Methodenartikel

Bewertung des Elektroakupunktureffekts auf den zerebralen Blutfluss bei APP/PS1-Mäusen mittels der Laser-Speckle-Technik

DOI:

10.3791/69915

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13. Februar 2026

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1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, das sich auf die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung konzentriert, um den zerebralen Blutfluss zu quantifizieren, kombiniert mit dem Morris Water Maze, um die Auswirkungen der Elektroakupunktur bei APP/PS1 (AD-Modell)-Mäusen zu bewerten, was für die AD-Forschung im zerebrovaskulären Bereich wertvoll ist.

Zusammenfassung

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Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist gekennzeichnet durch fortschreitenden kognitiven Abbau und zerebrovaskuläre Dysfunktion, einschließlich verminderter zerebraler Durchblutung (CBF) und einer Störung der neurovaskulären Abteilung. Die Elektroakupunktur (EA) hat Potenzial zur Verbesserung neurologischer Funktionen gezeigt, ihr Mechanismus könnte mit der Regulation der CBF zusammenhängen. Die Laser-Speckle-Bildgebung ist eine Weitfeldmethode zur Echtzeitbeurteilung von CBF und kann Veränderungen der Gehirnblutperfusion präzise bewerten. In diesem Experiment beobachteten wir die Auswirkungen der Elektroakupunktur auf CBF und kognitive Fähigkeiten bei AD-Modellmäusen (APP/PS1-transgene Mäuse). Die Blutdurchströmung der mittleren Großhirnarterie und ihrer Zweiggefäße bei Mäusen wurde mittels Laser-Speckle-Bildgebung beobachtet. Die räumliche kognitive Funktion von Mäusen wurde mit dem Morris-Wasserlabyrinth bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass EA die kognitive Funktion von APP/PS1-Mäusen verbessern konnte, und die Fluchtlatenz war im Morris-Wasserlabyrinthtest signifikant verringert (P<0,05). Darüber hinaus bestätigte die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI) eine signifikante zerebrale Hypoperfusion bei AD-Modellmäusen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen (P < 0,05), und wichtig ist, dass die EA-Behandlung einen statistisch signifikanten Anstieg der CBF (P < 0,05 induzierte, wodurch die zerebrale Hypoperfusion bei AD-Mäusen umgekehrt wurde. Die Laser-Speckle-Bildgebung ist eine Visualisierungstechnik zur Bewertung von durch EA induzierten zerebrovaskulären Verbesserungen. Diese Ergebnisse unterstützen EA als potenzielle Zusatztherapie für AD, indem sie auf zerebrovaskuläre Dysfunktion abzielt.

Einleitung

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Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die durch fortschreitende kognitive Beeinträchtigung und Gedächtnisverlust gekennzeichnet ist. Es verarbeitet die pathologischen Merkmale der Ablagerung von extrazellulären Beta-Amyloid-(Aβ)-Plaques, intrazellulärem neurofibrillärem Tangle (NFTs) und neuronalem Verlust1. Obwohl diese klassischen Merkmale im Mittelpunkt der therapeutischen Forschung standen, unterstreicht die wachsende Evidenz die entscheidende Rolle des verminderten zerebralen Blutflusses (CBF) bei der Entstehung und dem Fortschreiten von AD2. Die Reduktion der CBF tritt im frühen Stadium des AD-Auftretens auf und ist mit der Schwere der kognitiven Dysfunktion verbunden3. Daher ist die Behandlungsstrategie zur Verbesserung des zerebrovaskulären Schadens eine wirksame Methode, um AD-Symptome zu lindern und den Verlauf der Krankheit zu verbessern.

Die Elektroakupunktur (EA), eine moderne Technik, die traditionelle Akupunktur mit elektrischer Stimulation kombiniert, hat Potenzial zur Verbesserung der kognitiven Funktion bei AD gezeigt. Studien deuten darauf hin, dass EA ihre positiven Effekte durch mehrere Mechanismen ausüben kann, wie etwa die Verringerung der Aβ-Ablagerung, die Abschwächung von Neuroentzündungen und die Förderung der synaptischen Plastizität4. Bemerkenswert ist, dass zunehmend spekuliert wird, dass die neuroprotektiven Effekte von EA eng mit seiner Fähigkeit zusammenhängen, CBF5 zu modulieren. Direkte, Echtzeit-Beweise, die die Auswirkungen von EA auf die zerebrale Hämodynamik in AD-Modellen zeigen, bleiben jedoch begrenzt. Das Fehlen solcher Belege erschwert ein umfassendes Verständnis darüber, wie EA die Gehirnfunktion verbessert.

Technologische Fortschritte in der optischen Bildgebung haben leistungsstarke Werkzeuge zur Untersuchung der zerebralen Hämodynamik bereitgestellt. Als schnelle, weitfeldige optische Technik liefert LSCI eine hohe raumzeitliche Auflösung zur Visualisierung volumenintegrierter Gewebe-Blutflusskarten6 und ermöglicht so eine Echtzeitüberwachung der elektroakupunkturinduzierten Perfusionsdynamik. Obwohl eine Schädelexposition für optimalen optischen Zugang erforderlich ist, vermeidet LSCI invasive Gewebepenetration. LSCI wurde in den 1990er Jahren eingeführt und in den letzten Jahrzehnten in der Neurowissenschaft weit verbreiteteingesetzt. Wie alle Bildgebenden Techniken hat LSCI inhärente Einschränkungen: Die optische Penetrationstiefe ist begrenzt, begünstigt oberflächliche kortikale Gefäße und begrenzt den Zugang zu tiefen Hirnregionen (z. B. Hippocampus, Basalganglien), und sie quantifiziert den relativen Blutfluss (Perfusionseinheiten) statt absoluter CBF-Werte, wobei die Genauigkeit subtil durch die vaskuläre Morphologie und die optische Streuung des Gewebesbeeinflusst wird 8,9. Diese Einschränkungen untergraben jedoch nicht den Nutzen von LSCI, sondern definieren seine spezialisierte Anwendung in der Echtzeitbewertung des oberflächlichen kortikalen Blutflusses. Für unsere Studie, die sich auf EA-induzierte kortikale Perfusionsänderungen konzentriert, liefert LSCI zuverlässige, umsetzbare Daten. Konkret haben wir ein standardisiertes LSCI-Protokoll mit gezielter ROI-Definition und optimierten Parametern zur Quantifizierung von CBF bei APP/PS1-Mäusen etabliert, ergänzt durch Morris Water Maze-Tests, um zerebrovaskuläre Verbesserungen mit kognitiven Ergebnissen zu verknüpfen.

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Protokoll

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Dieses Protokoll wurde vom Tierethikkomitee der Universität für Chinesische Medizin in Peking (BUCM20250708-005 genehmigt und entsprach allen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren Chinas.

1. Vorbereitung

  1. In diesem Experiment wurden zwölf 6 Monate alte männliche APP/PS1-Mäuse und sechs 6 Monate alte männliche C57bl/6-Mäuse verwendet.
  2. Alle Mäuse wurden im Tierversuchszentrum der Universität für Chinesische Medizin in Peking untergebracht, mit drei Mäusen pro Käfig. Sie hatten freien Zugang zu sterilem Trinkwasser und einer Standard-Pellet-Diät.
  3. Die Wohnumgebung wurde in einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus aufrechterhalten, wobei die Umgebungstemperatur bei 23 ± 2 °C kontrolliert wurde.

2. Tiergruppierung und Interventionen

  1. Zufällig werden zwölf 6 Monate alte männliche APP/PS1-Mäuse (Gewicht 27,88 g ± 0,48 g) zwei Versuchsgruppen (n = 6/) zugeteilt: der Alzheimer-Modellgruppe (AD) und der Elektroakupunktur-(EA)-Behandlungsgruppe.
  2. Verwenden Sie sechs 6 Monate alte männliche C57BL/6 Mäuse (Gewicht 29,90 g ± 0,81 g) als Wildtyp-(WT-)Gruppe.
  3. Für die WT-Kontroll- und AD-Modellgruppen werden die Mäuse vorsichtig in den gut belüfteten Maus-Restrainern fixiert und keine experimentellen Interventionen durchgeführt.
  4. Für die EA-Behandlungsgruppe werden die Mäuse vorsichtig in derselben Mausfixiergruppe wie bei den Modellgruppen WT Control und AD eingesetzt, was übermäßige Bewegungen begrenzt und gleichzeitig eine ungehinderte Atmung gewährleistet. Unter dieser standardisierten Fixierungsbedingung werden die einweg-sterilen Akupunkturnadeln (0,25 mm × 13 mm) in die Baihui (GV20) und Yintang (GV29) Akupunkturpunkte (Abbildung 1A) am Kopf eingeführt, die auf den Nasenbereich gerichtet sind, mit einer konstanten Tiefe von 2–3 mm. Verbinden Sie die positiven und negativen Anschlüsse des EA-Geräts jeweils mit diesen beiden Akupunktpunkten und liefern Sie eine Stimulation für 15 Minuten (Abbildung 1B). Konfigurieren Sie die Stimulationsparameter als ein dispersionsdichtes Wellenmuster mit einer Intensität von 0,1 mA und einer Frequenz von 2 Hz.
  5. Die Interventionen werden jeder Gruppe alle 48 Stunden durchgeführt, wobei jede Sitzung 15 Minuten dauert, insgesamt 30 Tage.
    HINWEIS: Führen Sie Akupunktur-Auswahl-, Lokalisierungs- und Nadelverfahren gemäß T/CAAM 0002-2020 durch: Namen und Orte häufig verwendeter Akupunkturpunkte für Labortiere Teil 3: Mäuse10, ein Standard der China Association for Acupuncture and Moxibustion am 15. Mai 2020.

3. MWM-Test

HINWEIS: 24 Stunden nach dem 30-tägigen Interventionszeitraum unterzogen alle Mäuse der drei Versuchsgruppen dem Morris Water Maze (MWM)-Test, der sowohl die Hidden Platform (Place Navigation) Studie als auch die Sonde-Studie11,12 umfasste. Führen Sie vor formellen Tests eine eintägige Eingewöhnungsphase ein, um Stress zu minimieren und es den Mäusen zu ermöglichen, sich an den Versuchsraum, das MWM-Gerät und die Handhabungsverfahren zu gewöhnen.

  1. Vorbereitungsverfahren
    1. Positionieren Sie das MWM-Gerät und das zugehörige Signalerfassungs-/Verarbeitungssystem in einem schallgedämpften Versuchsraum. Halten Sie die Umgebungstemperatur der Testumgebung bei etwa 25 °C und standardisieren Sie die Lichtverhältnisse wie folgt: Vier 60-W-LED-Röhrenlampen über den vier Quadranten des Labyrinths in einer Höhe montieren, die der Deckenkamera entgeht. Undurchsichtige Vorhänge umgaben das gesamte Testgelände, um externe Umwelteinflüsse zu blockieren und unbeabsichtigte räumliche Hinweise daran zu hindern, die Navigation der Mäuse zu beeinträchtigen.
    2. Stelle einen runden weißen Tank (90 cm Durchmesser × 50 cm Höhe) in die Mitte des MWM-Setups. Verbinden Sie eine an der Decke montierte Videokamera mit einem automatisierten Tracking-System und Rekorder für kontinuierliche Datenerfassung während der gesamten Tests.
    3. Teilen Sie den Tank in vier gleich große Bereiche, die Nord (N), Süd (S), Ost (Ost) und West (W) markieren, und weiter in vier kongruente Quadranten segmentieren, darunter Nordost (NE), Nordwest (NW), Südwest (SW) und Südost (SE).
    4. An der Außenwand jedes Quadranten werden klar geformte visuelle Formen (Quadrat, Dreieck und Kreis) angebracht, die innerhalb der Sichtlinie der Mäuse als räumliche Bezugspunkte dienen.
    5. Füllen Sie den Tank mit 30 cm Wasser, das bei 24 ± 1 °C gehalten wird, mit einem elektrischen Heizer; Fügen Sie weißes essbares Pigment hinzu, um das Wasser undurchsichtig zu machen.
  2. Versuch mit versteckter Plattform
    1. Für die Dauer dieses Versuchs sollte eine untergetauchte Plattform im Südost-Quadranten befestigt werden.
    2. Lassen Sie jede Maus zufällig aus drei alternativen Quadranten (NE, NW, SW) in den Pool ein, wobei die Anfangsausrichtung zur Beckenwand zeigt, um Konsistenz zu gewährleisten.
    3. Gib jeder Maus maximal 60 Sekunden, um die versteckte Plattform unabhängig voneinander zu finden.
    4. Erfassen Sie die Fluchtlatenz (die Zeit von der Freigabe bis zum Aufstieg der Plattform) für jede Studie, um räumliches Lernen zu bewerten.
      HINWEIS: Jede Maus absolvierte täglich drei Versuche über fünf aufeinanderfolgende Tage. Wenn eine Maus die Plattform innerhalb von 60 Sekunden nicht fand, wurde sie sanft zur Plattform geführt und dort 10 Sekunden verweilt, um das räumliche Gedächtnis zu verstärken, bevor der Versuch abgeschlossen wurde.
  3. Untersuchungsprozess
    1. Entfernen Sie die Plattform.
    2. Lassen Sie jede Maus einmal in das Becken mit Blick auf die Beckenwand los und lassen Sie 60 Sekunden uneingeschränktes Schwimmen zu.
    3. Zeichnen Sie wichtige Ergebnismaße auf: durchschnittliche Schwimmgeschwindigkeit und Anzahl der Übergänge über den ehemaligen Plattformstandort.
  4. Pflege nach dem Test
    1. Nach jeder Montagssitzung trocknen Sie die Mäuse gründlich mit weichen Handtüchern und wärmen Sie sie vorsichtig mit einem elektrischen Heizgerät, um Unterkühlung zu verhindern.

4. Laser-Speckle-Kontrastbildgebung

  1. Wählen Sie zufällig drei Mäuse aus jeder Gruppe aus und überwachen Sie ihre CBF in Echtzeit und im vollen Feld mit dem LSCI-System.
  2. Tiervorbereitung: Führen Sie alle Tieroperationen unter Narkose durch. Betäuben Mäuse intraperitoneal mit einer intraperitonealen Injektion von 1,25 % Tribromoethanol (0,02 mL/g), um eine kontinuierliche spontane Atmung zu gewährleisten, und setzen sie auf eine horizontale Operationsplatte. Setze betäubte Mäuse auf ein thermostatisch gesteuertes Heizkissen, das bei 37 °C gehalten wird, um die Körperkerntemperatur zu stabilisieren. Rasieren Sie die Kopfhaut und analysieren Sie sorgfältig die darunterliegenden Muskeln/Meningen, um den Schädel freizulegen; Halten Sie die freiliegende Schädeloberfläche während des gesamten Eingriffs feucht mit 0,9 % steriler physiologischer Kochsalzlösung, um Austrocknung zu verhindern.
  3. Bildaufbau: Positionieren Sie den Scankopf des Systems senkrecht zum freiliegenden Schädelfenster in einem festen Abstand von 20 cm. Aktivieren Sie die Autofokus- und Auto-Gain-Funktionen zur Optimierung der Bildschärfe und des Kontrasts, wobei die Verstärkungswerte in allen Experimenten automatisch im Bereich von 140–160 gehalten werden. Konfigurieren Sie zusätzliche standardisierte Bildparameter wie folgt: Belichtungszeit = 20 ms, Zeitkonstante = 1,0 s, Betriebsmodus = Zeit, Filter = 250 Bilder, Abtastintervall = 5000 ms und Bildauflösung = 1032 × 772.
  4. Datenerfassung: Aufnehmen Sie kontinuierliche Speckle-Bilder mit einer Abtastrate von 25 Hz und synchronisieren Sie die Sammlung mit den vorkonfigurierten zeitlichen und Filterparametern.
  5. ROI-Analyse: Verwenden Sie die Analysesoftware, um Interessenbereiche (ROIs) über dem präfrontalen Kortex zu definieren, wobei insbesondere die vorderen und mittleren Hirnarterienterritorien innerhalb dieses kortikalen Bereichs gezielt berücksichtigt werden. Definieren Sie ROIs über diese vaskulären Regionen und extrahieren Sie aus jedem ROI mittlere Flusswerte (ausgedrückt in Perfusionseinheiten) für den anschließenden statistischen Vergleich.

5. Statistische Analyse

  1. Führen Sie statistische Analysen mit SPSS 27.0 durch.
  2. Analysieren Sie Gruppenunterschiede in der verborgenen Plattform, die Ergebnisse der Probe-Studien und CBF wurden mit dem T-Test des Schülers analysiert. Definiere statistische Signifikanz als P < 0,05 und setze die hohe statistische Signifikanz bei P < 0,01.

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Ergebnisse

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Auswirkungen von EA auf räumliches Lernen und Gedächtnis bei AD-Modellmäusen

Die Ergebnisse des Morris-Wasserlabyrinthtests sind in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 2A zeigt die Fluchtlatenz während des Hidden Platform-Tests über fünf Tage. Die Fluchtlatenz der AD-Gruppe zeigte einen schwankenden Trend, während die WT- und EA-Gruppen stetig abnahmen. Die Fluchtlatenz der AD-Gruppe w...

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Diskussion

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Die vorliegende Studie zeigt, dass die langfristige EA-Intervention bei Baihui (GV20) und Yintang (GV29) Akupunkten räumliche Lerndefizite bei APP/PS1-transgenen Mäusen signifikant mildert, was sich in der verkürzten Fluchtlatenz im Morris Water Maze Hidden Platform Test widerspiegelt. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Berichten überein, dass EA die kognitive Funktion in verschiedenen AD-Modellen durch Mechanismen wie reduzierte Aβ-Ablagerungen und abgeschwächte Neuroinflammation

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde vom Scientific Research Cultivation Project der School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina der Beijing University of Chinese Medicine unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Akupunkturnadel(Beijing Zhongyan Taihe Medicine Company, Ltd., China0,25 mm & mal; 13 mmAkupunkturnadel
Laser-Speckle-KontrastbildgebungssystemGen& Ich bin wissenschaftlich. Ltd.MoorFLPI-2
Maus-ZurückhalterHengtai LaborausrüstungszentrumHT-A2
TribromoethanolNanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd. M2910Anästhesie

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Laser Speckle ImagingAlzheimer Krankheitzerebrovaskul re Dysfunktionkognitive FunktionMorris Wasserlabyrinthneurovaskul re Einheitzerebrale Hypoperfusion

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