Dieses experimentelle Protokoll bietet eine stabile, kosteneffiziente und effiziente Methode, die lncRNA-Knockdown mit koloniebildenden Assays kombiniert, um die Wirkung von lncRNA auf die Proliferation von Osteosarkomzellen zu quantifizieren.
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Methodenartikel
Kolonienbildungsassay zur Erkennung der Proliferationskapazität von LncRNA-Knockdown-Osteosarkomzellen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Aberrante lange nicht-kodierende RNA-Expression (lncRNAs) beeinflusst die zelluläre Proliferation von Osteosarkomzellen maßgeblich, was darauf hindeutet, dass sie als potenzielle therapeutische Ziele dienen könnten. Funktionelle Studien zu lncRNAs bleiben jedoch weitgehend theoretisch und auf einige wenige Validierungen beschränkt. Kolonienbildungs-Assays, die speziell das letztendliche proliferative Schicksal einzelzelliger Gruppen widerspiegeln, gelten als Goldstandard zur Bewertung des langfristigen proliferativen Potenzials. Hier etablierte dieses Protokoll ein zuverlässiges experimentelles Protokoll unter Verwendung von Koloniebildungs-Assays in lncRNA-Knockdown-Zellen, um die Wirkung von lncRNA auf die proliferative Kapazität von Osteosarkomzellen zu bewerten. Dieses experimentelle Protokoll bietet einen stabilen, kosteneffizienten und effizienten Test zur Bewertung der regulatorischen Auswirkungen von lncRNA auf die Proliferation von Osteosarkomzellen. Dieser Ansatz eignet sich nicht nur für die Forschung an Osteosarkomzellen, sondern dient auch als praktikables Werkzeug für die lncRNA-regulierte Zellproliferationskapazität in anderen Tumoren. Diese Studie umfasste ein detailliertes Nachweisprotokoll mit lncRNA-Knockdown- und Koloniebildungstests, mit einem Beispiel des kleinen nukleolaren RNA-Wirtsgens 6 (SNHG6) in Osteosarkomzellen (143B). Experimentelle Ergebnisse bestätigten eine effiziente Unterdrückung der SNHG6-Expression, begleitet von einer deutlichen Verringerung sowohl der Anzahl als auch der Größe der Kolonien. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SNHG6 für die Aufrechterhaltung des langfristigen proliferativen Potenzials von Osteosarkomzellen unerlässlich ist (143B).
Einleitung
Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs), definiert als Transkripte, die länger als 200 Nukleotide ohne proteinkodierendes Potenzial sind, haben sich in den letzten Jahren als wichtige Regulatoren verschiedener biologischer Prozesse etabliert 1,2. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Initiierung und Entwicklung verschiedener Krebsarten, darunter Osteosarkom, Prostatakrebs und Lungenkrebs 3,4,5. Im Osteosarkom deuten die zunehmenden Belege darauf hin, dass aberrante lange nicht-kodierende RNA (lncRNA)-Expression einen tiefgreifenden Einfluss auf die zelluläre Proliferation hat. Zum Beispiel unterdrückte das Abschalten von lncRNA POU3F3 signifikant die Proliferation und förderte die Apoptose von Osteosarkomzellen (MG63 und U2OS)6. Ebenso reduzierte die Knockdown von lncRNA HOXA-AS3 die Koloniebildung und hemmte das Wachstum in U2OS- und SW1353-Zellen7. Da unkontrollierte Proliferation ein Markenzeichen der Krebsbiologie und ein wesentlicher Faktor therapeutischer Strategien ist, bleibt die Aufklärung der lncRNA-regulierten Zellproliferation in Tumoren, insbesondere bei Osteosarkomen, von großer Bedeutung und Notwendigkeit.
Obwohl es mehrere Ansätze zur Bewertung der Zellproliferation gibt, weist jeder von ihnen inhärente Einschränkungen auf. Kolorimetrische oder metabolische Tests wie CCK-8 und MTT sind bequem, schnell und haben eine hohe Durchsatzleistung. Sie liefern jedoch hauptsächlich kurzfristige Anzeigen und werden leicht durch metabolische Schwankungen gestört und bergen zusätzliche Risiken optischer oder photochemischer Interferenz durch die verwendeten Reagenzien8. DNA-synthesebasierte Methoden, einschließlich der Einbindung von BrdU und EdU, bieten eine höhere Spezifität, beschränken sich aber auf Momentaufnahmen des S-Phasen-Eintritts, ohne langfristige proliferative Ergebnisse widerzuspiegeln 9,10. Ähnlich zeigt die Immunfärbung für Proliferationsmarker wie Ki-67 nur die sofortige Zellzyklusaktivität an und sagt die clonogene Kapazität10 nicht vorher. Echtzeitüberwachungssysteme wie RTCA ermöglichen eine kontinuierliche Wachstumskurvenanalyse mit hoher Reproduzierbarkeit, doch ihre hohen Kosten und die Beschränkung auf kurzfristige oder mittelfristige Bewertungen verringern ihre Praktikabilität11. Im Gegensatz dazu erfasst der clonogene Test eindeutig die Fähigkeit einer einzelnen Zelle, unbegrenzte Vermehrung zu durchlaufen und sichtbare Kolonien zu bilden, wodurch ihr letztendliches Schicksal direkt widerspiegelt wird. Trotz seiner arbeitsintensiven und zeitaufwändigen Tätigkeit bleibt der clonogene Test der Goldstandard zur Bewertung langfristiger proliferatives Potenzial und bietet Erkenntnisse, die durch kurzfristige oder Ersatzassays12 nicht erreichbar sind.
Hier enthält dieser Artikel ein detailliertes Nachweisprotokoll für lncRNA-Knockdown- und Koloniebildungsanalysen, mit einem Beispiel für SNHG6-Knockdown in 143B-Osteosarkomzellen. Dieser Ansatz ist nicht nur auf die Osteosarkomforschung anwendbar, sondern dient auch als praktikables Werkzeug zur Untersuchung der lncRNA-vermittelten Proliferation in anderen Tumoren.
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Protokoll
Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Plasmidtransfektion
- Samen 5 × 105 143B-Zellen pro 10 cm Kulturschal (insgesamt zwei Schalen), die Zellen in einem Komplettmedium (DMEM + 10 % FBS) bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator kultivieren.
- Stellen Sie Transfektionsreagenzien 24 Stunden später vor, darunter Plasmide (shNC und shSNHG6), PEI und Opti-MEM.
HINWEIS: Vortex verwenden und sicherstellen, dass alle vor der Nutzung auf Raumtemperatur ausgeglichen sind. - Entnehmen Sie vier 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhren, beschriften Sie die Plasmide (shNC und shSNHG6) und PEI (zwei Röhren) mit einem Markerstift.
- Fügen Sie jedem Rohr 500 μL Opti-MEM hinzu.
- Gib 10 μg Plasmide in das Plasmidrohr (shNC oder shSNHG6) und 30 μL PEI (1μg/μL) in jedes PEI-Rohr.
- Sanft auf- und abrühren, 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
- Kombinieren Sie das Plasmidrohr und das PEI-Rohr, mischen Sie es vorsichtig und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
- Entnehmen Sie 143B-Zellen aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Kulturmedium vorsichtig. Gib jedem Gericht 7 ml serumfreies Medium hinzu. Beschrifte die Schalen, um die hinzuzufügenden Plasmide anzuzeigen (143B shNC oder 143B shSNHG6).
- Geben Sie die vorgefertigte Transfektionsmischung tropfenweise zur entsprechenden Kulturschale.
HINWEIS: Gib die Mischung langsam mit einer Pipette in einer kreisenden Bewegung ein und dosiere sie gleichmäßig vom äußeren Rand bis zur Mitte der Schale. Inkubieren Sie bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 %CO2. - Entsorge den Supernatant 8–12 Stunden später und gib 10 ml vollständiges DMEM-Medium zu jeder 10 cm großen Kulturschale. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5%igen CO2-Inkubator.
- Beobachten Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 72 Stunden, nachdem der Supernatant entsorgt und durch vollständiges DMEM-Medium ersetzt wurde.
2. Koloniebildungstest
- Entfernen Sie das Medium aus der 10 cm großen Kulturschale (shNC und shSNHG6), fügen Sie 1,5 ml Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen zu verdauen, pipettieren Sie sie vorsichtig und geben Sie dann 5 ml vollständiges Medium dazu, um die Verdauung zu beenden.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-mL-Mikrozentrifugenrohr.
- Entfernen Sie 20 μL Zellsuspension und zählen Sie die Zellnummern.
HINWEIS: Die Zellzählung muss mehrfach durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Zellnummern in der shNC-Gruppe und der shSNHG6-Gruppe konsistent sind. Hier sammeln wir 3 × 105Zellen zur RT-PCR-Verifikation der SNHG6-Knockdown-Effizienz. - Samen 2 × 103 Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte. Fügen Sie vollständiges DMEM-Medium zu einem Endvolumen von 2 ml hinzu und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5%igen CO-2-Inkubator.
HINWEIS: Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch ein frisches, vollständiges DMEM-Medium. - Überwachen Sie täglich die Koloniebildung.
HINWEIS: Beenden Sie die Kultur, wenn die meisten Kolonien der Kontrollgruppe (shNC) ≥50 Zellen enthalten, oder nach 10–14 Tagen Brützeit, je nachdem, was zuerst eintritt. - Nimm Zellen aus dem Inkubator und entsorge das Supernatant.
- Wasche die Zellen zweimal mit 1 ml PBS pro Brunnen und entsorge das PBS nach jedem Waschen.
- Zellen mit 1 ml 10%iger Formalinlösung für 15 Minuten fixieren und dann die 10%ige Formalinlösung entsorgen.
- Wasche die Zellen zweimal mit 1 ml PBS pro Brunnen und entsorge das PBS nach jedem Waschen.
- Färben Sie die Zellen mit 1 ml 0,5 % Kristallviolett-Färbungslösung für 10–30 Minuten und entsorgen Sie dann die Färbungslösung.
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit langsam fließendem Leitungswasser.
- Lufttrocknen Zellen bei Raumtemperatur.
- Fotografieren Sie mit einer Kamera.
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Ergebnisse
Um die Wirkung von lncRNA SNHG6 auf die proliferative Kapazität von Osteosarkomzellen zu bewerten, etablierten wir erfolgreich ein plasmidvermitteltes Knockdown-System und führten Koloniebildungstests durch. Der experimentelle Arbeitsablauf umfasste die Plasmidtransfektion von 143B-Zellen und den Koloniebildungstest (Abbildung 1).
Die Transfektionseffizienz der 143B-Zellen wurde durch eine Fluoreszenzmikroskopie 72 Stunden nach de...
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Diskussion
Die therapeutische Zielsetzung krebsassoziierter lncRNAs stellt neben der Nutzung ihres diagnostischen Nutzens als Biomarker einen aufkommenden Ansatz im Krebsmanagement dar. Die Definition der Rollen von lncRNAs bei der Osteosarkompathogenese ist entscheidend für die Weiterentwicklung ihrer Diagnose, Therapie und Prognose.
Entscheidende Schritte müssen befolgt werden, um den Erfolg dieses Tests sicherzustellen. Erstens ist die Feststellung einer Einzelzellsus...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 und 82205145) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL MIKRORÖHREN | Merck | AXYMCT150C | |
| 10 % neutrales gepuffertes Formalin | VICTREX | 5205000 | |
| 100 - 1000 & mu; L Erweiterte Graduierte Blaue Spitzen | Shanghai BioScience Co., Ltd | BS10401ML | |
| 100mm Zellkulturschalenlabor | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd | 704001 | |
| 143B | ATCC | ATCC CRL-8303TM | |
| 15-mL Zentrifugenröhre | Shanghai BioScience Co., Ltd | BL2002150 | |
| 6-Brunnen-Zellkulturplatte | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd | 703001 | |
| CO2 Inkubator | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | 300583057 | |
| Crystal Violet | TCI Shanghai | C0428 | |
| DMEM-Medium | WISENT CORPORATION | 319-005-CL | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000233 | |
| FBS – Überlegene Qualität | WISENT CORPORATION | 086-150 | |
| Mark-Stift | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| PASTEUR PIPETTE | Labgic | BS-XG-O3L | |
| PBS-Puffer (Trockenpulver) | Labgic | BL601A | |
| PEI | Polywissenschaften | 24765 | |
| Pipettenspitzen | Merck | AXYT200Y | |
| TrypLE-Expressenzym | Gibco | 12604021 | |
| Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 |
Referenzen
- Chen, N., et al. IAV inhibits the host antiviral defense mediated by LncRNA-LRIR to enhance viral replication. Int J Biol Macromol. 322 (Pt 1), 146665(2025).
- Zhu, J., Mo, Y. Y., Peng, W. X. RNA binding protein-mediated competing endogenous RNA mechanism in cancer. Gene. 963, 149606(2025).
- Zhang, Y., et al. KIAA1429-mediated ZFPM2-AS1 m(6)A modification promotes the proliferation, migration and invasion of osteosarcoma cells. Oncol Lett. 30 (4), 453(2025).
- Oh, M., Kadam, R. N., Charania, Z. S., Somarowthu, S. LncRNA SChLAP1 promotes cancer cell proliferation and invasion via its distinct structural domains and conserved regions. J Mol Biol. 437 (19), 169350(2025).
- Wang, G., et al. TBX5-AS1 induces ER stress and suppresses lung cancer growth and tumor stemness via the miR-494-3p/ATF6 axis. Cell Stress Chaperones. 30 (6), 100113(2025).
- Xu, S., et al. lncRNA POU3F3 promotes osteosarcoma progression through GPX4-modulated ferroptosis by interaction with IGF2BP2 to facilitate NRF2 mRNA stability. Genes Dis. 12 (5), 101439(2025).
- Li, R., et al. LncRNA HOXA-AS3 promotes cell proliferation and invasion via targeting miR-218-5p/FOXP1 axis in osteosarcoma. Sci Rep. 14 (1), 16581(2024).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, Limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), (2021).
- Harris, L., Zalucki, O., Piper, M. BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations. J Mol Histol. 49 (3), 229-234 (2018).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. J Invest Dermatol. 136 (1), e1-e7 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicol Rep. 7, 335-344 (2020).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Brix, N., Samaga, D., Belka, C., Zitzelsberger, H., Lauber, K. Analysis of clonogenic growth in vitro. Nat Protoc. 16 (11), 4963-4991 (2021).
- Rajendran, V., Jain, M. V. In vitro tumorigenic assay: Colony forming assay for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 1692, 89-95 (2018).
- Guzman, C., Bagga, M., Kaur, A., Westermarck, J., Abankwa, D. ColonyArea: An ImageJ plugin to automatically quantify colony formation in clonogenic assays. PLoS One. 9 (3), e92444(2014).
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Nachdrucke und Genehmigungen
