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Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Diese Studie bewertet die Auswirkungen der Gualou Guizhi Antispasmodic Granules (GLGZ) auf Spastizität, die durch Rückenmarksverletzungen (SCI) ausgelöst wird, mittels verhaltensbezogener, biomechanischer, bildgebender und histologischer Methode und untersucht PANoptosis-bezogene Mechanismen.
Muskelspastizität nach einer Rückenmarksverletzung (SCI) beeinträchtigt die Lebensqualität erheblich, mit begrenzten wirksamen Behandlungen. Gualou Guizhi Antispasmodic Granules (GLGZ), eine im Krankenhaus entwickelte Formulierung der traditionellen chinesischen Medizin (TCM), kann Krämpfe lindern. Diese Studie hatte zum Ziel, die Wirksamkeit von GLGZ bei SCI-induzierter Spastizität und deren Zusammenhang mit PANoptose (einem neuartigen programmierten Zelltod mit Apoptose, Nekrodose und Pyroptose) zu bewerten.
Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 180–200 g wurden verwendet. SCI wurde mittels der Allen-Gewichtsabnahmemethode induziert. Die erfolgreichen Modellratten wurden zufällig einer Modellgruppe oder einer der GLGZ-Dosisgruppen zugeordnet: hoch, mittel oder niedrig. Scheinratten wurden ohne Rückenmarksverletzung laminektomie entfernt. Die Interventionen dauerten 4 Wochen. Nach der Intervention wurde die motorische Funktion der Gliedmaßen mit der Basso-Beattie-Bresnahan-(BBB)-Skala bewertet. Die Femurmuskelsteifheit wurde mittels Ultraschall-Scherwellenelastographie (SWE) beurteilt, während die Integrität des Rückenmarks mittels Magnetresonanztomographie (MRT) bestimmt wurde. Hämatoxylin-Eosin (HE), Nissl und Luxol Schnellblaufärbung wurden durchgeführt, um histopathologische Veränderungen zu beobachten. Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung wurde verwendet, um apoptoseassoziiertes, speck-ähnliches Protein mit CARD (ASC, grün), Caspase-8 (orange) und rezeptorinteragierendem Serin/Threonin-Protein-Kinase 3 (RIPK3, gelb) zu markieren, um die PANoptose zu bewerten.
GLGZ verbesserte die BBB-Werte dosisabhängig: Sham (21,00 ± 0,00), Modell (5,8 ± 1,1), hochdosiert (10,6 ± 1,3), mittlere Dosis (8,5 ± 1,2), niedrige Dosis (7,1 ± 1,0). SWE zeigte eine verminderte Muskelsteifheit: Modell (6,68 ± 0,74 m/s), hohe Dosis (2,19 ± 0,36 m/s, P < 0,001), mittlere Dosis (3,04 ± 0,45 m/s, P = 0,002), niedrige Dosis (4,08 ± 0,65 m/s, P = 0,031) vs. Modell. Im Vergleich zur Modellgruppe (3,65 ± 1,03 mm²) reduzierte GLGZ dosisabhängig die Größe der Rückenmarksläsion in allen Dosierungsgruppen (alle P < 0,05) (1,33 ± 0,79 mm² in hoher Dosis, 1,94 ± 0,67 mm² in mittlerer Dosis, 2,50 ± 0,79 mm² in niedriger Dosisgruppe. Die Histologie zeigte, dass GLGZ Neuronen erhalten und die Myelinreparatur förderte. GLGZ-dosisabhängig reduzierte die ASC-, Caspase-8- und RIPK3-Expression.
Muskelkrampf ist eine häufige Komplikation einer Rückenmarksverletzung (SCI) und beeinträchtigt die Lebensqualität der Patienten erheblich. Ihr pathologischer Prozess umfasst unter anderem eine anfängliche mechanische Verletzung, sekundäre Entzündung, oxidativen Stress, Apoptose und beeinträchtigte Nervenregeneration. Aktuelle Behandlungen (chirurgische Dekompression, Pharmakotherapie, Rehabilitation) haben nur begrenzte Wirksamkeit, wobei Langzeitmedikamente Nebenwirkungen wie Medikamentenresistenz3 verursachen. Daher ist es entscheidend, neuartige Mechanismen und Behandlungen zu erforschen.
Jüngste Studien haben PANoptose, einen programmierten Zelltod, identifiziert, der Apoptose (caspaseabhängig), Nekropotose (RIPK3/MLKL-abhängig) und Pyroptose (Caspase-8/GSDMD-abhängig)4 als einen zentralen pathologischen Mechanismus der sekundären Verletzung bei SCI integriert. Abnormale Aktivierung von (ASC, Caspase-8 und RIPK3) induziert Neuronenverlust und gliale Narbenbildung, was die Spastikizität5 verschärft. Die Zielerfassung von PANoptose hat sich daher als vielversprechende Strategie erwiesen, um diesekundäre Verletzungskaskade 4 bei SCI zu unterbrechen.
Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) hat aufgrund ihrer multizielreichen Wirkungen (z. B. entzündungshemmende, antioxidativer Stress) Aufmerksamkeit für neurologische Erkrankungen erlangt 6. Gualou Guizhi antispasmodische Granulate (GLGZ) stammt aus Zhang Zhongjings Synopsis of the Golden Chamber und ist als Krankenhauspräparatoptimiert 7. Zu seinen Bestandteilen gehören Trichosanthes kirilowii (Tianhuafen), Cinnamomum cassia (Guizhi), Paeonia lactiflora (Baishao), Glycyrrhiza uralensis (Gancao), Jujube und Ingwer8. Vorläufige Studien haben gezeigt, dass GLGZ Krämpfe nach einer Verletzung des zentralen Nervensystems lindert, indem es Neurotransmitter reguliert und Entzündungen hemmt. Seine Auswirkungen auf SCI-induzierte Spastizität und mögliche Assoziation mit PANoptose sind jedoch weiterhin ungeklärt.
Im Gegensatz zu konventionellen Einzelzielmedikamenten entspricht die multikomponentige Natur von GLGZ dem komplexen pathologischen Netzwerk von SCI – sie behandelt gleichzeitig Entzündungen, neuronalen Verlust, Myelinschäden und möglicherweise PANoptose. Diese Studie stellt die Hypothese auf, dass GLGZ die Muskelspastizität bei SCI-Ratten verbessert, indem es die pathologische Reparatur des Rückenmarks fördert (Entzündungen reduziert, Neuronen erhalten, Myelin repariert) und die PANoptose hemmt. Durch die Überprüfung dieser Hypothese wollen wir experimentelle Belege für GLGZ als vielversprechende Therapie liefern, die Symptomlinderung und pathologische Kernreparatur für SCI integriert.
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Tiermodellierung
Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des zweiten angeschlossenen Krankenhauses der Fujian-Universität für traditionelle chinesische Medizin genehmigt (Genehmigungsnummer FJPSPH-IAEC2024114) und werden gemäß den Richtlinien zum Tierschutz durchgeführt. Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 180–200 g wurden unter kontrollierten Bedingungen bei 22–26°C und 40–70 % Luftfeuchtigkeit untergebracht. SCI wurde durch die Allen-Gewichtsabfallmethode10 induziert: 3–4 % Isofluran-Inhalationsanästhesie, Mittellinienschnitt bei T10, Exposition der T9-T11-Segmente, Laminektomie (dura mater intakt) und Aufprall (2 mm Spitze, 0,5 m/s Geschwindigkeit, 1,3 mm Tiefe, 1 s Dauer). Scheinratten wurden ohne Auswirkungen laminektomie entfernt. Einschlusskriterien: BBB-Wert < 8 24 Stunden nach der Operation; Ausschlusskriterien: Infektion, Durchschnitt des Rückenmarks. Postoperative Versorgung: Analgesie (Buprenorphin, 0,1 mg/kg s.c., alle 12 Stunden 3 Tage), Blasenexpression (6 Stunden pro Woche 1 Stunde) und sterile Wundpflege. Die erfolgreichen Modellratten wurden zufällig einer Modellgruppe zugeteilt, und mit hohen (2,32 g/kg, n = 10), mittel- (1,16 g/kg, n = 10), niedrig dosierten (0,58 g/kg, n = 10) GLGZ-Gruppen.
Motorische Funktionsanalyse
Basso, Beattie und Bresnahan (BBB) erzielten Punkte blind. Die Ratten wurden 5 Minuten lang auf einem offenen Feld beobachtet, wobei sie Bewegungen der Hintergliedmaßengelenke, Gewichtstragung, Gang und Koordination bewerteten.
Scherwellenelastographie zur Messung der Steifigkeit des rectus femoris
Ein Doppler-Ultraschallsystem mit einer linearen Array-Sonde (18L6) wurde verwendet. Die Ratten wurden in seitliche Recumbency (muskelentspannt) platziert. SWE wurde durchgeführt, wobei die Sonde in einem 90°-Winkel zum Muskel positioniert war, in einer Tiefe von 1–2 cm. Die Interessenregion (ROI) wurde auf 0,5 × 0,5 cm festgelegt, und pro Messung wurden zehn Bilder aufgenommen. Der endgültige Steifigkeitswert stellte den Durchschnitt von drei gültigen Messungen dar. Die Scherwellengeschwindigkeit (SWV) wurde aufgezeichnet; Die grüne Qualitätskontrolle zeigte gültige Bilder11.
MRT-Untersuchung
MRT wurde mit einem 7,0T-Scanner mit einer T2-gewichteten, fettunterdrückten Sequenz und einer tierspezifischen Spirale durchgeführt. Die Erfassungsparameter waren wie folgt: Wiederholungszeit (TR) 3.800 ms, Echozeit (TE) 72 ms, Schnittdicke 1 mm, Voxelgröße 0,1 × 0,1 × 1 mm, Matrix 256 × 256, Sichtfeld (FOV) 25,6 × 25,6 mm, vier Signaldurchschnitte und Atemgating. Die Läsionsfläche wurde mit Bildverarbeitungssoftware gemessen.
Histologische Färbung
Die HE-Färbung erfolgte durch sequentielle Deparaffinisation, Rehydration, 5 Minuten Hämatoxylinfärbung, Spülen in fließendem Wasser, Differenzierung in 1 % Salzsäure-Ethanol für 30 Sekunden, 2 Minuten Eosinfärbung, Dehydrierung, Reinigen und Montage. Als visueller Kontrollpunkt zeigten gefärbte Schnitte blaue Kerne und rotes Zytoplasma.
Die Nissl-Färbung erfolgte durch Deparaffinisation, Rehydrierung, Inkubation in 0,1 % Toluidinblau bei 50–60 °C für 30 Minuten, gefolgt von Spülen mit destilliertem Wasser, Ethanoldifferenzierung, Dehydrierung, Klärung und Montierung. Als visueller Kontrollpunkt wurden dunkelblaue Nissl-Karosserien deutlich in der Scheingruppe beobachtet.
Die Luxol-Fast-Blue-Cresyl-Violettfärbung erfolgte durch Deparaffinisation, Rehydration, Inkubation in Luxol Fast Blue bei 60 °C für 2 Stunden, Spülen mit 95 % Ethanol, Differenzierung in Lithiumcarbonat für 30 Sekunden, gefolgt von 70 % Ethanol-Differenzierung, Cresyl-Violett-Gegenfärbung für 10 Minuten, Dehydrierung, Reinigen und Montage. Die Arbeitskonzentration von Kresylveilchen betrug 0,1 %. Als visueller Kontrollpunkt wurde in der Scheingruppe dunkelblaues Myelin beobachtet.
Eine multiplexe Immunfluoreszenzfärbung wurde beginnend mit Deparaffinisation, Rehydration und Antigenabnahme unter Verwendung eines Citratpuffers (pH 6,0) bei 95 °C für 20 Minuten durchgeführt. Die Abschnitte wurden 10 Minuten lang mit 3 % Wasserstoffperoxid behandelt, gefolgt von einer Blockierung mit 5 % BSA bei 37 °C für 1 Stunde. Primäre Antikörper wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert (ASC: 1:500; Caspase-8: 1:400; RIPK3: 1:500). Nach dem Waschen mit PBS-T (0,1 % Tween-20, 3 x 5 Min) wurden Schnitte mit HRP-markierten sekundären Antikörpern (1:1000) bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert. Anschließend wurde die Fluorochrom-Markierung angewendet: YTR520 Plus für ASC, TYR570 Plus für Caspase8 und TYR690 Plus für RIPK3 (30 Min), gefolgt von DAPI-Nuklearfärbung für 5 Minuten. Objektträger wurden montiert, und die Bildgebung erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop, das auf 500 ms Belichtung, Verstärkung 1,0, Vergrößerung ×200 mg eingestellt war, wobei die Filtersätze den jeweiligen Fluorochromen entsprachen.
Bei Xylol und Ethanol wurden alle Operationen in einer Abzugshaube durchgeführt, und während der Nutzung wurden Handschuhe und Schutzbrillen getragen. Bei Färbungsreagenzien wurde direkter Hautkontakt strikt vermieden. Alle Abfallreagenzien wurden in ausgewiesenen Behältern für gefährliche Abfälle entsorgt. Für Biohazard-Materialien wurde vor der endgültigen Entsorgung eine gründliche Autoklavensterilisation durchgeführt, um eine mögliche biologische Kontamination zu verhindern.
Statistische Analyse
Einweg-ANOVA mit LSD-Post-hoc-Test wurde für Gruppenvergleiche verwendet. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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BBB-Punktzahl
Der BBB-Wert der Scheingruppe lag bei 21,00 ± 0,00, deutlich höher als der des Modells (5,8 ± 1,1, P < 0,001). GLGZ-dosisabhängig erhöhte BBB-Werte: hohe Dosis (10,6 ± 1,3, P < 0,001), mittlere Dosis (8,5 ± 1,2, P = 0,003), niedrige Dosis (7,1 ± 1,0, P = 0,028) vs. Modell (Abbildung 1).
Scherwellen-Elastographie-Analyse der Steifheit des rectus-femoris
Die Scherwellenelastograp...
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Diese Studie bewertete systematisch die verbesserten Effekte von GLGZ auf die Muskelspastizität bei Ratten mit SCI und untersuchte deren Zusammenhang mit Neuroprotektion und PANoptose. Die Ergebnisse zeigten, dass GLGZ die BBB-Werte verbessern und Muskelsteifheit bei SCI-Ratten dosisabhängig reduzieren könnte. Die Studie ergab außerdem, dass der Wirkmechanismus von GLGZ mit Neuroprotektion, Myelinreparatur und Hemmung der PANoptose zusammenhängen könnte. Derzeit lindern klinische pharmak...
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Diese Arbeit wurde finanziert durch das Major Scientific Research Project der Fujian Provincial Health Commission (2024ZD01006), das Open Project des Clinical Research Institute 2023 (LC2023001-Institute), die Natural Science Foundation der Provinz Fujian (2024J01733), das Medical Innovation Research Project der Fujian Health Commission (2022CXA052) sowie das listenbasierte Führungs-Rekrutierungsprojekt großer Wissenschafts- und Technologie-Innovationsprojekte an der Fujian University of Traditional Chinese Medicine (XJB2022003-3).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Wasserfreies Ethanol | 240403A1 | Dehydrierung | |
| Wasserfreies Ethanol | 241101A1 | Flecken | |
| Antifluoreszenz-Attenuiertes Filmbeschichtungsmittel (mit DAPI) | MA0221 | Immunfluoreszenzfärbung | |
| ASC-Antikörper | Bs-6741R | PANoptosis-Analyse (1:300) | |
| Caspase-8-Antikörper | 13423-1-AP | PANoptosis-Analyse (1:400) | |
| Fluoreszenzmikroskop | NIKON | ECLIPSECi-L | |
| Vollautomatischer digitaler Glas-Objektträger | GCell-60 | Dia-Scanner | |
| Hämatoxylin-Eosin-Kit | R23718 | Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung | |
| Bildanalyse-Software | NIH | ImageJ 1.53k | |
| Luxol Fast Blue | R23193 | Luxol schnelle blau-cresyl-violette Färbung | |
| MRT-Scanner | Bruker | 7.0T | |
| Multiple Fluoreszenz-Färbungskit | 240522 | Immunfluoreszenzfärbung | |
| Myeloid-Färbungs-Kit | G3245 | Myeloide Färbung | |
| Neutral balsam | MB9899 | Montage nach dem Beizen | |
| Nissl-Fleckenset | R23093 | Nissl-Beizen | |
| RIPK3-Antikörper | Bs-3551R | PANoptosis-Analyse (1:400) | |
| SPSS 22.0 | Statistische Analysesoftware | ||
| Sprague-Dawley-Ratten | Hangyi-Biotechnologieunternehmen in Fuzhou | ||
| Weinsäure, Natriumtripolyphosphat | 10019418 | Flecken | |
| Ultraschallsystem | SIEMENS Acuson | Lineare Array-Sonde (18L6) | |
| Xylen | 240904A2 | Flecken |
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