die sich einer Lippenoperation in der Abteilung für plastische und rekonstruktive Chirurgie des Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine unterzogen. Die Patienten (n > 10) waren zwischen 3 Monaten und 10 Jahren alt und hatten keine Vorgeschichte von drüsenbezogenen Erkrankungen oder Autoimmunerkrankungen. Alle Gewebe wurden aus redundanten, histologisch normalen kleinen Speicheldrüsen gewonnen, die während der Lippenspalte-Reparatur entfernt wurden, was eine ethisch anerkannte und optimale Quelle lebensfähigen Gewebes für die Isolierung von Stamm-/Vorläuferzellen bietet. Die informierte Zustimmung wurde voroperativ eingeholt, und die Studie wurde vom Medizinischen Ethikkomitee des Shanghai Ninth People's Hospital genehmigt (Genehmigungsnr. 2018-56). Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Kleine Speicheldrüsensammlung beim Menschen

1. Unmittelbar nach der Exzision werden die Speicheldrüsengewebe in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit Antibiotika ergänzt und bei 4 °C gehalten, bis zur weiteren Verarbeitung (innerhalb von 6 Stunden).

2. Zellisolierung aus menschlichen kleinen Speicheldrüsengeweben

1. Sicherstellen Sie sterile Zustände, indem Sie ein autoklaviertes OP-Set vorbereiten und alle Eingriffe in einem Biosicherheitsschrank (Klasse II BSC) durchführen.
2. Übertragen Sie das entfernte Gewebe in eine Kulturschale mit Dulbeccos Phosphatpuffersalzlösung (PBS) und waschen Sie gründlich. Während des Waschvorgangs verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig Bindegewebe und Restblut zu entfernen, damit das Speicheldrüsengewebe vollständig gereinigt wird.
3. Fügen Sie 1 ml serumfreies Medium hinzu, um Gewebedehydrierung zu verhindern. Zerkleinern Sie das Gewebe in Stücke von höchstens 0,5 mm³ mit steriler Augenschere.
4. Mit steriler Pinzette verteilt man die Gewebestücke gleichmäßig auf den Boden einer T-25-Kulturflasche.
5. Gib 10 ml Kulturmedium in die Kulturflasche.
   HINWEIS: Für die Kultur von epithelialen Stammzellen (hMSG-SCs) wird als primäres Kulturmedium Keratinozytenmedium (KM) verwendet, das 5 μg/mL Rinderserumalbumin, 50 μg/mL Rinderhypophysenextrakt, 5 μg/mL Transferrin, 3,75 μg/mL Insulin, 3 ng/mL Fibroblastenwachstumsfaktor 2, 1 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor, 500 ng/mL Epinephrin, 0,5 μg/mL Hydrocortison, ^10-8 M Prostaglandin E₂ und 30 nM T₃. Für die Kultur von mesenchymalen Stammzellen (hMSG-MSCs) besteht das primäre Kulturmedium aus DMEM/F12, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin (5.000 U/mL) und 1 % GlutaMAX-Supplement.
6. Stellen Sie den T-25-Kolben vertikal in einen 37 °C, 5 % CO2-Inkubator für 4-5 Stunden. In der vertikalen Position berührt das Medium das gehackte Gewebe nicht, sodass die Explants absetzen und fest an der Unterseite haften können.
7. Nach 4–5 Stunden stellt man den Kolben in eine horizontale Position, sodass das Kulturmedium die angesetzten Gewebestücke vollständig abdeckt und das Zellwachstum unterstützt.
8. Ersetze die Hälfte des Mediums am Tag 4 und setze das Medium dann alle 3 Tage wieder ein, bis Zellkolonien entstehen. Wenn eine Hemmung des Zellwachstums beobachtet wird, sollten Sie mit Passaging fortfahren.

3. Zellpassaging

1. Zellpassagen, wenn primäre Zellkolonien Wachstumshemmung zeigen oder wenn die Zellkonfluenz 80%-90% erreicht.
2. Aspiriere das Kulturmedium und wasche die Zellen einmal mit PBS.
3. Fügen Sie 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂ für 4 Minuten für Epithelzellen bzw. 1,5 Minuten für mesenchymale Zellen.
4. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 5 ml vorgewärmtes DMEM-Medium hinzufügen, ergänzt mit 10 % FBS. Die Zellen vorsichtig pipetten, um eine ordnungsgemäße Dissoziation sicherzustellen, dann die Zellsuspension in ein Zentrifugenrohr übertragen und bei 300 × g für 5 Minuten zentrifugieren.
5. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie die hMSG-SCs erneut im KM-Medium und suspendieren Sie die hMSG-MSCs erneut im mesenchymalen Stammzellmedium (MSCM).
6. Säen Sie die resuspendierten Zellen in T-25-Kulturkolben im Verhältnis 1:3 aus und inkubieren Sie dann bei 37 °C, 5 % CO2_{, um die} Expansion fortzusetzen.

4. Selbstorganisation von hMSG-MSCs und hMSG-SCs für den Organoid-Aufbau

1. Taue Matrigel für 3-4 H auf Eis.
2. Eine 24-Wellen-Platte bei 37 °C in einem Inkubator vorheizen und die Pipettenspitzen bei 4 °C vorkühlen, um sie präzise zu handhaben.
3. Fügen Sie 450 μL vorgekühltes steriles PBS zu 1 ml vollständig aufgetautem Matrigel hinzu.
4. Mischen Sie vorsichtig mit vorgekühlten Pipettenspitzen und verteilen Sie 350 μL der verdünnten Matrigel pro Muld auf die vorgeheizte 24-Well-Platte, wobei keine Blasen entstehen.
5. Neige die Platte sanft, um eine gleichmäßige Matrigel-Beschichtung zu gewährleisten.
6. Setzen Sie die Platte für 20-30 Minuten in einen 37 °C, 5 % CO2-Brutkasten, damit das Matrigel fest werden kann. Vermeiden Sie es, die Matrigel zu übertrocknen.
7. Kultivieren Sie hMSG-MSCs und hMSG-SCs an den Passagen 3-5 getrennt, bis sie eine 80%-90%-Übereinstimmung erreichen. Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA verdauen, mit vollständigem Medium neutralisieren und die Zellzahlen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer zählen.
8. Zentrifugieren Sie bei 300 × g für 5 Minuten, entsorgen Sie das Supernatant und lassen Sie es in frischem Kulturmedium wieder suspendieren.
9. Mische hMSG-MSCs und hMSG-SCs im Verhältnis 1:1.
10. Säen Sie die Zellen in matrigelbeschichtete 24-Wellen-Platten mit einer Gesamtzellkonzentration von 2 x 10^{5 Zellen pro} Well.
11. Fügen Sie jedem Bohrloch 1 ml Organoid-Kulturmedium (MSCM:KM = 1:1) hinzu.
12. Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO2, und wechseln Sie das Medium alle 3 Tage.
13. Subkultur-Organoide alle 7 Tage im Verhältnis 1:2 zu 1:4 und werden in Zellgefriermedien zur Lagerung bei -80 °C wieder suspendiert.

5. Statistik und Reproduzierbarkeit

1. Analysieren Sie alle Daten mit statistischer und graphischer Software und präsentieren Sie als Mittelwert ± Standardabweichung (SD). Zweiseitige, ungepaarte Schüler-t-Tests wurden für Vergleiche zwischen zwei Gruppen verwendet. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
   HINWEIS: Alle Experimente wurden mindestens dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt, und alle statistischen Analysen basierten auf mindestens drei unabhängigen Experimenten oder Stichproben.

Ergebnisse

Humane kleine Speicheldrüsengewebe-Explantationen, die in T25-Kolben kultiviert wurden, zeigten nach etwa 5 Tagen ein klares Zellwachstum um die Gewebeblöcke. Im serumreichen Stammzellkulturmedium wiesen die Zellen eine spindelförmige Morphologie auf, die für hMSG-MSCs charakteristisch ist (Abbildung 1A,B). Die Flowzytometrieanalyse zeigte, dass diese Zellen hohe Werte mesenchymaler Stammzellmarker aufwiesen, darunter CD29, CD90, CD105 und CD166 (Abbildu...

Diskussion

Dieses Protokoll ermöglicht den erfolgreichen Aufbau menschlicher kleiner Speicheldrüsenorganoide durch die Isolierung und Kultur von hMSG-SCs und hMSG-MSCs. Die Bildung von Organoiden hängt von sorgfältiger Vorbereitung der Gewebeexplantationen, der Aufrechterhaltung unterschiedlicher Kulturbedingungen für Epithel- und Mesenchymuszellen sowie einer präzisen Ko-Sättung beider Zelltypen auf Matrigel ab. Geeignete Zellverhältnisse und Sädichten sind entscheidend für die Unterstützung der S...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco' s Modifizierter Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11885500BT
0,25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12	Gibco	C11330500BT
Fetales Rinderserum (FBS)	Gibco	10270106
GlutaMAX	Gibco	35050061
Keratinozytenmedium	Sciencell	2101
Matrigel	BD	356230
Mesenchymales Stammzellmedium (MSCM)	Sciencell	7501
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	C20012500BT