Polyacrylamid-ZrOH-Hydrogele für räumlich aufgelöste Probenahmen von Carboxylaten, die von Wurzeln im Boden ausgeschieden werden

Summary

In diesem Protokoll erläutern wir die Verwendung von Polyacrylamid-Zirkoniumhydroxid-Hydrogelen (ZrOH-Hydrogelen) als nicht-destruktive, in-situ Methode zur Entnahme von wurzelexudierten Carboxylaten aus intakten, bodengewachsenen Wurzeln in verschiedenen Entwicklungsstadien der Ernte. Es skizziert außerdem die anschließende lokalisierte Kartierung und Quantifizierung dieser Carboxylate mittels Ionenchromatographie-Massenspektrometrie (IC-MS).

Abstract

Die Probenahme und zuverlässige Quantifizierung von Wurzelexsudaten aus ungestörten, im Boden wachsenden Pflanzenwurzeln bleiben eine Herausforderung. Wir haben weiter eine zerstörungsfreie Methode zur Probenahme, 2D-Kartierung und Quantifizierung von sieben Carboxylaten (Aconitat, Citrat, Fumarat, Laktat, Malat, Oxalat, Succinat), die aus in Rhizoboxen gezüchteten Pflanzenwurzeln ausgeschieden werden, entwickelt. Die hier beschriebene Methode verwendet Polyacrylamid-Zirkoniumhydroxid-Hydrogele (ZrOH-Hydrogele), die alle getesteten Carboxylate aufnehmen und mit einer Effizienz von 95,3 % ± 3,12 % bis 111 % ± 1,99 % eluiert werden können. Die ZrOH-Hydrogele haben eine hohe Bindungskapazität für Carboxylate von bis zu 1,82 μmol cm^², abhängig vom pH-Wert der Lösung und der Carboxylatarten, eine Konzentration, die höher ist als die üblicherweise in der Rhizosphäre vorhandene. Darüber hinaus bleiben die gebundenen Carboxylate auf den ZrOH-Hydrogelen stabil und können vor der Analyse mehrere Wochen bei 4 °C gelagert werden. Für die Anwendung werden Pflanzen in bodengefüllten Rhizoboxen kultiviert, die einen einfachen Zugang mit minimaler Störung des Wurzelsystems ermöglichen. Um von Wurzeln freigesetzte Carboxylate zu probieren, werden ZrOH-Hydrogele vorsichtig 24 Stunden lang auf das relevante Gebiet angewendet. Nach der Gewinnung der ZrOH-Hydrogele werden sie zur Kartierung geschnitten und die Gelstücke für eine anschließende Carboxylatanalyse (z. B. mittels Ionenchromatographie-Massenspektrometrie) elutiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ZrOH-Hydrogele wirksam sind, um Carboxylatkonzentrationen in der Rhizosphäre zu erfassen und zu bestimmen. Die Neuheit dieser Methode liegt in ihrer Fähigkeit, Wurzelexsudas aus intakten, bodengezüchteten Pflanzenwurzeln zu beproben, sowie in der Möglichkeit zeitaufgelöster Probenahmen im Vergleich zu traditionellen Methoden (Boden-Hydroponik-Hybridmethode), die oft zerstörerisch sind und nur eine Einzelprobenahme erlauben. Am wichtigsten ist, dass sie die Erzeugung quantitativer, hochauflösender, millimetermaßstäblicher 2D-Bilder ermöglicht, was die Visualisierung der Carboxylatexudation entlang der Wurzelachse und deren räumlicher Verteilung innerhalb der Rhizosphäre erleichtert. Darüber hinaus erleichtert diese Methode die Probenahme von Wurzelexsudaten in verschiedenen Wachstumsstadien während des Wachstumszyklus.

Introduction

Pflanzenwurzeln geben verschiedene Verbindungen in die Rhizosphäre ab und formen so ihre physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften¹. Wenn Pflanzen abiotischem und biotischem Stress ausgesetzt sind, wird die Wurzelexudation besonders ausgelöst. Wurzelexsude können tatsächlich die Verfügbarkeit und Mobilisierung von Nährstoffen/Metallen, mikrobielle Gemeinschaften und Aktivität, die Stabilität der Bodenaggregate sowie die Abwehr von Pflanzen gegen Krankheitserreger direkt oder indirekt^{beeinflussen 1,2,3}. Zu den wichtigsten Wurzelexsudaten gehören Carboxylate, da sie bei der Nährstofflösung (einschließlich Phosphor (P), Eisen (Fe), Kupfer (Cu) und Zink (Zn)), ihrer Schwermetalltoleranz und der Verbesserung nützlicher Mikroorganismen in der Rhizosphäre 2,3,4,5 spielen.

Bemerkenswert sind die exudierten Carboxylate wie Citrat, Laktat, Oxalat, Malat, Succinat und Fumarat ^6,7,8. So spielt Citrat beispielsweise eine entscheidende Rolle bei der P-Aufnahme, indem es P-gebundenes an Fe oder Aluminium(Al) (Hydr)oxide ^7,9 mobilisiert. Die genaue Probenahme und Quantifizierung von Wurzelexsudien aus bodengezüchteten Pflanzen bleibt jedoch eine experimentelle Herausforderung, hauptsächlich aufgrund der Schwierigkeiten, physischen Zugang zu ungestörten bodengewachsenen Wurzelsystemen zu erhalten und Wurzelexsudatproben^10,11 zu erhalten. Zusätzlich unterziehen sich die exudierten Verbindungen rasch mikrobieller Abbau (innerhalb von Minuten bis Stunden)¹² und adsorbieren stark an Bodenmineraloberflächen ^1,10. Eine weitere Herausforderung bei Wurzelexsudationsstudien ist die Überwachung der Exsudation über die Zeit, da die meisten Sammelmethoden Wurzeln stören oder die Ernte von bodengezüchteten Pflanzen erfordern, was es erschwert, dieselbe Wurzel erneut zu beurteilen ^1,11. Daher erfordern genaue Probenahmen, Quantifizierung und Überwachung der Wurzelexsudate eine Technik, die räumliche Variationen erfasst und wiederholte Probenahmen während^{des Pflanzenwachstums} ermöglicht.

In der aktuellen Studie präsentieren wir eine zerstörungsfreie In-situ-Methode, die ursprünglich von Tiziani et ^al.12 für Citrat entwickelt wurde, inzwischen weiter verfeinert und für die Probenahme, präzise räumliche Lokalisierung und Quantifizierung von sechs zusätzlichen Carboxylaten (Aconitat, Fumarat, Laktat, Malat, Oxalat und Succinat), die aus intakten Pflanzenwurzeln in Rhizoboxen ausgeschieden werden. Die Methode verwendet Zirkoniumhydroxid-basierte Polyacrylamid-Hydrogele (ZrOH-Hydrogele) zur Probenahme von Wurzelexsuden¹³. ZrOH-Hydrogele zeigen eine starke Bindungsfähigkeit für Anionen (einschließlich Carboxylate), die leicht eluiert werden können 12,13,14. Die ZrOH-Hydrogele (1) ermöglichen es, Wurzelcarboxylate aus bodengezüchteten Pflanzenwurzeln zu entnehmen, indem das Hydrogel einfach mit minimaler Störung auf das Wurzelsystem aufgetragen wird, (2) bieten einen effektiven Schutz gebundener Carboxylate gegen mikrobielle Mineralisierung für mindestens 6 Wochen, (3) die räumliche Verteilung der Carboxylate in der Rhizosphäre bleibt bei der Bindung an das Gel erhalten, und (4) ermöglichen eine mm-dimensionale 2D-Kartierung von Carboxylaten ¹².

Bestehende Methoden zur Probenahme von Wurzelexsudaten werden entweder als bodenbasierte Techniken von bodengezüchteten Pflanzen (z. B. Wurzelwäsche oder Boden-Hydroponik-Hybrid, Soil-Wurzel-Exsudatsammler (SOIL-REC)-Geräte, Mikrosaugnäpfe, Filterpapier/Agar-Blätter, Exudationsfallen und die RHIZOtest-Technik) oder hydroponische Exsudatprobennahmemethoden klassifiziert. Wurzelwäsche oder Boden-hydroponische Hybridmethode beinhaltet sorgfältige Entfernung der gesamten Pflanze aus dem Boden, das Waschen des Wurzelsystems und das anschließende Eintauchen in die Probelösung, um Wurzelexsude¹⁵ zu sammeln. Dies ist die am häufigsten verwendete Methode zur Probenahme von Exsuden aus bodengezüchteten Pflanzen aufgrund ihrer Einfachheit. Das Entfernen der Wurzeln aus dem Boden birgt jedoch das Risiko, Wurzelhaare und feinere Wurzeln zu verlieren. Darüber hinaus ist eine gründliche Reinigung der Wurzeln erforderlich, was die Wurzeln beschädigen, die Qualität und Menge der Wurzelexsudate beeinträchtigen und zeitauflösende Probenahmen ^{8,11 verhindern} kann. Die SOIL-REC-Methode beinhaltet das Züchten von Pflanzen in einem speziell entwickelten Rhizobox-System, bei dem die Wurzeln zwischen zwei porösen Nylonnetzen (≤ 30 μm) wachsen, und das Sammeln von Wurzelexsudaten mit einem Wurzelexsudat-Sammelwerkzeug^16,17. Dieser Ansatz erhält das Wurzelsystem, minimiert Bodenverschmutzungen und ermöglicht wiederholte Sammlung von Wurzelexsudaten. Allerdings ist es kompliziert (nur mit wenigen Replikaten), es ist eine höhere Verdünnung von Exsudaten aus größeren Volumen, die für das Sampling verwendet werden, und es bedarf weiterhin Optimierung, da die Replikabilität herausfordernd ist und es große Unterschiede zwischen den⁸. Replikaten gibt.

Das Auftragen kleiner Harzstücke, Agar-Gel-Blätter oder Filterpapier, das sich mit der umgebenden Lösung ausgleichen kann, oder die Adsorbierung von Wurzelsegmenten von Interesse zugänglicher intakter, bodengewachsener Wurzeln (z. B. mit Rhizoboxen oder Wurzelfenstern)^18,19. Diese Methode ermöglicht zeitauflösende Probenahmen und teilweise Messung lokaler Exsudatzusammensetzung, allerdings mit geringer räumlicher Auflösung. Andererseits ist sie anfällig für Artefakte aus mikrobieller Mineralisation und umständlich zu handhaben. Ebenso werden Exsudatfallen verwendet, um Wurzelexsudas aus einzelnen Wurzelsegmenten zu probieren, wobei eine einzelne Wurzel in horizontalen Seitenkammern mit versiegelten Perspex-Ringen eingeschlossen ist, die die Probelösung enthalten und lokal⁸ positioniert sind. Die Methode ist sowohl für hydroponische als auch für bodengewachsene Wurzeln anwendbar und ermöglicht lokale Probenahmen¹². Allerdings werden geringe Mengen gesammelt, zeitaufgelöste Probenahmen nahezu unmöglich, und die Isolierung einzelner Wurzeln ist anfällig für mechanische Belastungen, was den Wurzelstoffwechsel und die Abscheidung⁸ beeinträchtigen könnte. Mikro-Saugnäpfe werden verwendet, um Bodenlösungen in der Rhizosphäre zu sammeln, was eine In-situ-Probenahme von bodengezüchteten Wurzeln²⁰ ermöglicht. Es werden jedoch kleine Mengen gesammelt, die Probenahme erfolgt teilweise zeitaufgelöst, und die Exsudate sind anfällig für Adsorption und mikrobielle Degradation¹⁶. Die RHIZOtest-Technik beinhaltet das hydroponische Wachstum der Wurzeln in kleinen Zylindern, deren Boden von einem 30 μm dicken Nylonnetz bedeckt ist, und sie dann auf eine Bodenplatte übertragen, wodurch der Austausch von gelösten Stoffen zwischen Wurzel und Boden^{möglich ist. Die} Exsudate werden gesammelt, indem die Wurzelmatte in eine Probenahmelösung eingetaucht wird. Diese Methode hält den Kontakt zu Wurzeln und Boden aufrecht, verwendet jedoch künstliche Wachstumsbedingungen. Sie ist auf kurzfristige Experimente beschränkt und bietet keine zeitlich aufgelöste Probenahme. Unter diesen Methoden können nur Harze, Agar-Gel-Blätter, Filterpapier, Ausstoßfallen und Mikro-Saugnäpfe verwendet werden, um räumliche Exsudationsmuster zu bestimmen.

Hydroponische Exsudatprobennahmemethoden umfassen Hydroponik und Halbhydroponik-Techniken. Hydroponik ist eine häufig verwendete und einfache Methode zur Sammlung von Wurzelexsudaten, bei der Pflanzen in einer Nährstofflösung gezogen werden, die dann durch eine Probelösung (H₂O, CaSO₄, CaCl₂, Micropur) ersetzt wird, um Exsudatproben^15,23 zu erhalten. Die Methode ist einfach und übt minimale mechanische Belastung auf die Wurzeln auf. Sie ist hochgradig reproduzierbar und bei Bedarf steril, was die Qualität der Wurzelexsudate erhöht und zeitauflösende Probenahmen ^5,16 ermöglicht. Dennoch handelt es sich um ein hochgradig künstliches System, das die Pflanzenphysiologie, die Morphologie (z. B. Wurzelhaarentwicklung) und die Wurzelexsudationsprozesse ^6,15 verändern kann. In der Semi-Hydroponik werden Pflanzen auf Glasperlen, Sand oder Vermiculit mit einer kontinuierlich perkolierenden Nährlösung kultiviert, und die Exsudate werden in der perkolierenden Lösung ^8,18 gesammelt. Dieser Ansatz ist im Vergleich zur Hydroponik etwas weniger künstlich und ermöglicht zeitauflösende Probenahmen. Das System ist jedoch nahezu vollständig wassersättigt und benötigt daher Pflanzen, die teilweise anaeroben Bedingungen tolerieren.

Im Vergleich zu alternativen Ansätzen bietet die ZrOH-Hydrogel-Methode mehrere Vorteile. ZrOH-Hydrogele ermöglichen die Probenahme von Wurzelexsudaten in Bodenkultur (nahe natürlichen Bedingungen) mit minimaler Störung des Wurzelsystems, zeitaufgelöste Probenahmen während des Lebenszyklus der Pflanze, und das Sammeln von Wurzelexsudaten für mehr als 24 Stunden ist möglich, da der mikrobielle Abbau und die hohe Carboxylatbindungskapazität^{12 Jahre lang} möglich sind. Außerdem ist kein Biozid (z. B. Micropur, NaN₃) erforderlich, um die Hydrogele zu beproben/zu konservieren, da diese langfristig potenzielle Auswirkungen auf das Analyseinstrument haben und die chemische Analyse beeinträchtigen. Dies liegt daran, dass die Carboxylate chemisch an das ZrOH-Hydrogel gebunden sind. Außerdem können die Proben mehrere Wochen bis Monate vor der Analyse gelagert werden, sodass viele Proben aus einem experimentellen Setup¹² entnommen werden können, was möglicherweise auf die antimikrobiellen Eigenschaften des Zr im Hydrogel^24,25 zurückzuführen ist. Zusätzlich ermöglichen ZrOH-Hydrogele eine 2D-Millimeterauflösungskartierung von exudierten Verbindungen und anderen Anionen in der Rhizosphäre, mit der Möglichkeit, das gesamte Wurzelsystem 12,14,26 zu beproben. ZrOH-Hydrogele benötigen weniger Speicherplatz im Kühlschrank (4 °C) im Vergleich zu den großen Mengen, die klassische Methoden benötigen, die typischerweise im Gefrierschrank gelagert werden (-20 °C). Die Haupteinschränkung besteht darin, sich daran zu gewöhnen, hochwertige ZrOH-Hydrogele mit minimalen oder keinen Luftblasen herzustellen, sowie die Tatsache, dass Rhizoboxen weiterhin künstliche Wachstumsumgebungssysteme bleiben. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass die Methode nur für sieben Carboxylate (Aconitat, Citrat, Fumarat, Laktat, Malat, Succinat und Oxalat)¹², Sulfonamide (Sulfadiazin, Sulfamethazin, Sulfachloropyridazin und Clindamycin)²⁷ und anorganische Anionen (Sulfide und Oxyanionen von P, V-Vanadium, As-arsen, Se-selen, Mo-Molybdän, Sb-Antimon)14,26,28,29 entwickelt wurde. Das ZrOH-Hydrogel wurde auch in Kombination mit suspendierten Partikelreagenzen – Iminodiasestsäure – für In-situ-Probenahmen und Kartierung von Kationen (Al, Fe, Ca-calcium, Mg-Magnesium, Mn-Mangan, Ni-Nickel und Zn-Zink) in der Rhizosphäre 28,29,30 verwendet.

Hier bieten wir eine ZrOH-Hydrogel-basierte Methode, um zeitlich und räumlich aufgelöste, in-situ Probenahmen von Carboxylaten aus bodengezüchteten Wurzelsystemen zu ermöglichen. Wir liefern eine detaillierte Beschreibung, wie ein Rhizobox-Experiment durchgeführt werden kann, einschließlich Probenahme und 2D-Kartierung von Wurzelexsudaten mit der ZrOH-Hydrogel-Technik. Es umfasst die Hydrogel-Präparation, das Befüllen der Rhizobox, Pflanzenanbau, Hydrogel-Anwendung, Rückholung und Schneiden, Carboxylat-Eluation aus dem Hydrogel und Analyse sowie gefolgt von 2D-Bildgenerierung. Zusätzlich werden wichtige Schritte angeführt, wie etwa die Carboxylatanalyse mittels Ionenchromatographie-Massenspektrometrie (IC-MS).

Protocol

1. ZrOH-Hydrogel-Zubereitung

HINWEIS: Für die Gelherstellung sind eine saubere Umgebung und Materialien erforderlich, um Verunreinigungen zu vermeiden. Verwenden Sie nur Laborwasser der Stufe I (≤18 MΩ·cm) zur Herstellung der Lösungen, Gelspülung und Hydratation zur Qualitätssicherung. Stellen Sie sicher, dass die giftigen Abfallbehälter (flüssig und fest) bereits vor Beginn der Hydrogel-Herstellung in die Abzughaube gelegt sind. Vorheizen Sie den Ofen auf etwa 42─45 °C für 1 Stunde, bevor Sie mit der Vorbereitung der Gele beginnen. Details zu Materialien und Chemikalien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Glasmontagevorbereitung
   1. Bereiten Sie ein 10 % (w/v) HNO₃ Säurebad vor, indem Sie 153,8 ml 65 % HNO₃ zu 846,2 ml Laborwasser I in einer Abzugshaube hinzufügen.
   2. Weichen Sie die Glasplatten (6,1 x 17 cm), Pinzette, Teflon-U-förmige Abstandshalter (0,25 mm oder 0,4 mm) und Kunststoffklammern mindestens 4 Stunden im Säurebad ein.
   3. Entfernen Sie die Glasplatten, Pinzetten, Kunststoffclips und Teflon-Abstandshalter aus dem Säurebad und waschen Sie sie dann mindestens dreimal mit Laborwasser Grade I. Lassen Sie sie dann gründlich in einem laminaren Fluss oder einer Reinigungsbank an der Luft trocknen.
      HINWEIS: Die Glasplatten sollten am selben Tag wie die Gelzubereitung vorbereitet werden und vermeiden Sie das Trocknen mit Papier, um Verunreinigungen zu minimieren.
   4. Setzen Sie den "U"-förmigen Abstandshalter auf die trockene Glasplatte, fügen Sie die zweite hinzu und befestigen Sie sie mit Clips zusammen. Verschieben Sie die Glasplatten um etwa ~1 mm, um das Pipettern zu erleichtern (siehe Abbildung 1A).
   5. Lege die Glasplatte vor dem Gießen der Gellösung auf eine saubere Kunststofffolie unter der Filmhaube.
2. Polyacrylamid-Gelvorbereitung³¹
   1. Gellösung: Bereiten Sie 100 ml Gellösung vor, indem Sie 15 ml Diffusive Gradients in Thin Films (DGT) Gel-Crosslinker mit 47,5 ml Laborwasser der Klasse I in einem sauberen Kunststofffläschchen mischen und dann 37,5 ml Acrylamidlösung (40 %) hinzufügen. Rühren Sie die Mischung nach jeder Lösung gründlich um. Die Gellösung kann mindestens drei Monate lang im Kühlschrank (4 °C) gelagert werden.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die richtigen Mengen jeder Lösung zu pipetten/wiegen und verwenden Sie nur Acrylamidlösung ohne Bis-Acrylamid, da dies weiche Gele erzeugt, wenn sie in einen 2-(N-morpholino)-Ethanesulfonsäurepuffer (MES) gelegt werden.
   2. Bereiten Sie eine 10%ige (w/v) Ammoniumpersulphat (APS) Lösung vor, indem Sie 0,1 g APS in 1 g H₂O auflösen. Bereiten Sie die Lösung jeden Tag frisch vor und stellen Sie sicher, dass sie vor der Verwendung vollständig gelöst ist.
   3. Bereiten Sie einen Gel-Cocktail vor, indem Sie 4 ml Gellösung mit 28 μL 10 % APS mischen und dann 10 μL 99 % N,N,N'N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) in sauberen Kunststoffphiolen hinzufügen. Mischen Sie nach jeder Lösung. Die Lösung kann für bis zu 3 Gele vorbereitet werden, da die Mischung schnell polymerisiert. Das Volumen eines Cocktails kann je nach Größe der verwendeten Platten und Abstandshalter angepasst werden.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Blasen und Schaum, wenn Sie die verschiedenen Reagenzien mischen.
   4. Pipettieren Sie langsam die Gelmischung zwischen der Glasplatte aus der Mitte, wie in den Abbildungen 1B,C ²⁶ gezeigt. Falls Luftblasen vorhanden sind, entfernen Sie sie, indem Sie die Glasbaugruppe sanft kippen oder mit einem Stift auf die Glasplatten klopfen.
      HINWEIS: Um blasenfreie Gele zu erhalten, vermeiden Sie die Verwendung von zerkratzten Glasplatten und bewahren Sie sie nach der Anwendung in einem Säurebad auf, wobei Sie sie nur vor der nächsten Anwendung waschen, anstatt sie in Polyethylenbeuteln zu lagern. Verwenden Sie eine 1 ml oder 5 ml Pipette mit einer kleinen Spitze, um das Gel zu gießen und den Gelcocktail langsam von der Mitte aus hinzuzufügen, sodass er sich gleichmäßig verteilt, während die Platten in einem 45° Winkel geneigt werden.
   5. Stellen Sie die Einheit in den vorgeheizten Ofen und halten Sie die Temperatur mindestens 1 Stunde lang bei 42─46 °C, damit das Gel vollständig aushärtet (keine Flüssigkeit tropft).
   6. Heben Sie die Einheit vorsichtig mit Hilfe einer sauberen, rostfreien Rasierklinge an den Ecken und waschen Sie die Gele mit Laborwasser der Klasse I in einer Waschflasche von den Glasplatten ab (Abbildung 1D–F). Zur einfachen Entfernung des Gels werden Sie es einige Minuten mit Wasser einweichen und dann in einen 1-Liter-Becher mit Laborwasser der Stufe I abwaschen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, das Gel mit einer Pinzette zu ziehen, falls es an der Platte haften bleibt, da dies zu einer Gelverformung führen kann. Nach der Polymerisation befinden sich offensichtliche Blasen meist zwischen dem Gel und der Glasplatte und nicht im Gel selbst, was sichtbar wird, sobald die Platte entfernt wird.
   7. Wechseln Sie das Wasser mindestens 3–4 Mal innerhalb von 24 Stunden nach der Hydratierung (vorzugsweise im 2-Stunden-Abstand nach der Vorbereitung), um die verbleibenden Polymerisationschemikalien abzuwaschen. Durch wiederholtes Ersetzen des Wassers während der Hydratation werden Verunreinigungen wie unreagierte Reagenzien ausgeschieden und der pH-Wert reduziert, wodurch eine Ladungsansammlung im Gel verhindert wird.
   8. Lagern Sie die Gele in Laborqualität I (für eine kurze Dauer von etwa 24 Stunden) oder 0,01 mol ^L-1 NaCl oder NaNO₃ im Kühlschrank (4 °C), falls die Gelblätter nicht sofort für ZrOH-Niederschlag verwendet werden. Diese Gele können bis zu einem Monat vor der Niederschlagung in NaCl gelagert werden.
      HINWEIS: Wir empfehlen, die Gele unmittelbar nach der Polymerisation auszufällen, um die Kontamination zu minimieren, die während des Waschens auftreten könnte.
3. Niederschlag von ZrOH-Gels¹⁴
   1. Lösen Sie 3,22 g Zirkoniumdichloridoxid-Octahydrat (ZrOCl_{2.8H 2}O) in 40 ml Laborwasser der Stufe I in einem 250 mL Kunststoffbecher.
   2. Legen Sie bis zu 4 Gel-Folien auf und füllen Sie bis zu 100 ml auf. Alternativ lösen Sie 1,66 g ZrOCl_{2,8H 2}O in 20 ml Laborwasser Grade I, geben Sie 2 Gels dazu und füllen Sie bis zu 50 ml.
   3. Weichen Sie die Gelblätter mindestens 2 Stunden ein, um eine gleichmäßige Verteilung des Zr in den Gels zu gewährleisten.
   4. Übertragen Sie jedes Gel in 100 mL 0,05 mol ^L-1 2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonsäure (MES), gepuffert bei pH 6,7 (pH wird mit 1 mol ^L-1 NaOH angepasst) für die Niederschlagung. Rühren Sie das Gel in den ersten 30-60 Sekunden sanft mit einer Pinzette um, um eine homogene Niederschlagung zu erzielen.
   5. Schütteln Sie vorsichtig auf einem Plattenschüttler bei ≤100 U/min für 40 Minuten, damit Zr(OH)₄ im Gel vollständig fällt.
      HINWEIS: Eine langsamere Schüttelgeschwindigkeit ist bevorzugt, um zu verhindern, dass die Gele aneinander haften.
   6. Geben Sie die Gele 24 Stunden lang in Laborwasser der Klasse I in einem 1─2-Liter-Becher, um ^Cl-Ionen zu entfernen, und wechseln Sie das Wasser mindestens dreimal in 2-Stunden-Intervallen^{von 32} Stunden. Eine gründliche Entfernung der ^Cl-Ionen kann durch Messung der Leitfähigkeit der Spüllösung oder durch einen Chloridtest überprüft werden.
   7. Lagere das Gel in 0,03 mol ^L-1 NaNO₃ oder NaCl, aber NaCl wird für Bodenexperimente bevorzugt, da Nitrat die mikrobielle Aktivität im Boden schnell erhöht und ebenfalls ein wichtiger Pflanzennährstoff^13,32 ist.
   8. ZrOH-Hydrogele wurden bis zu 60 Wochen getestet (im Kühlschrank bei 4 °C gelagert) und zeigten, dass sie ihre Eigenschaften und gute Leistung (±10 % der Zielwerte)³² beibehalten.
4. Gelschnitt
   1. Reinigen Sie die unbeschädigte Plexiglasplatte, Pinzette und eine scharfe, rostfreie Rasierklinge. Ohne Plexiglasplatte kann jede dicke und starke Glasplatte verwendet werden.
   2. Befeuchte die Plexiglasplatte mit Laborwasser der Stufe I, um die ZrOH-Hydrogel-Schichten zu verteilen.
   3. Verteilt das ZrOH-Hydrogel-Blatt mit einer Pinzette auf die Plexiglasplatte, wobei es flach und ohne Blasen liegt. Identifizieren Sie die Bereiche mit Löchern in den Platten; diese Bereiche sollten beim Schneiden vermieden werden.
   4. Schneiden Sie die ZrOH-Hydrogel-Blätter mit einer scharfen Rasierklinge präzise auf die gewünschte Größe. Das Entfernen des Wassers von der Platte nach dem Schneiden hilft, die ausgeschnittenen Abschnitte klar zu erkennen.
      HINWEIS: Zur einfacheren Identifikation der Seiten für die 2D-Kartierung empfehlen wir, ZrOH-Hydrogel-Stücke in ein rechtwinkliges Trapez zu schneiden, wobei sich die längste Seite oben links befindet.
   5. Lagern Sie die ZrOH-Hydrogele in Laborwasser der Stufe I (zur kurzzeitigen Lagerung und kurz vor der Gelaufwendung) oder in 0,03 mol ^L-1 NaNO₃/NaCl für die Langzeitlagerung (>24 Stunden).

2. Aufbau des Rhizobox-Experiments

HINWEIS: Die Pflanzen werden in bodengefüllten Rhizoboxen kultiviert, die sich im Design unterscheiden. Wir empfehlen die Verwendung von Rhizoboxen, die mit einem Loch am Boden oder Rücken ausgestattet sind, um das Bewässern zu erleichtern und eine gleichmäßige Wasserverteilung sicherzustellen (siehe ergänzende Abbildung 1). Details zu den Materialien und Chemikalien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Rhizobox-Befüllung und Bestimmung der Wasserspeicherkapazität²⁶
   1. Siebe luftgetrockneten Boden mit einem 2-mm-Sieb und homogenisiere den Boden. Wir empfehlen mitteltexturierten Boden, aber auch sandiger oder toniger Boden können verwendet werden, sofern spezifische Handhabungstechniken angewendet werden (z. B. Rhizobox-Typ, Auffüllen, Öffnen und Gießen).
   2. Wägen Sie alle Komponenten der Rhizobox (leer) zusammen mit den Klemmen und der Kunststofffolie und notieren Sie das Gewicht (siehe ergänzende Abbildung 2C). Fügen Sie 2–3 zusätzliche Rhizoboxen zur erforderlichen Anzahl zur Bestimmung der Wasserspeicherkapazität (WHC) hinzu.
   3. Schätzen Sie die Masse des trockenen Bodens, die zur Befüllung der Rhizobox erforderlich ist. In der Regel wird die Rhizobox bis zu 2 cm unterhalb der Oberseite gefüllt. Die empfohlene Dichte beträgt etwa 1,0–1,4 g ^cm-3.
   4. Je nach Art der Rhizobox und der Bequemlichkeit der Handhabung wird die Rhizobox vorsichtig mit dem trockenen Boden gefüllt. Während und nach dem Auffüllen kann der Boden mit einer flachen Platte eingeebnet werden, ohne ihn zu verdichten. Leicht angefeuchteter Boden kann auch verwendet werden, um die Rhizobox zu füllen, um die Bodenstruktur zu erhalten, insbesondere bei feintexturierten oder schweren Tonböden (siehe Wagner et ^al.26 für eine ausführliche Beschreibung).
   5. Alternativ, wenn die Rhizobox von oben gefüllt ist, befestigt man die Kunststofffolie an der Rhizobox, deckt sie mit der Frontplatte ab und klemmt dann ab (siehe ergänzende Abbildung 2A–D).
   6. Zur Bequemlichkeit sollten Sie während des Füllvorgangs eine Nukleporenmembran installieren und sicherstellen, dass sie flach auf der Oberfläche liegt. Eine Nukleporenmembran ist für die Entnahme von Wurzelexsudaten erforderlich.
   7. Zeichnen Sie das Gewicht der mit Boden gefüllten Rhizoboxen zusammen mit den Klammern auf. Berechnen Sie die Masse des trockenen Bodens (m_{trockener Boden}) für jede Rhizobox, indem Sie das Gewicht der leeren Rhizoboxen von den bodengefüllten abziehen, und notieren Sie das Gewicht.
   8. Die Wasserspeicherkapazität wird bestimmt, indem die Rhizoboxen zunächst mit deionisiertem Wasser gesättigt und anschließend ~8 Stunden entwässern werden. Wägen Sie die Rhizoboxen und berechnen Sie die Wassermasse (m_w), indem Sie das Gewicht der in Schritt 2.1.7 erfassten erdgefüllten Rhizoboxen vom aktuellen Gewicht abziehen. Dann bestimmen Sie WHC (g ^g-1) durch Teilen von m_w durch m_{trockenen Boden}, das Ergebnis ist ein Verhältnis.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine Rhizoboxen, die zur Bestimmung des WHC verwendet werden, für die tatsächliche Kartierung, da Wassersättigung zu Anaerobie und damit zu Redoxartefakten führen kann.
   9. Der optimale Wassergehalt der meisten Pflanzen während des Wachstums sollte je nach Bodentyp und Pflanzenart bei 50 %─60 % WHC (d. h. WHC-Faktor, f_WHC = 0,5─0,6) gehalten werden. Schätzen Sie die Menge an Wasser, die zu jeder Rhizobox hinzugefügt werden muss (m_{w add}) wie folgt: m_{w add} = WHC x f_{WHC x} m_{trockener Boden}.
   10. Gieße die Rhizobox vor dem Pflanzen mit _{Mw Addition}. Wenn durch die Löcher gegossen wird, gib 5–10 ml Wasser an die Oberfläche.
   11. Erfassen Sie die Masse der bewässerten Rhizoboxen, die zum Gießen der Pflanzen während des Pflanzenwachstums benötigt werden.
2. Pflanzenanbau und -management^12,26
   1. Sterilisiere die Samen vor dem Keimen oder Pflanzen. Eine gängige Praxis ist, sie 3 Minuten in 70 % Ethanol zu geben und dann 15 Minuten in 1 % NaClO, um das Pilzwachstum zu verhindern. Anschließend werden die Samen mit deionisiertem Wasser (etwa 6─7 Mal) abgespült.
   2. Vorkeimen Sie die Samen zwischen Filterpapieren oder Keimrollen, die mit Wasser oder 0,05 mmol L⁻¹ CaSO₄ benetzt sind, bis der Radikel herauskommt.
   3. Einen Setzling auf jede Rhizobox legen, ihn nahe an die Vorderplatte legen, mit etwas Erde abdecken und dann etwas Wasser hinzufügen.
   4. Wickeln Sie die Rhizoboxen in Al-Folie, um photochemische Reduktion in der Rhizosphäre zu verhindern, das Wachstum von Algen und anderen photosynthetischen Mikroorganismen zu verhindern und die Wurzeln bei Lichteinwirkung zu vermeiden. Alternativ sind schwarze Frontplatten erhältlich, die kein Licht durchlassen, und sie können anstelle von Al-Folie verwendet werden.
   5. Stellen Sie die Rhizoboxen auf ein Gestell, damit sie in der Wachstumskammer oder im Gewächshaus mit kontrollierter Temperatur, relativer Luftfeuchtigkeit und Lichtintensität gekippt sind. Wir empfehlen eine Neigung von 25°─35°.
   6. Gießen Sie die Rhizoboxen mindestens 2─3 Mal pro Woche gravimetrisch, abhängig vom Bedarf der Pflanzen. Dies geschieht durch Wiegen der Rhizoboxen, wobei Wasser hinzugefügt wird, um den Unterschied zum in Schritt 1.2.11 angegebenen Gewicht auszugleichen. Wenn jedoch die Biomasse der Anlage erheblich ist und der Wasserbedarf steigt, sollte die Biomasse berücksichtigt und das Bewässerungsvolumen entsprechend angepasst werden.
   7. Spezifische Pflanzenmanagementpraktiken (z. B. Düngung) werden entsprechend dem Versuchsaufbau, den Bodeneigenschaften, kultivierten Pflanzenarten und den vorherrschenden Bedürfnissen an Krankheits- und Schädlingsbekämpfung während des Pflanzenwachstums durchgeführt.
   8. Die Wachstumsphase und die Wurzelexsudatentnahme hängen weitgehend von der Größe der Rhizoboxen, Pflanzenarten und den Zielen der Studie ab.

3. Wurzelexsudat-Probenahme ^12,26

HINWEIS: Hier geben wir Details zur zerstörungsfreien Probenahme von Wurzelexsudaten bereit. Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Materialien vor der Probenahme vorbereitet sind und die experimentellen Rohlinge während der Probenahme einbezogen werden. Die Details zu den Materialien und Chemikalien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Erhöhen Sie den Wassergehalt der Rhizoboxen langsam auf 90 %–95 % WHC (80 % bei hochempfindlichen Pflanzen gegenüber Sauerstoffstress) einen Tag oder mindestens 2 Stunden vor der Probenahme. Dies kann genau erreicht werden, indem man zunächst in Schritt 2.1.9 die zu hinzufügende Wassermenge (m_{w add}) mit 90 %–95 % WHC berechnet, dann das Gesamtgewicht der Rhizobox, den feuchten Boden und eine Schätzung des Pflanzengewichts neu berechnet. Mit einer Bilanz wird deionisiertes Wasser hinzugefügt, bis die Rhizobox das neu berechnete Gewicht erreicht.
2. Wickle die Al-Folie aus der Rhizobox ab, identifiziere und zeichne die interessante Region auf der Frontplatte. Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn nur die Wurzelsegmente oder jungen Pflanzen beprobt werden sollen.
3. Schneiden Sie eine Kunststofffolie und ZrOH-Hydrogel (siehe Schritt 1.3) in die angegebenen Maße entsprechend der Interessenregion und der Größe der Rhizobox. Wenn die Nukleopormembran während des Füllvorgangs nicht installiert wurde, schneiden Sie sie auf die gewünschten Maße, die etwas größer sind als das ZrOH-Hydrogel.
4. Stellen Sie die Rhizoboxen auf einen flachen Ständer mit der abnehmbaren Frontplatte nach oben und öffnen Sie sie vorsichtig (siehe Abbildung 2A). Entfernen Sie langsam die Kunststofffolie und achten Sie darauf, dass Wurzeln und Boden nicht gestört werden.
5. Positionieren Sie ein Lineal auf dem interessierten Bereich und machen Sie hochauflösende Bilder, die für die spätere Datenverarbeitung benötigt werden. Ein Lineal dient als Referenz für eine genaue Größenbestimmung direkt anhand des Bildes während der Verarbeitung, insbesondere wenn viele Rhizoboxen abgetastet werden müssen.
6. Gib eine kleine Menge Wasser in den Zielwurzelbereich, bis ein dünner Wasserfilm auf der Oberfläche erscheint (siehe Abbildung 2B). Ein höherer Feuchtigkeitsgehalt (vorzugsweise 90–95 % WHC oder 80 % für hochempfindliche Pflanzen gegenüber Sauerstoffstress) des Bodens ermöglicht einen guten Kontakt zwischen Boden und Gel während der Probenahme. Ein höherer Feuchtigkeitsgehalt ist notwendig, um einen konstanten Fluss von Molekülen auf das Hydrogel zu gewährleisten.
7. Legen Sie die vorgeschnittene Nukleporenmembran direkt auf die Bodenoberfläche bzw. die Wurzelregion von Interesse und stellen Sie sicher, dass sie flach auf der Boden-Wurzel-Grenzfläche liegt (siehe Abbildung 2C).
8. Platzieren Sie das ZrOH-Hydrogel direkt und so flach wie möglich auf die Nukleporenmembran in der interessierenden Region und machen Sie zusammen mit dem Lineal auf der linken Seite des ZrOH-Hydrogels ein Foto (siehe Abbildung 2D). Das Lineal kann helfen, die Größe des ZrOH-Hydrogels zu bestimmen und, falls sich die Eigenschaften während der Probenahme verändern, sowie die Seiten bei längerer Lagerung (>1 Jahr) zu identifizieren.
9. Schützen Sie das ZrOH-Hydrogel von der Frontplatte, indem Sie eine Kunststofffolie auf das ZrOH-Hydrogel legen (siehe Abbildung 2D).
10. Schließen Sie die Rhizobox vorsichtig, um die Bewegung des ZrOH-Hydrogels zu verringern. Eine minimale Bewegung des ZrOH-Hydrogels beim Schließen der Rhizobox kann auch erreicht werden, indem das Gel-Sandwich (Nukleormembran + ZrOH-Hydrogel + Kunststofffolie) mit Vinyl-Isolierband an einer sauberen Frontplatte der Rhizobox befestigt wird, wie von Wagner et al.²⁶ beschrieben.
11. Wickle die Rhizobox erneut in Al-Folie und stelle sie für 24 Stunden zurück in die Wachstumskammer/das Gewächshaus. Wurzelexsudate können über längere oder kürzere Zeiträume gesammelt werden, sofern das Gel nicht austrocknet und je nach Versuchsaufbau und Studienzielen.
12. Nach der Anwendung öffnen Sie die Rhizobox vorsichtig, entfernen Sie vorsichtig das Band und die Membran und nehmen Sie das Hydrogel heraus. Legen Sie das Hydrogel in einen sterilen, luftdichten Beutel, geben Sie vor dem Schließen einige Tropfen Wasser hinzu und lagern Sie dann im Kühlschrank (4 °C) bis zur Analyse. Lagern Sie die Leergele ähnlich wie bei einer Kontrollmaschine. Für 2D-Kartierungen heben Sie das ZrOH-Hydrogel zusammen mit einer Plastikfolie und markieren Sie die Oberseite.
13. Entfernen Sie die Wurzeln und bestimmen Sie die morphologischen Parameter, das Frischgewicht und das Trockengewicht der Wurzel für die Normalisierung der Exsudatdaten, falls keine Zeitauflösungsexperimente durchgeführt werden.
14. Schließen Sie die Rhizobox und setzen Sie sie zurück in die Klimakammer oder das Gewächshaus, falls zeitaufgelöste Studien durchgeführt werden.

4. Elution und Messung von Carboxylaten¹²

HINWEIS: Frisches Laborwasser der Stufe I sowie analytische Standards hoher Reinheit sind erforderlich, um die Rohlinge und Standards herzustellen. Als Qualitätssicherung sollten zertifizierte Qualitätskontrollstandards verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Lösungen (Proben und Standards) frei von Partikeln sind, indem Sie die Proben vor der Analyse durch 0,2 μm oder 0,45 μm Nylonfilter filtern, um Verstopfungen der Rohre zu verhindern. Details zu den Materialien und Chemikalien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Entfernen Sie die geladenen und leeren ZrOH-Hydrogele aus dem Kühlschrank, messen Sie die Maße mit einem Lineal und berechnen Sie dann das Volumen jedes einzelnen mit einer Dicke von 0,4 mm für einen 0,25 mm Abstandsabstand und 0,64 mm für einen 0,4 mm Abstandshalter. Für 2D-Mapping schneiden Sie die ZrOH-Hydrogele mit einer sauberen Rasierklinge in die gewünschte Größe. Beachten Sie, dass die untere Grenze etwa 2 x 2 mm beträgt, da es schwierig ist, kleinere Stücke zu schneiden und das passende Elutionsvolumen zu handhaben.
   HINWEIS: Anstelle eines Lineals verwenden Sie Millimeterpapier (Millimeter-Millimeterpapier) auf einer Seite der zum Schneiden verwendeten Plexiglasplatte, was das Schneiden der ZrOH-Hydrogele in nahezu perfekte Stücke erleichtert. Die Dicke der ZrOH-Hydrogele wurde mit einem Vernier-Kaliber bestätigt.
2. Geben Sie die ZrOH-Hydrogel- oder ZrOH-Hydrogel-Stücke in Plastikfläschchen, elutieren Sie sie, indem Sie 0,5 mol ^L-1 NaOH nach dem Verhältnis 1 mL Eluent pro 0,196 cm³ ZrOH-Hydrogel hinzufügen und 24 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 150 U/min schütteln.
3. Falls das Elutionsvolumen bei einem sehr kleinen (z. B. 2 x 2 mm) ZrOH-Hydrogel-Stück gering ist, fügen Sie dann Laborwasser der Stufe I nach Gewicht hinzu, um auf 45–60 μL zu gelangen, abhängig vom für die analytischen Analysemethode benötigten minimalen Volumen zur Quantifizierung von Carboxylaten (zum Beispiel benötigt IC-MS mindestens 45 μL Probe für den Autosampler, je nach Instrument). Erfassen Sie die genaue Menge an zugesetztem Wasser, um das Volumen auf 45-60 μL zu bringen, da dies für die Berechnung des Verdünnungsfaktors und der tatsächlichen Konzentration erforderlich ist.
4. Filtern Sie die Proben (0,2 μm oder 0,45 μm Nylonfilter) und übertragen Sie sie in Fläschchen. Wir empfehlen die Verwendung von 1,5-ml-Kunststoff-IC-Fläschchen, da diese eingefroren werden können, ohne zu zerbrechen. 330-μL-Fläschchen können auch für kleinere Mengen verwendet werden, wobei darauf geachtet werden muss, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
5. Quantifizieren Sie Carboxylate in der Elutionslösung mit der bevorzugten analytischen Methode (z. B. IC-MS, HPLC). Wir empfehlen deren Trennung mittels IC in Verbindung mit MS-Detektion. Alternativ kann Hoch- oder Ultraleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC oder UHPLC) in Kombination mit verschiedenen Detektoren eingesetzt werden, darunter fortschrittliche MS (z. B. Flugzeit- oder Orbitrap-Sensoren) oder spektrophotometrische Detektoren.
6. Am Ende der Messung können die Proben zusammen mit den Standards im Gefrierschrank aufbewahrt werden. Wir empfehlen, alle Lösungen mit Carboxylaten bei maximal einem Jahr bei -20 °C zu lagern. Für Lagerzeiten, die länger als ein Jahr dauern, können frische Standards als Qualitätsprüfung vorbereitet und gemessen werden.
7. Berechnen Sie die Gesamtmenge jedes Carboxylats im Gesamtvolumen des Eluats (d. h. NaOH-Volumen + Hydrogelvolumen + zugesetztes Wasser) und normalisieren Sie nach Wurzelgewicht oder Wurzelfläche und multiplizieren Sie mit den Elutionseffizienzfaktoren: 0,94 für Aconitat, 1,00 für Citrat, 0,90 für Fumarat, 1,02 für Laktat, 1,05 für Malat, 0,91 für Oxalat und 1,00 für Succinat (siehe Ergänzende Tabelle 1). Stellen Sie sicher, dass die Verdünnungsfaktoren berücksichtigt werden, falls welche während der Eluation und Messung durchgeführt wurden.

5. 2D-Abbildung

HINWEIS: Es gibt keine spezielle Software zur Erstellung von 2D-Bildern der Exudationsdaten. Die Abbildung kann mit Microsoft Excel und Python durchgeführt werden.

1. Fügen Sie die in Schritt 4.7 aus jedem Gelstück gewonnenen Daten in die entsprechende Zelle innerhalb des 2D-Gitters (Zeilen x Spalten) ein. Das Gitter wird über den Fotos erzeugt, die während der Probenahme von den Wurzeln aufgenommen wurden (siehe Schritt 4.1).
2. Definieren Sie die Größe der Raster und überprüfen Sie, ob die Daten übereinstimmen.
3. Wählen Sie die Farbskala und geben Sie Farbcodes an, die die niedrigsten und höchsten Werte repräsentieren.
4. Geben Sie den numerischen Datenbereich für die Legende an, um sicherzustellen, dass sie genau mit der gewählten Skala übereinstimmt.
5. Erstellen Sie eine Heatmap und stellen Sie sicher, dass sie keine Beschriftungen oder Gitterlinien enthält. Die Heatmap kann in R-Software einfach mit dem Beispiel-R-Skript aus der Supplementary File 1 erstellt werden.
6. Bearbeiten Sie das Bild und positionieren Sie es neben dem Foto der während der Probenahme gewonnenen Wurzeln, um die räumliche Verteilung der Carboxylate interpretieren zu können.
   HINWEIS: Heute kann das Mapping auch mit künstlichen Intelligenz-Tools durchgeführt werden. Das Verfahren ist unkompliziert: Kopieren und fügen Sie einfach das numerische Raster aus Excel in den Chat ein und fordern Sie dann eine Heatmap mit den gewünschten Gel-Abmessungen und Farbmaßen für die Legende an. Beachten Sie, dass die Ausgabe nicht immer beim ersten Versuch perfekt ist, aber das Wiederholen des Prozesses in der Regel zu genauen Ergebnissen führt. Dieser Ansatz bietet den Vorteil, deutlich schneller zu sein als manuelle Methoden.

Results

Die ZrOH-Hydrogel-Methode wurde ursprünglich zur Entnahme von Citrat aus im Boden gewachsenen Pflanzenwurzeln entwickelt und erfolgreich eingesetzt, um die räumliche Verteilung der Exudation¹¹ aufzulösen. Bevor wir diese Methode für andere Carboxylate einführten, charakterisierten wir ZrOH-Hydrogele, um sicherzustellen, dass sie auch für andere Carboxylate geeignet sind (siehe Ergänzende Tabelle 1). Zusätzlich eluierten und analysierten wir geladene gelagerte ZrOH-Hydrogele aus einem Rhizobox-Experiment aus dem Jahr 2019. Die ZrOH-Hydrogele können innerhalb von 5 Stunden (~0,2 μmol, 10 mL) 100 % der belasteten Menge für Aconitat, Citrat, Fumarat, Laktat, Malat, Oxalat und Succinat aufnehmen, wobei sie die gleichen Elutionsparameter verwenden, die von Tiziani et ^al.12 (1 mL, 0,5 mol ^L-1 NaOH) festgelegt wurden. ZrOH-Hydrogele können bis zu 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol ^cm-2 an Carboxylate binden (siehe Ergänzungstabelle 1), deutlich höher als jene Konzentrationen (oft im nmol-Bereich), die üblicherweise in der Rhizosphäre vorkommen. Darüber hinaus bleiben carboxylatgeladene ZrOH-Hydrogele stabil und können mehrere Wochen vor der Analyse gelagert werden, wodurch der mikrobielle Abbau während und nach der Probenahme minimiert wird.

Die Ergebnisse in Abbildung 3 zeigen eine 2D-Visualisierung der räumlichen Verteilung der Citrat-Exudation entlang einer Clusterwurzel einer im Boden gewachsenen Lupinus albus L (Lupin)-Pflanze, die in einem P-defizitären Boden kultiviert wird. Die Karte umfasst 48 einzelne Messungen an 5 x 2 mm großen Gelstücken, in die das ZrOH-Gel im August 2025 nach Citratproben im August 2019 unterteilt wurde. Offensichtlich absorbierten die ZrOH-Hydrogele das ausgeschiedene Citrat effektiv, mit quantifizierbaren Ergebnissen selbst bei einem kleinen Gel (0,10 cm^²), ohne dass eine Vorkonzentration des Eluats erforderlich war. Die höchsten Citrat-Exsudationsraten wurden in den Clusterwurzelregionen gefunden (bis zu 2,8 nmol ^cm-2 Gel ^H-1), was sich auf 67,2 nmol ^cm-2 Gel am ^ersten Tag übersetzt, während die niedrigsten Raten nur bei den Gelstücken in Kontakt mit Boden beobachtet wurden. Die Clusterwurzeln reichten in der Länge von 0,2 mm bis 15,6 mm und hatten eine Gesamtlänge von 250 mm. Diese Ergebnisse bestätigen die Eignung der Hydrogele für die Wurzelfreisetzung von Carboxylatproben für 24 Stunden. Die ZrOH-Hydrogele konnten zusätzlich zu Citrat auch andere Carboxylate binden, wie Laktat, Fumarat, Malat und Oxalat, zusätzlich zu Citrat (Tabelle 1). Der Nachweis der meisten Carboxylate aus den ZrOH-Hydrogelen, die 6 Jahre lang bei 4 °C gelagert wurden, deutet auf einen minimalen Abbau der Carboxylate hin. Es werden jedoch noch Experimente durchgeführt, um deutlich mehr Informationen über die sieben getesteten Carboxylate verschiedener Pflanzenarten zu sammeln.

Abbildung 1: Kritische Schritte zur Herstellung von Polyacrylamidgel. (A) Ausrichtung der Glasplattenbaugruppe mit ~1 mm Versatz. (B) Gelgießen und (C) gleichmäßiges Verteilen der Gellösung in der Platte vom Plattenmittelpunkt. (D) Hebeln der Glasplatte mit einer Rasierklinge aus der Ecke. (E) Die Gele einweichen, um sie von der Glasplatte zu lösen. (F) Das Gel in einen Becher abwaschen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Wurzelexsudatentnahme aus einem Abschnitt des von Rhizobox gezüchteten Pflanzenwurzelsystems mit ZrOH-Hydrogelen. (A) Rhizobox nach Entfernen der Frontplatte und des Kunststoffs öffnen. (B) Geeignete Befeuchtung der Boden-Wurzel-Schnittstelle mit deionisiertem Wasser in einer Waschflasche. (C) Nuclepore-Spur-Ätzmembran, die an einer feuchten Boden-Wurzel-Oberfläche befestigt ist. (D) Rhizobox mit einem ZrOH-Hydrogel auf die betreffende Region, mit Kunststofffolie zum Gelschutz gegen die Frontplatte bedeckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Wurzelexsudat-Probenahme mit ZrOH-Hydrogel und 2D-Bild im Millimetermaßstab der Citratexudation. (A) Foto des ZrOH-Hydrogels, das während der Probenahme auf die Wurzelregion von Interesse gelegt wird, um für die Kartierung verwendete Gitter zu erzeugen. (B) 2D-Bild im Millimetermaßstab zeigt die Verteilung der Citratexudationsrate (nmol cm^–2 Gel h^–1) einer weißen Lupinus albus L. (Lupin)-Clusterwurzel, die in phosphorarmem Boden gewachsen ist. Jedes Raster stellt ein Gelstück von 5 x 2 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Anlage	Behandlung	Aconitat	Citrat	Fumarat	Laktat	Malat	Oxalat	Succinat
	mg P kg-1 Boden	NMOL CM-2 H-1
Lupin	50		0.02	0.21	0.15		0.06
Lupin	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
Lupin	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
Lupin	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
Reis (Nerica4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

Tabelle 1: Aconitat-, Citrat-, Fumarat-, Laktat-, Malat-, Oxalat- und Succinat-Exsudationsraten von im Boden gewachsenen Pflanzen Lupinus albus L. (Lupin) und Oryza sativa L. (Reis), die 0, 50 und 250 mg P ^kg-1 Bodengehalt ausgesetzt sind. LOQ ist die Grenze der Quantifizierung

Ergänzende Tabelle 1: NaOH (1 mL, 0,5 mol ^L-1), Elutionsparameter (Elutionseffizienz und Korrekturfaktor) und Kapazität des ZrOH-Hydrogels für sieben Carboxylate. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichungen des Mittelwerts (n = 4 für Elutionseffizienz und Kapazität einzelner Carboxylate sowie n = 40 für Carboxylatmischung). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Schematische Darstellung der empfohlenen Rhizobox für ein leichteres Gießen. Die Rhizobox besteht aus einem Rhizobox-Rahmen mit gleichmäßig verteilten Wasserlöchern am Boden und Rücken, um eine gleichmäßige Wasserverteilung während des Gießens zu ermöglichen, sowie einer abnehmbaren transparenten Frontplatte zur Überwachung des Wurzelwachstums während des Experiments. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Rhizobox-Montage und Bodenfüllungsprozess. (A) Die Löcher auf der Rückseite des Rhizoboxrahmens mit Klebeband abdecken. (B) Eine (Nukleormembran) dann Kunststofffolie an der Vorderseite oder offenen Seite des Rhizoboxrahmens befestigen (sicherstellen, dass sie eng und flach genug ist). (C) Platzieren Sie die Vorderplatte und klemmen Sie die Rhizobox an. (D) Füllen Sie die Rhizobox und kippen Sie sie nach vorne hin, sodass die feinen Partikel auf die abnehmbare Fläche fallen und so eine glatte Oberfläche erhalten, wie auf dem Bild. (E) Alternativ füllt man den abgedeckten Rhizoboxrahmen (A) von der offenen Seite aus, richtet ihn mit der abnehmbaren Platte aus und deckt ihn dann mit Nukleopormembran, Kunststofffolie und der Vorderplatte ab. (F) Endgültiger Aufbau der Rhizobox, bewässert und bepflanzt. Ein alternatives Befüllverfahren ist in Wagner et al. (2020) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Die Datei enthält Details zum R-Skript, das zur Erstellung einer Heatmap verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die hier beschriebene Carboxylat-Probenahme verwendet ZrOH-Hydrogele, für die eine ordnungsgemäße Gelvorbereitung und -handhabung entscheidend sind. Für den Umgang mit ZrOH-Hydrogelen empfehlen wir, sie mit einigen Tropfen Laborwasser feucht zu halten. Während der Vorbereitung ist es wichtig, das Gel nach der Herstellung der Gelmischung umgehend zu gießen (Schritt 1.1.3) und sicherzustellen, dass sich keine Blasen zwischen den Glasplatten bilden. Blasen im Zentrum des ZrOH-Hydrogels sind besonders kritisch, da sie die Probenahme beeinträchtigen können. Im Gegensatz dazu können Blasen an den Rändern entfernt werden, indem das Gel vor der Anwendung abgeschnitten wird. Außerdem binden wurzelfreigesetzte Carboxylate an das ausgefällte ZrOH in den Hydrogelen, wodurch eine gleichmäßige Zr-Verteilung während der Niederschlagung unerlässlich ist. Eine ungleichmäßige Zr-Verteilung im Gel kann zu einer lateralen Diffusion von Carboxylate führen, was ihre räumliche Verteilung verzerrt und die Zuverlässigkeit der 2D-Lokalisierung²⁶ beeinträchtigt. Eine gleichmäßige Verteilung von Zr kann erreicht werden, indem die Polyacrylamid-Gele in eine ZrOCl₂·8H_2O-Lösungfür mehr als 2 Stunden in einem größeren Becher eingetaucht und weniger Gele¹² (Schritt 1.2.3) platziert werden. Darüber hinaus kann die Zr-Verteilung mit einer Rasterelektronenmikroskopie (SEM, S-3400N II, Hitachi, Japan) verifiziert werden, wie von Guan et ^al.14, die die ZrOH-Hydrogele entwickelt haben. SEM ist jedoch als Standardverfahren für riesige Proben nicht praktikabel.

Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Rhizoboxfüllung, die Anwendung der Nukleporenmembran und das Bewässern vor der Gelanwendung zur Carboxylatentnahme. Besondere Sorgfalt ist beim Befüllen und Handhabung von sandigen oder schweren Lehmböden erforderlich, um eine gleichmäßig glatte Oberfläche zu gewährleisten, was für den richtigen Gelkontakt unerlässlich ist und gleichzeitig gut durchlässige Bedingungen gewährleistet ist. Eine glatte Oberfläche ist ebenfalls entscheidend für eine ordnungsgemäße Befestigung der Nukleoporenmembran. Es ist entscheidend, einen guten Kontakt zwischen Wurzel und ZrOH-Hydrogel herzustellen, indem sichergestellt wird, dass die Nukleormembran mit minimalen Luftblasen an der Bodenoberfläche haftet. Vor der Anwendung des ZrOH-Gels ist es außerdem wichtig, den Boden richtig zu sättigen, damit das ZrOH-Hydrogel fest, flach gehalten und feucht gehalten werden kann, um seine Integrität während der Probenahme zu erhalten. Beim Schneiden des Gels für 2D-Carboxylat-Kartierung kann es schwierig sein, millimetergenaue Schnitte zu erzielen; daher empfehlen wir, nicht unter 2 x 2 mm Auflösung zu gehen. Außerdem ist es wichtig, dass die Gele nach der Probenahme feucht bleiben, um ihre Integrität zu erhalten (Schritt 3.12). Die aktuelle Methode wurde von Tiziani et ^al.12 übernommen, die die Verwendung von NaN₃ als mikrobiellen Inhibitor empfahlen, um den Abbau von Carboxylaten zu verhindern. In diesem Protokoll verwenden wir keine mikrobiellen Inhibitoren, die üblicherweise zur Probenahme von Wurzelexsudaten verwendet werden (NaN₃ oder Micropur, ein AgCl-3-basiertes Material)²³, da sie die analytischen Methoden beeinträchtigen und potenzielle Auswirkungen auf das IC-MS-System haben.

Bis heute wurde die Methode ausschließlich für sieben Carboxylate validiert (Aconitat, Citrat, Fumarat, Laktat, Malat, Oxalat, Succinat), während das Wurzelexudom aus einer komplexen Mischung von Verbindungen besteht (z. B. Phenole, Aminosäuren, Kohlenhydrate und Carboxylate). Diese anderen wichtigen Verbindungen sind derzeit nicht in der Methode berücksichtigt, noch wurden die ZrOH-Hydrogele für ihre Probenahmen charakterisiert. Das Vorhandensein anderer Oxyanionen im Boden (wie Phosphat, Nitrat) könnte möglicherweise die Carboxylataufnahme, -kapazität und -eluation sowie die Carboxylatquantifizierung auf IC oder HPLC beeinflussen. Zusätzlich kann die Probennahme sehr großer ganzer Wurzelsysteme von größeren Pflanzen (z. B. Bäumen oder Sträuchern) sehr schwierig sein, da es schwierig ist, sehr große ZrOH-Hydrogele (>30 cm) zu produzieren. Dies ist jedoch ein Problem in allen aktuellen Exsudat-Probenahmetechniken⁸. Eine weitere Einschränkung ist der Einsatz von Rhizoboxen. Obwohl das Pflanzenwachstum in Rhizoboxen wesentlich realistischer ist als in hydroponischen Systemen⁸, bleibt es eine künstliche Anordnung mit begrenztem dreidimensionalem Raum für die Wurzelentwicklung³³. Außerdem findet die Probenahme auf einer 2D-Oberfläche statt, was theoretisch zum Verlust von Carboxylaten führen könnte, die in anderen Richtungen freigesetzt werden, die nicht mit den Gelen in Kontakt stehen. Diese Einschränkung könnte jedoch durch Diffusion, eine höhere Bindungskapazität der ZrOH-Hydrogele für die Carboxylate und den hohen Wassergehalt des Rhizosphärenbodens während der Anwendung gemildert werden. Allerdings sind weitere Validierungen erforderlich, um diese Aspekte zu bestimmen.

Die ZrOH-Hydrogel-Methode zur Probenahme von wurzelfreigesetzten Carboxylaten bietet mehrere Vorteile gegenüber den üblichen Methoden (d. h. Boden-hydroponische Hybrid- und Hydroponik-Ansätze). Dieser neuartige Ansatz ermöglicht die In-situ-Probenahme von Carboxylaten aus ungestörten, bodengewachsenen Wurzelsystemen, zeitaufgelöste Probenahmen (Santner, Mühlbacher et al., unveröffentlichte Daten) und mm-dimensionale 2D-Kartierung. Außerdem können ZrOH-Hydrogele mindestens 24 Stunden^{und 12} Stunden an Wurzeln angewendet werden. Außerdem sollte wiederholte Probenahme desselben Wurzelsegments über längere zeitauflösende Zeiträume möglich sein. Diese Methode ist wesentlich besser entwickelt und charakterisiert als ähnliche Methoden wie die Anwendung von Filterpapieren⁸. Eine langanhaltende Probenahme ist mit ZrOH-Hydrogelen aufgrund einer hohen Gelkapazität für Carboxylate möglich, zum Beispiel am niedrigsten bei 0,44 μmol ^cm-2 ± 0,04 μmol cm⁻² Gel für Malat bis zum höchsten von 1,66 μmol ^cm-2 ± 0,10 μmol cm⁻² für Succinat bei pH 4,00 mit insgesamt 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol cm⁻² bei der Mischung der Carboxylate (siehe Ergänzende Tabelle 1). Das Weglassen des Wurzelwaschschritts (der typischerweise 20–30 Minuten pro Pflanze dauert) bei der Boden-Hydroponik-Hybridmethode reduziert den Wurzelsystemschaden und die damit verbundene Verzerrung erheblich, was zu realistischeren und repräsentativeren Daten führt.

Bemerkenswert ist, dass die geladenen ZrOH-Hydrogele keine besonderen Speicherbedingungen benötigen, sondern nur Kühlung, und wir haben bisher keine notwendige Vorkonzentration nach der Eluation in unseren Anwendungen festgestellt. ZrOH-Hydrogele binden auch andere Anionen, die unter denselben Bedingungen eluiert werden und mit IC^14,34 analysiert werden können. Dies ermöglicht die Verknüpfung der Carboxylat-Exudation mit der räumlichen Verteilung der Nährstoffe in der Rhizosphäre²⁹.

Abschließend lässt sich sagen, dass dieser neuartige Ansatz der Probenentnahme von wurzelfreigesetzten Carboxylaten ein grundlegender Schritt für die Rhizosphärenforschung darstellt. Da Carboxylate eine entscheidende Rolle bei der Mobilisierung und Aufnahme von Pflanzennährstoffen (z. B. P, ^{Fe) sowie} bei der Rekrutierung nützlicher Mikroorganismen spielen, könnte diese Methode verwendet werden, um Sorten auf Wurzelmerkmale und Pflanzenzüchtungen zu screenen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Sigma-Aldrich		70%
Oxalsäure	Sigma-Aldrich	194131-250G	98%
trans-Asonitische Säure	Sigma-Aldrich	122750-25G	98%
Zirkoniumdichloridoxid-Octahydrat (ZrOCl2 & Times; 8H2O, 98%)	Thermowissenschaftlich	A12342.22	98%
Zitronensäure	Sigma-Aldrich	C83155-500G	99%
Natriumnitrat	VWR Chemicals	Grundstücksnummer: 19H224150	100%
Salpetersäure (HNO3)	Sigma-Aldrich	CAS-Nr.: 7697-37-2	>65 % für Analyse EMSURE® Reag. Ph Eur,ISO
Fumarsäure	Sigma-Aldrich	240745-100G	>99 %
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S8045-500G	≥ 98%
Ammoniumpersulfat (APS_(NH4)2S2O8)	Thermowissenschaftlich	201531000	≥ 98,0 %, extra rein, für Elektrophorese
Succininsäure	Sigma-Aldrich	S3674-100G	≥ 99%
2-(N-morpholino)-Ethanesulfonsäure (MES) Puffer	Sigma-Aldrich	M8250-250G	≥ 99.5%
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	71376-1KG	≥ 99.5%
Quervernetzer	DGT Research Ltd (Lancaster, Großbritannien)	Na	2 % Agarose-Derivat
Platten- oder horizontaler Schüttler			Any
Ionenchromatographie oder IC-MS	Thermo Fischer Scientific	Na	Jede Hoch- oder Ultraleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC oder UHPLC) kann in Kombination mit verschiedenen Detektoren eingesetzt werden, einschließlich fortschrittlicher MS (z. B. Flugzeit- oder Orbitrap-Sensoren) oder spektrophotometrischen Detektoren
pH-Meter			Jede Labor-pH-Elektrode kann verwendet werden
Ofen	Ordner	Na	Jeder kleine Ofen, der eine bestimmte Temperatur hält, kann verwendet werden, bevorzugt ein kleinerer.
Nylon filters_13 mm 0,45 & Mikro; M	GVS-Filtertechnologie	Los Nr.: 7135431	Größere Nylonfilter können ebenfalls verwendet werden, aber kleinere werden bevorzugt, da das Eluatvolumen gering ist.
Calciumsulfatdihydrat	Sigma-Aldrich	C3771-1KG /CAS-Nr.: 10101-41-4	CaSO4 kann ebenfalls verwendet werden.
Acrylamidlösung, 40 %	G-Biosciences	786-508	Verwenden Sie keine Acrylamidlösung, die mit   Bis-Acrylamid. Eine giftige Verbindung, die bei einer Abzugsphase mit Vorsicht behandelt werden sollte.
Rhizoboxen	https://www.rhizosphere.com/	Na	Unsere Rhizoboxen sind maßgeschneidert und basieren auf dem Design des Rhizosphere.com
Polypropylen-Fläschchen-Kit, 1,5 ml	Thermowissenschaftlich	79812	Kunststoff-IC-Fläschchen werden bevorzugt, da sie eingefroren werden können, ohne zu zerbrechen. 330 & Mikro; L kann ebenfalls verwendet werden, aber es muss darauf geachtet werden, dass keine Luftblase entsteht
cis-Akonitsäure	Thermowissenschaftlich	A16010.06	Tech. 85 %
N,N,N',N'- Tetramethylethylendiamin (TEMED)	Sigma-Aldrich	Los Nr.: BCBN1173V	Eine giftige Verbindung, die mit Vorsicht behandelt werden sollte
250-mL PP-Fläschchen	Sarstedt	Los Nr.2406082
Alufolie	Lokaler Supermarkt	Na
Beakers_1 L/ 2 L
Klemmen	Lokales Lagerhaus	Na
Glasplatte (6,1 x 17 x 0,4 cm)	Lokales Lagerhaus	Na
L-(-)-Apfelsäure	Sigma-Aldrich	M6413-25G
Laktatstandard für IC	Sigma-Aldrich	07096-100ML
Laminare Strömungsbank
L-Milchsäure wasserfrei	Thermowissenschaftlich	L13242.14
Nuclepore Track-Etch Membrane_0.2 & Mikro; m	Cytiva	Los Nr.: A29983896
Plastikfolie/Plastiktüten	Lokales Lagerhaus	Na
Kunststoffpinzetten	Semadeni	602
Plexiglasplatte	Lokales Lagerhaus	Na
PP 30 mL Phiolen	Aptaca Spa	Los Nr.: 250552
PTFE spacer_0,25/0,4 mm	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
Rasierklingen	Lokales Lagerhaus	Na
Herrscher	Örtliche Buchhandlung	Na
Natriumhypochlorit (NaClO)	CARLO ERBA Reagenzien	CAS-Nr.: 7681-52-9
Syringes_1 mL	HENKE SASS WOLF (HENKE-JET)	Grundstücksnummer: 22A17C8
Vinyl-Isolierband	Lokales Lagerhaus	Na