Methodenartikel

Standardisierte Methode zur Erkennung von Tunnel-Nanoröhren in menschlichen Hautzellen für Anwendungen in der Tissue Engineering

790 Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/69883

⸱

13. Januar 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein standardisiertes Protokoll zur Visualisierung von Tunnel-Nanoröhren zwischen menschlichen epidermalen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten unter Verwendung von Membran- und F-Actin-Markierung mit Z-Stack-Konfokalbildgebung gezeigt, mit optionaler α-Tubulin-Co-Coloring, die reproduzierbare Detektion und zytoskelettale Charakterisierung für Gewebetechnik-Anwendungen ermöglicht.

Zusammenfassung

Tunnel-Nanoröhren (TNTs) sind dünne, aktinbasierte interzelluläre Leitungen, die den Langstreckentransfer von Organellen und Signalladung ermöglichen. Obwohl sie bei mehreren Zelltypen weit verbreitet berichtet wurden, ist ihr Vorkommen in menschlichen Hautzellen nicht gut beschrieben. Dieser Artikel beschreibt ein standardisiertes Protokoll zur Nachweisung und Charakterisierung von TNTs in vitro zwischen humanen epidermalen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten. Die Methode umfasst die Vorbereitung einer Kokultur von Primärzellen, eine sanfte Fixierung zur Erhaltung empfindlicher TNTs, die Membrankennzeichnung mit Weizenkeim-Agglutinin, die F-Aktin-Färbung mit Phalloidin sowie systematische Z-Stack-Bildgebung mittels invertierter konfokaler Mikroskopie, um TNTs, die über dem Substrat suspendiert sind, von adhärenten Filodien zu unterscheiden. Eine optionale Immunfärbung für α-Tubulin ermöglicht die Beurteilung der Mikrotubuli-Einbildung. TNTs werden durch drei Merkmale definiert: dünne, gerade Vorsprünge, die zwei oder mehr Zellen verbinden, das Vorhandensein von F-Aktin und die Kontinuität über Zellpaare in seriellen optischen Abschnitten. Repräsentative Ergebnisse zeigen TNTs, die dermal-dermal, epidermal-epidermal und dermal-epidermal paar, mit variabler zytoskelettaler Zusammensetzung (F-Aktin allein oder F-Aktin plus α-Tubulin) verknüpfen. Wichtige Schritte sind eine sanfte Fixierung, der Einsatz frischer Reagenzien und die Beschaffung ausreichender Z-Ebenen, um eine Fehlklassifizierung zu vermeiden, während häufige Artefakte TNT-Brüche und unvollständige Verfärbungen sind. Zusammen ermöglichen diese optimierten Schritte eine reproduzierbare TNT-Detektion in Hautzellsystemen und bieten eine methodische Grundlage für zukünftige Untersuchungen der TNT-vermittelten Kommunikation in der Hautbiologie und Regeneration.

Einleitung

Tunnelnde Nanoröhren (TNTs) sind nanoskalige, aktinbasierte Kanäle, die den direkten interzellulären Transfer von Organellen und Signalmolekülen ermöglichen. Sie sind typischerweise 6–100 μm lang und 50–500 nm im Durchmesser, wobei einige bis zu 700 nmdick sind. Im Gegensatz zu leeren Membranvorsprüngen enthalten TNTs zytoskelettale Filamente, meist F-Aktin, das für strukturelle Steifigkeit sorgt und den mitochondrialen Transportunterstützt 2,3,4. In der zweidimensionalen Kultur werden TNTs durch drei Merkmale definiert: dünne (20–700 nm), gerade Vorsprünge, die über dem Substrat schweben und zwei oder mehr Zellen verbinden; das Vorhandensein von F-Aktin-Filamenten; und die Möglichkeit, Fracht zu transferieren.

Seit ihrer ersten Identifizierung in PC-12-Zellen durch Rustom et al.5 wurden TNTs in mehreren Systemen untersucht, darunter das kardiovaskuläre6, Immunsystem7 und Atemsystem8, hornhautepithel9, Tumore10 und das Nervensystem11,12. Sie tragen zu physiologischen und pathologischen Prozessen wie Immunsignalgebung, Apoptose, Materialtransport und Angiogenesebei 13,14,15. TNTs können den Langstreckentransfer verschiedener Ladungen vermitteln, darunter Mitochondrien, endoplasmatisches Retikulum, Nukleinsäuren, Ionen und sogar Viren 5,16,17.

Die Haut ist ein strukturell komplexes Organ, wobei Epidermis und Dermis auf ständige Kommunikation für Homöostase, Wundheilung und Anhängselregenerationangewiesen sind. Obwohl TNTs in vielen Geweben beschrieben wurden, darunter das Immunsystem, das neuronale System und das Hornhautepithel 7,9,12, wurde ihr Vorkommen in menschlichen Hautzellen in der veröffentlichten Literatur nicht berichtet. Aufbauend auf dem methodischen Rahmen von Sáenz-de-Santa-María et al.21 präsentieren wir ein standardisiertes und optimiertes Protokoll zur Erkennung von TNTs zwischen epidermalen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten22 mittels Immunfluoreszenzfärbung in Kombination mit invertierter konfokaler Mikroskopie.

Im Vergleich zu alternativen TNT-Detektionsmethoden bietet dieses Protokoll ein praktisches Gleichgewicht zwischen Empfindlichkeit und Zugänglichkeit. Die Lebendzellbildgebung kann die Dynamik der TNT erfassen, ist jedoch durch Phototoxizität und die kurzlebige Natur von TNTs 1,23 begrenzt. Die Elektronenmikroskopie liefert ultrastrukturelle Details, kann jedoch oft lange TNT-Bereiche nicht erhalten und ist für die routinemäßige Analyse primärer Hautzellen nicht praktikabel24,25. Reporterbasierte Nanoröhrensysteme ermöglichen Echtzeit-Tracking, erfordern jedoch genetische Manipulation, was bei primären Keratinozyten und Fibroblasten typischerweise ineffizient ist24,26. Im Gegensatz dazu verwendet das vorliegende Protokoll Standard-Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie, was reproduzierbare TNT-Detektion über unabhängig vorbereitete Hautzellkulturen ermöglicht und gleichzeitig die Kompatibilität mit fragilen Primärzellen aufrechterhält.

Diese Methode eignet sich besonders für die Analyse von festen Proben, bei denen die zytoskelettale Zusammensetzung und die TNT-Prävalenz von Interesse sind. Da TNTs sehr empfindlich sind, bleiben Fixierungs- und Handhabungsschritte wesentliche Einschränkungen, und der Ansatz kann die Echtzeit-TNT-Dynamik nicht erfassen. Dennoch bietet dieser standardisierte Arbeitsablauf für Labore, die mit primären menschlichen Hautzellen arbeiten, eine zugängliche und konsistente Möglichkeit zur Visualisierung von TNTs und unterstützt nachgelagerte Studien zu ihren potenziellen Funktionen in der Gewebetechnik und Regeneration.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle in dieser Studie verwendeten Hautzellen waren zuvor eingefrorene Primärzellen, die aus menschlichem Hautgewebe isoliert wurden, die als entsorgte Vorhautproben aus Beschneidungsverfahren gewonnen wurden, und wurden vollständig deidentifiziert22. Die Entnahme menschlicher Hautproben erfolgte in der Abteilung für Urologie des Ningbo University Affiliated People's Hospital, und das Studienprotokoll wurde vom institutionellen Ethikkomitee genehmigt (Protokoll Nr. 2024104; Genehmigungsdatum: 30. Oktober 2024).

1. Identifizierung von TNTs in menschlichen primären Hautepidermalen Keratinozyten und dermalen Fibroblasten

  1. Lösungsvorbereitung
    1. Stellen Sie fixative Lösung 1 (200 μL) vor, indem Sie 4 % PFA (100 μL), 2,5 % Glutaraldehyd (4 μL), 1 M HEPES (40 μL) und 1x PBS (56 μL) hinzufügen. Frisch zubereiten und vor der Verwendung auf 37 °C vorwärmen.
    2. Fixative Lösung 2 (200 μL) werden durch Zugabe von 8 % PFA (100 μL), 1 M HEPES (0,4 μL), 1x PBS (99,6 μL) hergestellt. Frisch zubereiten und vor der Verwendung auf 37 °C vorwärmen.
    3. Bereite fixative Lösung 3 (200 μL) vor, indem du 8 % PFA (100 μL), 2,5 % Glutaraldehyd (4 μL), 1x PBS (96 μL) hinzufügst. Frisch zubereiten und vor der Verwendung auf 37 °C vorwärmen.
  2. Zellkultur
    1. Tauen und kultivieren Sie menschliche epidermale Keratinozyten und dermale Fibroblasten in 60-mm-Schalen mit dem entsprechenden Wachstumsmedium. Ergänzen Sie Keratinozytenkulturen mit Y-27632 bei einer Endkonzentration von 5 μM während der Wiederbelebung. Kulturen werden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator aufbewahrt, bis die Zellen ~80 % Konfluenz erreichen.
    2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen kurz mit 1 ml 1x PBS (verwendet zur Aufrechterhaltung des physiologischen pH-Werts und der Osmolarität während des Waschens). Aspiratiere das PBS.
    3. Fügen Sie 1 ml 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu, verteilen Sie es gleichmäßig und inkubieren Sie bei 37 °C für 1,5–2,5 Minuten.
    4. Lassen Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren wieder aufhängen. Fügen Sie 2 ml Wachstumsmedium hinzu, geben Sie es in ein 15-ml-Rohr und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 Minuten bei Zimmertemperatur.
    5. Entsorge das Supernatant und suspendiere das Pellet in 1–2 mL Medium. Zähle Zellen mit einem automatisierten Zähler.
    6. Säen Sie 12.000 dermale Fibroblasten oder 20.000 Keratinozyten in jedem Brunnen eines 8-Brunnen-Kammer-Objektträgers in einem Endvolumen von 400 μL. Nach dem Aussaat schütteln Sie die Kammer gut, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie ~24 Stunden bei 37 °C.
    7. Nach etwa 24 Stunden Inkubation beobachten Sie die Zellkonfluenz unter dem Mikroskop. Erreicht er ~80 %, fahren Sie mit den folgenden Fixierungsschritten fort.
  3. Fixierung
    1. Wenn die Kulturen ~80 % Konfluenz erreichen, geben Sie vorsichtig mehrere Tropfen Fixationslösung 1 direkt in den Kammerbrunnen, um die Zellen vorzufixieren. Inkubiere 4 Minuten bei Zimmertemperatur. Stellen Sie sicher, dass sich das Fixativ gleichmäßig verteilt, ohne die Zellen zu stören.
      VORSICHT: Führen Sie es vorsichtig, um eine Störung von TNTs zu vermeiden. Da die fixierenden Lösungen giftige Bestandteile wie PFA und Glutaraldehyd enthalten, tragen Sie immer Schutzhandschuhe, Schutzkleidung und eine Maske und führen Sie diese in einer Abzugshaube. Waschen Sie sich danach gründlich die Hände. Sammeln Sie PFA- und Glutaraldehyd-Fixationsabfälle getrennt in beschrifteten Behältern zur Entsorgung gefährlicher Chemikalien.
    2. Saugen Sie das Präfixativ ab und ersetzen Sie es durch 140 μL frische Fixationslösung 1, um sicherzustellen, dass das gesamte Bohrloch abgedeckt ist. Inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 °C.
    3. Entfernen Sie Fixationslösung 1 und fügen Sie 140 μL Fixationslösung 2 hinzu. Inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 °C. Stellen Sie sicher, dass die Lösung die Zellen vollständig bedeckt, um eine gleichmäßige Fixierung zu gewährleisten.
    4. Entfernen Sie das Fixativ und fügen Sie dann 140 μL 100 mM NH₄Cl hinzu, um die Restaldehyde abzuschrecken. Inkubieren Sie 10-30 Minuten bei Raumtemperatur.
    5. Spülen Sie die Proben dreimal mit 1x PBS für jeweils 30 Sekunden bei Raumtemperatur ab und pipettieren Sie sanft entlang der Kammerwand, um Zellen nicht wegzuspülen oder TNTs zu beschädigen.
  4. Membran- und Zytoskelettalfärbung
    1. Inkubieren Sie Zellen mit 140 μL 1:300 (v/v) WGA (Weizenkeim-Agglutinin)-Alexa-Fluor-Konjugat, das Plasmamembranglykoproteine zur Visualisierung von membranabgeleiteten TNTs markiert, in 1x PBS für 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen in einer dunklen Umgebung durchgeführt werden.
    2. Waschen Sie 3x mit 1x PBS (jeweils 30 Sekunden). Inkubieren Sie mit 140 μL Phalloidinkonjugat, verdünnt 1:250 (v/v) in 1 % BSA, für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
    3. Waschen Sie 3x mit 1x PBS (jeweils 30 Sekunden). Inkubieren Sie mit 140 μL DAPI-Lösung für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    4. Waschen Sie dreimal mit 1× PBS. Gib 2-3 Tropfen Montagemedium hinzu, inkubiere 20 Minuten bei Raumtemperatur und lagere mindestens 20 Minuten bei 4 °C im Dunkeln, bis die Bildgebung entsteht.
  5. Bildgebung
    1. Nehmen Sie Bilder mit einem invertierten konfokalen Mikroskop mit 40x-Objektiv auf. Wählen Sie zufällige Felder aus und sammeln Sie Z-Stacks (10–20 Schichten) von unten bis oben in den Zellen. Die spezifischen Mikroskopparameter, die für die Bildaufnahme verwendet werden, sind unten aufgeführt:
      Konfokales Laserrastermikroskop: ZEISS LSM 900
      Laserlinien: Spur 1 (561 nm, 4,0 %), Spur 2 (488 nm, 16,0 %), Spur 3 (405 nm, 60,0 %)
      Detektorverstärkung: 525 V
      Z-Schrittgröße: 20 optische Schnitte (Gesamttiefe: 5,32 μm)

2. Kokultivierung von epidermalen und dermalen Zellen

  1. Bereite Keratinozyten und Fibroblasten wie in den Schritten 1.2.1-1.2.5 vor.
  2. Säen Sie 10.000 Keratinozyten und 6.000 Fibroblasten pro Kammer in 400 μL Medium. Nach dem Aussaat schütteln Sie die Kammer gut, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. 24 Stunden bei 37 °C inkubieren.
  3. Nach etwa 24 Stunden Inkubation beobachten Sie die Zellkonfluenz unter dem Mikroskop. Erreicht er ~80 %, fahren Sie mit den folgenden Fixierungsschritten fort.
  4. Membranen fixieren und färben wie in den Schritten 1.3-1.4 beschrieben.
  5. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1 % Triton X-100, um Antikörpern den Zugang zu intrazellulären Zielen zu ermöglichen, für 3 Minuten bei Raumtemperatur, dann dreimal mit 1x PBS zu waschen.
    HINWEIS: 0,1 % Triton X-100 sollten vor der Verwendung frisch vorbereitet werden.
    VORSICHT: Triton X-100, schädlich für aquatisches Leben, muss ebenfalls als chemischer Abfall entsorgt und niemals in den Abfluss gegossen werden.
  6. Blockieren Sie mit 140 μL 2 % BSA in PBS, um die unspezifische Antikörperbindung für 20 Minuten bei Raumtemperatur zu reduzieren.
    HINWEIS: 2 % BSA sollten vor der Verwendung frisch vorbereitet werden.
  7. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C mit dem Anti-Cytokeratin-5-Antikörper, verdünnt 1:200 (v/v) in 2 % BSA.
  8. Waschen Sie dreimal mit 1x PBS und inkubieren Sie dann 1-2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Alexa Fluor 594-konjugierten Sekundärantikörpern.
  9. Waschen Sie dreimal mit 1× PBS. Färben Sie die Kerne mit DAPI und bilden Sie sie wie in den Schritten 1.4.5-1.5.2 ab.

3. Identifikation der zytoskelettalen Komponenten von TNTs

  1. Zellkultur
    1. Kultivieren und fixieren Sie Zellen wie in den Schritten 1.2-1.3. Permeabilisieren Sie mit 0,1 % Triton X-100 für 3 Minuten bei Raumtemperatur, dann mit 1x PBS waschen.
    2. Blocke mit 2 % BSA für 20 Minuten bei Zimmertemperatur. Über Nacht bei 4 °C mit Anti-α-Tubulin-Antikörper inkubieren.
    3. Waschen Sie dreimal mit 1x PBS und inkubieren Sie mit Alexa-Fluor-konjugierten Sekundärantikörpern 1-2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen in einer dunklen Umgebung durchgeführt werden.
    4. Wasche dreimal mit 1x PBS. Beschriften Sie F-Aktin mit Phalloidin und Bild wie in den Schritten 1.4.3-1.5
  2. Kokultivierung von Zellen
    1. Bereiten Sie Kokulturen wie in den Schritten 2.1-2.2 vor. Fixiere mit Fixationslösung 3 für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
    2. Ersetze sie durch 140 μL 100 mM NH4Cl und inkubiere 10-30 Minuten bei Raumtemperatur. Wasche dreimal mit 1x PBS.
    3. Identifizieren Sie zunächst die Epidermiszellen durch Permeabilisierung, Blockierung und CK5-Immunfärbung genau wie in den Schritten 2.4-2.8 beschrieben.
    4. Als Nächstes führen Sie α-Tubulin-Immunfärbung gemäß den Schritten 3.1.2-3.1.4 durch.
    5. Abschließend färben Sie F-Actin mit Phalloidin und fahren Sie mit der Bildgebung wie in den Schritten 1.4.2-1.5.2 beschrieben fort.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Mit diesem standardisierten Protokoll wurden Tunnel-Nanoröhren (TNTs) erfolgreich in menschlichen Hautzellen sowohl unter Einzelkultur- als auch unter Kokulturbedingungen identifiziert. Zur Validierung der Antikörperspezifität wurden vor den experimentellen Analysen sowohl positive als auch negative Kontrollfärbungen für alle Antikörper durchgeführt, wie in ergänzenden Abbildungen 1, ergänzende Abbildung 2, ergänzende Abbildung 3 und ergänzende Abbildung 4

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll ist die Erhaltung von TNTs während der Fixierung und Färbung, da diese Strukturen äußerst empfindlich und leicht zu zerstören sind. Sanftes Handhaben während der Fixierung, ein angemessenes Timing und die Verwendung frischer Fixierungsmittel sind unerlässlich, um die TNT-Integrität zu erhalten. Die Verwendung der Z-Stack-Konfokalbildgebung ist ebenso wichtig, um TNTs, die über dem Substrat suspendiert sind, von Filopodia oder anderen adhären...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen zu erklären.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas finanziert (Zuschuss Nr. 82273554). Die Autoren danken dem Biomaterials and Tissue Regeneration Engineering Laboratory am Ningbo Stomatology Hospital für ihre kontinuierliche Unterstützung und danken sowohl aktuellen als auch ehemaligen Teammitgliedern für ihre wertvollen Diskussionen. Die Autoren danken auch Lehrer Feng Li vom Forschungs- und Experimentierzentrum des Hangzhou Medical College für die großzügige Unterstützung und starke Unterstützung bei der Erleichterung des Zugangs zum konfokalen Mikroskop.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15-mL-RöhreKIRGENKG2611Steril, frei von RNase/Dnase und pyrogen
37 & Grad; C-InkubatorThermowissenschaftlich51032877Der 37-Grad-CO2-Inkubator bietet eine ideale In-vitro-Umgebung.
Actin-Tracker Rot-RhodaminBeyotimeC2207sDie Actin-Tracker Red-Rhodamine-Sonde ist ein Phalloidin, das mit dem fluoreszierenden Farbstoff Rhodamin gekennzeichnet ist, mit einer maximalen Anregungswellenlänge von 540 nm und einer maximalen Emissionswellenlänge von 565 nm.
Alexa-Fluor-Konjugat von Weizenkeim-Agglutinin (WGA)Molekulare SondenW11261  Alexa Fluor 488 Konjugiert
Anti-Alpha-Tubulin-AntikörperAbcamab7291Anti-Alpha-Tubulin-Antikörper - Loading Control (ab7291) ist ein monoklonaler Maus-Antikörper, der Alpha-Tubulin detektiert. Geeignet für Menschen, Maus, Ratten.
Anti-Zytokeratin-5-Antikörper Abcamab52635Anti-Cytokeratin 5 Antikörper – Zytoskelettmarker (ab52635) ist ein monoklonaler Kaninchenantikörper, der Cytokeratin 5 nachweist. Geeignet für Menschen, Maus, Ratten.
Aqua-Poly/MontierungPolywissenschaften18606Wasserlösliches, nicht-fluoreszierendes Montagemedium wurde für die Montage von Abschnitten aus wässrigen Lösungen entwickelt. Nützlich für immunfluoreszierende Techniken, da sie fluoreszierende Färbungen verbessert und behält.
Automatisierter ZellzählerCountstarIC1000Automatisierter Zellzähler für schnelle, präzise Zellzählung
TischzentrifugeBIORIDGETD5Tischzentrifuge für schnelle und effiziente Probentrennung im Labor
Biologischer SicherheitsschrankThermowissenschaftlich1379Der biologische Sicherheitsschrank ist ein steriles Eindämmungsgerät, das Bediener, Proben und Umwelt vor Biohazards schützt, indem es luftgetragene Krankheitserreger filtert und Kreuzkontamination während der mikrobiologischen Arbeit verhindert.
Rinderserumalbumin (BSA)YOBIBIOU5010-10gBSA ist ein Globulin im Rinderserum, das 583 Aminosäurereste mit einem Molekulargewicht von 66,430 kDa und einem isoelektrischen Punkt von 4,7 enthält
Zellkulturschale (60X15 mm)Eppendorf30701119Gewebekultur behandelt steril, frei von nachweisbaren Pyrogenen, RNase & DNase, DNA.
Cellvis-Kammer Schiebe-8-KammerCellvisC8-1.5H-NEntwickelt für hochauflösende Bildgebung wie Konfokalmikroskopie.
DAPI-FärbelösungBeyotimeC1006-10 mLDie DAPI-Färbelösung eignet sich für die Nuklearfärbung aller gewöhnlichen Zellen und Gewebe.
Ziegen-Anti-Maus IgG H& L (Alexa Fluor 405) Abcamab175660Ziegen-Anti-Maus IgG H& L (Alexa Fluor 405) ist ein sekundärer Antikörper mit einer maximalen Absorptionswellenlänge von 401 nm und einer maximalen Emissionswellenlänge von 421 nm.
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H& L konjugiert zu Alexa Fluor 405Abcamab175652Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H& L (Alexa Fluor 405) ist ein sekundärer Antikörper mit einer maximalen Absorptionswellenlänge von 401 nm und einer maximalen Emissionswellenlänge von 421 nm.
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H& L konjugiert zu Alexa Fluor 594Abcamab150080Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H& L (Alexa Fluor 594) ist ein sekundärer Antikörper mit einer maximalen Absorptionswellenlänge von 590 nm und einer maximalen Emissionswellenlänge von 617 nm.
Invertiertes konfokales FluoreszenzmikroskopLeicaTCS SP8 XDas Leica SP8 X Laser-Scanning-Konfokalmikroskop liefert unvergleichliche, hochauflösende Bildgebung mit fortschrittlicher Fluoreszenzerkennung und Live-Zell-Analysefunktionen.
Invertiertes konfokales FluoreszenzmikroskopAndorBC43Das Andor BC43 ist ein kompaktes, hochgeschwindigkeits-konfokales Mikroskop, das eine 10-mal schnellere Bildgebung als herkömmliche Systeme mit einer Ein-Klick-2D/3D-Bildgebung bietet.
NH4Cl MedChemExpressHY-Y1269 Ammoniumchlorid als polare Verbindung zur Regulierung des pH-Werts.
Phalloidinkonjugierte Oregon GreenTM488LebenstechnologienO7466Farbe: Grün. Anregungswellenlängenbereich: 496/520.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Viva ZellbiowissenschaftenC3582-0500Seine Funktion besteht darin, den pH-Wert des Mediums im physiologischen Bereich zu halten und das osmotische Druckgleichgewicht innerhalb und außerhalb der Zelle aufrechtzuerhalten.
Triton-X 100SolarbioT8200-100mlEs ist ein vielseitiges nichtionisches Tensid, das zur Wiederherstellung von Membrankomponenten unter milden Denaturierungsbedingungen verwendet wird.
Trypsin-EDTA-LösungGIBCO25300054Aufgrund seiner Verdauungskraft wird Trypsin weit verbreitet für Zelldissoziation, routinemäßige Zellkultur-Durchgänge und primäre Gewebedissoziation eingesetzt.
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632 ist ein oral aktiver, ATP-kompetitiver Inhibitor von ROCK-I und ROCK-II

Referenzen

  1. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Commun Integr Biol. 7 (1), e27934(2014).
  2. Liu, Z., Sun, Y., Qi, Z., Cao, L., Ding, S. Mitochondrial transfer/transplantation: an emerging therapeutic approach for multiple diseases. Cell Biosci. 12 (1), 66(2022).
  3. Yang, F., et al. Tunneling Nanotube-Mediated Mitochondrial Transfer Rescues Nucleus Pulposus Cells from Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis. Oxid Med Cell Longev. 2022, 3613319(2022).
  4. Yang, C., et al. Mitochondria transfer from early stages of erythroblasts to their macrophage niche via tunnelling nanotubes. Br J Haematol. 193 (6), 1260-1274 (2021).
  5. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  6. Alarcon-Martinez, L., et al. Pericyte dysfunction and loss of interpericyte tunneling nanotubes promote neurovascular deficits in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (7), 2110329119(2022).
  7. Zhu, C., Shi, Y., You, J. Immune Cell Connection by Tunneling Nanotubes: The Impact of Intercellular Cross-Talk on the Immune Response and Its Therapeutic Applications. Mol Pharm. 18 (3), 772-786 (2021).
  8. Zhang, F., et al. TFAM-Mediated mitochondrial transfer of MSCs improved the permeability barrier in sepsis-associated acute lung injury. Apoptosis. 28 (7-8), 1048-1059 (2023).
  9. Jiang, D., et al. Mitochondrial transfer of mesenchymal stem cells effectively protects corneal epithelial cells from mitochondrial damage. Cell Death Dis. 7 (11), e2467(2016).
  10. Zheng, Y., et al. Tunneling nanotubes mediate KRas transport: Inducing tumor heterogeneity and altering cellular membrane mechanical properties. Acta Biomater. 185, 312-322 (2024).
  11. Dilsizoglu Senol, A., et al. α-Synuclein fibrils subvert lysosome structure and function for the propagation of protein misfolding between cells through tunneling nanotubes. PLoS Biol. 19 (7), e3001287(2021).
  12. Scheiblich, H., et al. Microglia rescue neurons from aggregate-induced neuronal dysfunction and death through tunneling nanotubes. Neuron. 112 (18), 3106-3125.e8 (2024).
  13. Solimando, A. G., et al. Tunneling nanotubes between bone marrow stromal cells support transmitophagy and resistance to apoptosis in myeloma. Blood Cancer J. 15 (1), 3(2025).
  14. Korenkova, O., et al. Tunneling nanotubes enable intercellular transfer in zebrafish embryos. Dev Cell. 60 (4), 524-534 (2025).
  15. Ma, L., et al. Dynamic three-dimensional culture enhances tunneling nanotubes-mediated mitochondrial transfer in mesenchymal stromal cells to accelerate wound healing. J Nanobiotechnol. 23 (1), 559(2025).
  16. Sahinbegovic, H., et al. Intercellular Mitochondrial Transfer in the Tumor Microenvironment. Cancers (Basel). 12 (7), 12071787(2020).
  17. Gurke, S., Barroso, J. F., Gerdes, H. H. The art of cellular communication: tunneling nanotubes bridge the divide. Histochem Cell Biol. 129 (5), 539-550 (2008).
  18. Kobielak, K., Pasolli, H. A., Alonso, L., Polak, L., Fuchs, E. Defining BMP functions in the hair follicle by conditional ablation of BMP receptor IA. J Cell Biol. 163 (3), 609-623 (2003).
  19. Nowak, J. A., Polak, L., Pasolli, H. A., Fuchs, E. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis. Cell Stem Cell. 3 (1), 33-43 (2008).
  20. Woo, W. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26 (11), 1235-1246 (2012).
  21. Sáenz-de-Santa-María, I., Henderson, J. M., Pepe, A., Zurzolo, C. Identification and Characterization of Tunneling Nanotubes for Intercellular Trafficking. Curr Protoc. 3 (11), e939(2023).
  22. Liu, Z., et al. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
  23. Dupont, M., Souriant, S., Lugo-Villarino, G., Maridonneau-Parini, I., Vérollet, C. Tunneling Nanotubes: Intimate Communication between Myeloid Cells. Front Immunol. 9, 43(2018).
  24. Gerdes, H. H., Rustom, A., Wang, X. Tunneling nanotubes, an emerging intercellular communication route in development. Mech Dev. 130 (6-8), 381-387 (2013).
  25. Sartori-Rupp, A., et al. Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells. Nat Commun. 10 (1), 342(2019).
  26. Dagar, S., Pathak, D., Oza, H. V., Mylavarapu, S. V. S. Tunneling nanotubes and related structures: molecular mechanisms of formation and function. Biochem J. 478 (22), 3977-3998 (2021).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Keratinozyten Fibroblasten KokulturF Aktin F rbungWeizenkeim AgglutininKonfokalmikroskopieschonende FixierungAlpha Tubulin Immunf rbungKommunikation von Hautzellen

Verwandte Artikel