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Methodenartikel

MeRIP-qPCR-Assay zur Erkennung vonm6A-Modifikationsniveaus spezifischer RNA in Osteosarkomzellen

847 Ansichten

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DOI:

10.3791/69880

⸱

30. Dezember 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Ansatz zur Bewertung derm6A-Modifikationsniveaus spezifischer RNA mittels MeRIP-qPCR.

Zusammenfassung

Die epitranskriptomische Modifikation der RNA spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung und Entwicklung verschiedener Krebsarten, unter denenN6-Methyladenosin (m 6 A) die am weitesten verbreitete und funktionell vielfältigste Modifikation ist. Hier präsentieren wir ein vereinfachtes und reproduzierbares Protokoll mit MeRIP-qPCR zur Bewertung derm6A-Modifikationsniveaus spezifischer Transkripte in Osteosarkomzellen. In diesem Test wurde Gesamt-RNA extrahiert, gefolgt von einer Inkubation mit einem spezifischen Anti-m6-A-Antikörper gegen Immuncapture-RNA derm6-A-Modifikation. Anschließend wurde RNA fragmentiert und die Anreicherung von m6A-modifizierten RNA-Fragmenten mit magnetischen Protein-G-Perlen erreicht. Die angereicherte RNA wurde durch Proteinase-K-Verdauung freigesetzt und durch RNA-bindende Perlen gereinigt. Schließlich wurde RNA einer Reverse-Transkription und einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unterzogen,umm6-A-Werte in Kandidatengenen zu bewerten. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass diese Methode Methylierungsunterschiede effektiv unterscheidet und ein zuverlässiges Werkzeug zur Erforschung der funktionellen Mechanismen der m6-A-Modifikation in Osteosarkomzellen bietet. Abschließend bietet MeRIP-qPCR einen einfachen und sehr spezifischen Ansatz zur Untersuchung derm6-A-Modifikation in Osteosarkomzellen. Dieses Protokoll birgt großes Potenzial zur Aufklärung von m6A-Regulationsnetzwerken und zur Identifizierung neuartiger therapeutischer Ziele.

Einleitung

Die neuesten Epitranskriptomforschungen zeigen, dass RNAN6-Methyladenosin (m 6 A)-Modifikation, die Methylierungder N6-Position auf Adenosin, die häufigste bekannte intrinsische chemische Modifikation von mRNA in eukaryotischen Zellen1 ist. m6A ist an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt, darunter mRNA-Stabilität, Spleißen, Kernexport und Translationseffizienz2. Wichtig ist, dass sich zunehmende Evidenz darauf hindeutet, dass die Dysregulation derm6-A-Modifikationzur Entstehung und Entwicklung verschiedener Krebsarten beiträgt, darunter Osteosarkom, ein hochaggressiver bösartiger Knochentumor, der überwiegend Jugendliche und junge Erwachsene betrifft3.

Die Untersuchung der m6-A-Modifikation erfordert robuste und zuverlässige Methoden. Mehrere Ansätze wurden entwickelt,um m6A-Modifikationsniveaus zu erkennen, darunter m6A-Punkt-Blot, m6A ELISA und MeRIP-seq. Der m6A-Punkt-Blot-Test ist einfach und kosteneffizient, leidet jedoch unter begrenzter Sensitivität und mangelnder Quantifizierung. Es liefert das m6A Modifikationsniveau der gesamten RNA anstelle des m6A Modifikationsniveaus einer spezifischen RNA4. m6Ein ELISA bietet eine relativ bequeme und hochdurchsatzfähige Erkennung; Allerdings bleiben Kreuzreaktivität und geringe Genauigkeit große Probleme, und es fehlt ebenfalls die Fähigkeit, transkript- oder ortsspezifische Modifikationenaufzuzeigen 5. MeRIP-seq ermöglicht eine transkriptomweite Abbildung von m6A; seine Anforderungen an große RNA-Eingänge, relativ niedrige Auflösung und Antikörperabhängigkeit begrenzen jedoch die MeRIP-seq-Präzision und Reproduzierbarkeit6. Im Gegensatz dazu kombiniert MeRIP-qPCR Immunpräzipitation mit quantitativer PCR, was eine höhere Sensitivität und Spezifität für den gezielten Nachweis von m6A auf spezifischer RNA7 bietet. Diese Methode ermöglicht einen sensiblen und gezielten Nachweis der differenziellen m6A-Anreicherung in Kandidatengenen, was sie besonders geeignet für Validierungsstudien in der m6A-bezogenen Krebsforschung macht. Diese Methode bietet eine kosteneffiziente und zugängliche Alternative für Labore, die m6A-vermittelte Regulierungsmechanismen untersuchen möchten.

Hier haben wir ein detailliertes Protokoll bereitgestellt (Abbildung 1) zur Bewertung derm6A-Modifikationsniveaus von c-Myc in Osteosarkomzellen anhand von MeRIP-qPCR als Beispiel. MeRIP-qPCR, das auf antikörperbasierter Anreicherung von methylierten RNA-Fragmenten basiert, ebenfalls in Verbindung mit Reverse-Transkription und quantitativer PCR, bewertet das Vorhandensein und die relative Häufigkeit von m6A auf spezifischer RNA. Wir zeigten, dass dieser Ansatz die Methylierungsunterschiede von c-Myc effektiv unterschied und eine verlässliche Grundlage für die funktionelle Rolle von m6A in Osteosarkomzellen bot. Diese Studie hebt das Potenzial von MeRIP-qPCR als praktisches und spezifisches Werkzeug für die m6A-Modifikationsforschung im Osteosarkom hervor und bereitet die Grundlage für die Identifizierung neuartiger therapeutischer Ziele.

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Protokoll

1. Vorbereitung der RNA

HINWEIS: Die RNA-Extraktion erfolgt mit einem RNA-Extraktionskit. Arbeiten Sie in einem sauberen Biosicherheitsschrank beim Umgang mit Zellen und RNA-Reagenzien. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille). Kühlen Sie die Zentrifuge vor dem Start auf 4 °C vor.

  1. Bereitet die Zellen vor.
    1. Entferne das Kulturmedium aus der 3,5-cm-Schüssel und wasche die Zellen vorsichtig einmal mit vorgekühltem PBS. Fügen Sie ein geeignetes Volumen RNA-Lysepuffer direkt an die Schale hinzu, um die Zellen vollständig zu lysieren, und pipettieren Sie vorsichtig zur Homogenisierung.
    2. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr.
    3. Zentrifugiere bei 1000 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Rotor ausgewogen ist und der Deckel sicher geschlossen ist.
    4. Entfernen Sie vorsichtig das Mikrozentrifugenrohr nach der Zentrifugierung.
    5. Saugen Sie das Überstandsmittel vollständig mit einer 1-mL-Pipette ab, ohne das Pellet am Boden zu stören.
      HINWEIS: Berühren Sie die Zellkugel nicht mit der Pipettenspitze.
  2. Lysezellen.
    1. Fügen Sie dem Zellpellet 300 μL Lysis-Puffer hinzu.
    2. Gründlich mischen, indem Sie das Rohr 30 Mal umkehren, bis die Lösung klar und viskos erscheint, ohne sichtbare Klumpen.
    3. Inkubiere das Rohr bei Zimmertemperatur für 2 Minuten.
  3. Fälle RNA aus.
    1. Fügen Sie 300 μL 100 % Ethanol zum Lysat hinzu (gleiches Volumen des Lysis-Puffers).
    2. Pipette vorsichtig sofort auf und ab (etwa 8-10 Mal), um vollständig zu mischen.
  4. Führen Sie die RNA-Säulenbindung durch.
    1. Setzen Sie eine RNA-Reinigungssäule in ein mitgeliefertes 2-mL-Sammelrohr.
    2. Übertragen Sie die gesamte Mischung in die Reinigungssäule.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die weiße Membran in der Mitte zu berühren.
    3. Schließe den Deckel und zentrifugiere bei 12.000 × g für 1 Minute.
    4. Entsorgen Sie die untere Flüssigkeit und klopfen Sie vorsichtig auf das saugfähige Papier mit dem Sammelrohr, um die Restflüssigkeit zu entfernen.
    5. Bringen Sie die Reinigungssäule zurück in das Sammelrohr.
  5. Waschen Sie Verunreinigungen.
    1. Fügen Sie 500 μL Wash Buffer (nukleasefreies Wasser) in die Reinigungssäule ein.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die weiße Membran in der Mitte zu berühren.
    2. Zentrifugiere bei 12.000 × g für 1 Minute und entsorge die untere Flüssigkeit.
    3. Zentrifugiere erneut mit 12.000 × g für 1 Minute, um die Restflüssigkeit zu entfernen.
    4. Übertragen Sie die Reinigungssäule in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr.
    5. Öffne den Deckel und lass die Säule 2 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
  6. Elute RNA.
    1. Setzen Sie die Reinigungssäule in ein neues 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr.
    2. Fügen Sie 25 μL Elutionspuffer direkt auf das Zentrum der Membran hinzu.
    3. Inkubiere bei Zimmertemperatur für 5 Minuten.
    4. Zentrifugiere mit 12.000 × g für 1 Minute, um RNA im unteren Röhrchen zu sammeln.
    5. Das Eluat wird erneut auf die Membran aufgetragen und erneut bei 12.000 × g für 1 Minute zentrifugiert, um den Ertrag zu maximieren.
      HINWEIS: Fügen Sie immer den Elutionspuffer direkt auf die Mitte der Säulenmembran hinzu. Vermeiden Sie es, es an die Seitenwand zu geben, da dies verhindern kann, dass RNA gelöst wird, und die Erträge stark reduziert wird. Durchstoßen Sie außerdem nicht die Membran mit der Pipettenspitze.
  7. Misse die RNA-Konzentration.
    1. Spülen Sie den Spektrophotometer-Probeport mit 1,5 μL Elutionspuffer.
    2. Verwenden Sie 1,5 μL Elutionspuffer als Rohstoff. Bestätigen Sie, dass der Wert nahe bei null liegt.
    3. Laden Sie 1,5 μL RNA-Probe ein und messen Sie die Konzentration.
    4. Beurteile die Qualität der RNA-Proben mit einem Spektrophotometer (A260/A280 = 1,8–2,2, A260/A230 = 2,0–2,5) und Agarosegel-Elektrophorese.

2. Methylierte RNA-Immunpräzipitation (MeRIP)

  1. Herstellung einer Immunaufnahmemischung
    1. Besorge eine neue 0,2-mL-PCR-Röhre.
    2. Fügen Sie Komponenten wie in Tabelle 1 aufgeführt hinzu (Beispiel für eine Reaktion).
  2. Immunaufnahme
    1. Schließe den Schlauchdeckel fest. Setze die PCR-Sonde auf einen Rotator oder Rollshaker.
    2. Inkubieren Sie 90 Minuten bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lösung kontinuierlich und sanft gemischt wird.
  3. RNA-Spaltung
    1. Nach der Inkubation werden 10 μL Nuclear Digestion Enhancer (NDE) und 2 μL Cleavage Enzyme Mix (CEM) zu jedem Röhrchen hinzugefügt.
    2. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie 5 bis 6 Mal auf und ab pipetten.
    3. Inkubieren Sie bei Zimmertemperatur 4 Minuten.
    4. Vorbereitung der Input-RNA-Kontrolle
      1. Um eine Konsistenz zwischen Immunpräzipitation (IP) und Eingabeproben zu gewährleisten, wird ein Teil der RNA parallel als Eingabekontrolle verarbeitet.
      2. Übertragen Sie 1 μg Gesamt-RNA (10 % Input) von jeder Probe in ein separates PCR-Röhrchen. Fügen Sie 20 μL Immunaufnahmepuffer (ICB), 1,5 μL Nde, 1 μL CEM hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 2 Minuten.
  4. Magnetische Anreicherung und Waschen
    1. Stelle die PCR-Röhre auf einen Magnethalter.
    2. Lass das Rohr 2 Minuten stehen, bis die Lösung klar wird und die Perlen an der Röhrenwand erfasst werden.
    3. Saugen Sie vorsichtig ab und entsorgen Sie das Supernatant, ohne die Perlen zu stören.
    4. Stellen Sie die Röhre auf einen magnetischen Ständer und fügen Sie 150 μL Wash Buffer (WB) hinzu.
    5. Nimm das Rohr vom Magnethalter und kippe es vorsichtig kopfüber, um die Perlen vollständig wieder aufzuhängen.
    6. Bring das Rohr zurück an den Magnethalter. Warte 1-2 Minuten, bis die Lösung klar ist, und entsorge dann das Supernatant.
    7. Wiederhole den Waschschritt dreimal.
    8. Waschen Sie die Perlen erneut mit 150 μL Protein Digestion Buffer (PDB) mit derselben Methode.
  5. Freisetzung und Rückgewinnung angereicherter RNA
    1. Stellen Sie eine Proteinverdauungs-Arbeitslösung vor, indem Sie Proteinase K und PDB im Verhältnis 1:9 mischen. (Für jede Reaktion werden 20 μL: 2 μL Proteinase K + 18 μL PDB vorbereitet).
    2. Nimm das Rohr nach der Endwäsche vom Magnethalter.
    3. Gib 20 μL frisch zubereiteter Proteinverdauungslösung zur Perlenkugel und vermische vorsichtig.
    4. Setze das PCR-Rohr in einen thermischen Zyklus und inkubiere bei 55 °C für 15 Minuten.
    5. Stelle die PCR-Röhre zurück auf den magnetischen Halter. Warte, bis die Lösung klar ist (etwa 2 Minuten).
    6. Übertragen Sie vorsichtig das gesamte Supernatant (etwa 20 μL) in ein neues 0,2 mL PCR-Rohr.
      HINWEIS: RNA befindet sich jetzt im Supernatant. Wirf die Perlen weg.
  6. RNA-Reinigung
    1. Fügen Sie 20 μL RNA-Reinigungslösung (RPS) zu jedem Probenrohr, Negativkontrollrohr und Eingangsrohr hinzu.
    2. Gib 160 μL 100 % Ethanol dazu.
    3. Wirbel-RNA-Bindungsperlen, um sie wieder aufzuhängen.
    4. Fügen Sie jedem Röhrchen 2 μL resuspendierte RNA-Bindungsperlen hinzu.
    5. Mische mindestens 10 Mal gründlich hoch und runter.
    6. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten, um die RNA-Bindung zu ermöglichen.
    7. Stelle das Rohr auf den Magnethalter. Warte, bis die Lösung klar ist (etwa 2 Minuten).
    8. Entsorge das Supernatant vorsichtig, ohne die Perlen zu stören.
    9. Stellen Sie die Röhre auf einen magnetischen Ständer und fügen Sie 150 μL frisch vorbereitetes 90%iges Ethanol hinzu. Inkubiere 30 Sekunden.
    10. Entsorge das 90%ige Ethanol. Wiederhole die 90%-Ethanol-Waschung noch einmal (insgesamt zwei Waschen).
    11. Nehmen Sie das Rohr vom Magnethalter ab.
    12. Gib 13 μL Elutionspuffer zu den getrockneten Perlen.
    13. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten, um RNA zu elutieren.
    14. Stelle das Rohr zurück auf den Magnethalter. Warte, bis die Lösung klar ist (etwa 2 Minuten).
    15. Übertragen Sie vorsichtig den gesamten Supernatant (etwa 13 μL) in ein neues, RNase-freies PCR-Rohr.
    16. Verwenden Sie RNA sofort oder lagern Sie die RNA bei -20 °C.

3. RT-qPCR

  1. Reverse transkribieren Sie diem6A-angereicherte RNA in cDNA
    1. Verwenden Sie gereinigte RNA aus m6A-IP, Input- oder IgG-Gruppe für die Reverse-Transkription.
    2. Richten Sie die Reverse-Transkriptionsreaktion (RT) ein.
      HINWEIS: Sicherstellen Sie einen gleichen RNA-Input in allen Gruppen, um einen zuverlässigen Vergleich in der nachgelagerten qPCR-Analyse zu ermöglichen.
  2. qPCR-Verstärkung
    1. Bereite qPCR-Reaktionen mit SYBR Green Chemie vor. Geben Sie 10 μL SYBR Green Master Mix (2×), 0,5 μL Forward Primer (10 μM), 0,5 μL Reverse Primer (10 μM), 7 μL ddH2O und 2 μL cDNA zu jedem Rohr, mischen Sie gründlich und zentrifugieren Sie kurz, bevor Sie das qPCR-Gerät einladen.
      HINWEIS: Setze für jede cDNA-Probe drei Replikationsbrunnen (Eingabe, IgG, m6A-IP). Siehe Tabelle 2 für die Liste der Grundierungen.
    2. Führe das qPCR-Programm aus.
      1. Führen Sie die qPCR-Reaktionen an einem Echtzeit-Thermozyklus mit folgendem Programm durch: Stellen Sie die anfängliche Denaturierung für 30 Sekunden auf 95 °C ein; läuft 40 Zyklen, bestehend aus Denaturierung bei 95 °C für 15 Sekunden, Glühen bei 58 °C für 10 Sekunden und Verlängerung bei 72 °C für 30 Sekunden.
      2. Nach der Amplifikation führt eine Schmelzkurvenanalyse durch, indem die Denaturation auf 95 °C für 15 Sekunden eingestellt, bei 60 °C für 1 Minute abgekühlt wird und dann die Temperatur schrittweise auf 95 °C mit einer Steigerrate von 0,5 °C/s mit kontinuierlicher Fluoreszenzaufnahme erhöht wird, um die Spezifität der verstärkten Produkte zu bestätigen.
  3. Datenanalyse
    1. Analysieren Sie die Ct-Werte der Ziel- und Kontrollgruppen.
    2. Berechnen Sie die Anreicherung mit einer der folgenden Methoden:
      1. Methoden 1: % Eingabemethode
        %Eingabe = 2[Ct(Eingabe)−Ct(IP)] × DF × 100 %
        HINWEIS: Ct (Input) und Ct (IP) stellen die Zyklusschwellenwerte der Eingabe- bzw. IP-Proben dar, und der Verdünnungsfaktor (DF) ist der Reziproke des für qPCR verwendeten Eingabeanteils (z. B. wenn 10 % der gesamten RNA als Input verwendet wurden, dann ist DF = 10).
      2. Methoden 2: Vergleichende CT-Methode (2^-ΔΔCt-Methode )
        ΔCtsample=CtIP−CtIgG
        Ct=ΔCtbehandelt−ΔCtKontrolle, Fold=2−ΔΔCt.
        HINWEIS: Halten Sie die RNA-Eingabemengen, den Reaktionsaufbau und die Primer-Effizienz über alle Proben hinweg einheitlich.

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Ergebnisse

Hier liefern wir ein repräsentatives Ergebnis der MeRIP-qPCR-Analyse, das m6-A-Modifikationsniveau von c-Myc in hFOB1.19- und 143B-Zellen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, war die c-Myc-Anreicherung mit dem Anti-m6-A-Antikörper signifikant höher als die IgG-Kontrolle, die nur Hintergrundwerte zeigte, was darauf hindeutet, dass der Anti-m6-A-Antikörper sowohl wirksam als auch spezifisch ist. Wir beobachteten außerdem, dass das<...

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Diskussion

MeRIP-qPCR hat sich als wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von RNA m6A-Modifikationen mit breiter Anwendung etabliert. Sie ist besonders nützlich zur Validierung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsergebnissen und zur präzisen Lokalisierung von Modifikationsstellen innerhalb spezifischer Zielregionen während mechanistischer Studien. Darüber hinaus kann diese Methode in den meisten molekularbiologischen Laboren problemlos implementiert werden, da sie relativ niedrige Kosten und b...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Fördermittel der National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 und 82205145) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 % EthanolShanghai Titan Scientific Co., Ltd., Amerika1158566
143BATCC, AmerikaATCC CRL-8303TM
2& Male; SYBR Green qPCR MixBeijing Qihengxing Biotechnology Co., Ltd., ChinaFS-Q1002
Denovix DS-11 DenovixDS-11 Spektrophotometer
DMEM-MediumWISENT CORPORATION, China319-005-CL
DMEM/F-12 MediumGibco, Amerika11320033
EpiQuik CUT& RUN m6A RNA-Anreicherungskit (MeRIP)Epigentek, AmerikaP-9018-24
Fetales RinderserumWISENT CORPORATION, China086-150
hFOB1.19Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, ChinaGNHu14
m6A RNA-Methylierungs-Assay-KitAbcam, Englandab185912
microRNA Reverse-Transkriptions-KitEZBioscience-EZB, AmerikaA0010CGQ
EchtzeitsystemBIO-RAD, AmerikaCFX96
Gesamt-RNA-ExtraktionskitEZBioscience-EZB, AmerikaB0004DP
TrypLE-ExpressenzymGibco, Amerika12604021

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

RNA Immunpr zipitationN6 MethyladenosinRNA ExtraktionProtein G BeadsAntik rper AnreicherungReverse Transkriptase PCRRNA Fragmentierung
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