Maschinelles Lernen unterstützte Raman-Spektralanalyse des serotonin-responsiven ssDNA-SWCNT-Nanosensors zur verbesserten Selektivität gegenüber Dopamin

Summary

Das Protokoll beschreibt die Raman-Spektralanalyse eines ssDNA-umwickelten SWCNT-Nanosensors, die eine verbesserte selektive Messung von Serotonin gegen Dopamin mit Hilfe eines maschinellen Lernmodells ermöglicht.

Abstract

Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) spielt eine entscheidende Rolle bei der Neuromodulation, doch aktuelle Detektionsmethoden haben Schwierigkeiten, eine Echtzeitmessung von 5-HT mit hoher Sensitivität und Selektivität zu ermöglichen. Zuvor haben wir einen Nahinfrarot-Serotonin-Nanosensor (nIRHT) entwickelt, der aus einer ssDNA-umwickelten, einwandigen Kohlenstoffnanoröhre besteht, die 5-HT empfindlich detektiert. Die Fluoreszenzantwort von nIRHT kann jedoch nicht zwischen 5HT und Dopamin (DA) unterscheiden, was ihre praktische Anwendung einschränkt. In dieser Studie überwindet Raman-Spektroskopie in Kombination mit maschinellem Lernen diese Selektivitätsherausforderung. G-Band-Spektralmerkmale zeigten unterschiedliche Signaturen für 5HT versus DA-Bindung an nIRHT, wobei DA eine stärkere G-Band-Unterdrückung verursachte. Wir nutzten Differential-Raman (ΔRaman), um analytspezifische spektrale Veränderungen zu isolieren, und trainierten drei maschinelle Lernmodelle für die Klassifikation. Das Zufallswaldmodell mit ΔRaman erreichte eine optimale Leistung mit 95,8 % Genauigkeit und übertraf damit deutlich die Modelle mit rohen Raman-Spektren. Dieser Ansatz zeigte eine verbesserte Spezifität mit vernachlässigbaren Reaktionen auf Acetylcholin, GABA und Glutamat und erreichte eine Nachweisgrenze von 0,1 μM, die physiologisch geeignet ist. Dieser auf Raman basierende Ansatz verwandelt den nicht-selektiven nIRHT-Fluoreszenzsensor in eine Plattform, die eine robuste Neurotransmitter-Diskriminierung ermöglicht und Selektivitätsprobleme bei einwandigem Kohlenstoffnanoröhren-(SWCNT)-basiertem molekularem Sensorsystem überwindet.

Introduction

Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) ist ein kritischer Neurotransmitter, der Stimmung, Kognition, Schlaf und Appetit reguliert, wobei Funktionsstörungen mit Depressionen, Angstzuständen und anderen neuropsychiatrischen Störungen in Verbindung gebracht werden. Die Echtzeitüberwachung der Serotonindynamik in biologischen Systemen bleibt aufgrund der Millisekundenzeit-Zeitskala der synaptischen Übertragung und der komplexen chemischen Umgebung des neuronalen^{Gewebes 2} eine Herausforderung. Trotz bedeutender Fortschritte bei den Technologien zur Erkennung von Neurotransmittern stellt die Erreichung sowohl hoher Empfindlichkeit als auch molekulare Selektivität für Serotonin weiterhin erhebliche analytische Herausforderungen dar.

Die aktuellen Serotonin-Nachweismethoden reichen von traditionellen analytischen Techniken bis hin zu aufkommenden Nanosensorplattformen. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ED) bleibt der Goldstandard und erreicht Detektionsgrenzen von 0,056 nM bei exzellenter Reproduzierbarkeit³. HPLC erfordert jedoch eine umfangreiche Probenvorbereitung und 15–30 Minuten Analysezeiten, was eine Echtzeitüberwachung ausschließt. Die Schnellscan-zyklische Voltammetrie (FSCV) ermöglicht eine subsekundenzeitliche Auflösung an Kohlenstofffaser-Mikroelektroden, leidet jedoch unter Elektrodenverschmutzung und begrenzter Selektivität zwischen strukturell ähnlichen Neurotransmittern ^5,6. Jüngste Entwicklungen an genetisch codierten fluoreszierenden Sensoren, darunter iSeroSnFR⁷ und GRAB-5HT⁸, erreichen eine bemerkenswerte Sensitivität und einen dynamischen Bereich, erfordern jedoch eine genetische Modifikation von Zielgeweben, was die klinische Translation einschränkt.

Einwandige Kohlenstoffnanoröhrensensoren (SWCNT) sind als vielversprechende Plattformen für den Nachweis von Neurotransmittern ohne Etikette^{hervorgegangen}. DNA-funktionalisierte SWCNTs zeigen eine nahe infrarote (nIR) Fluoreszenzmodulation bei der Analytenbindung, was den Nachweis im gewebetransparenten Fenster (900–1400 nm) ^{ermöglicht10,11}. Landrys Gruppe entwickelte den nIRHT-Sensor durch systematische Ligandenentwicklung durch exponentielle Anreicherung (SELEC) und screente ~10^{bis 10} einzigartige ssDNA-Sequenzen, um serotonin-responsive Konstrukte¹² zu identifizieren. Dieser Sensor erreicht eine mikromolare Sensitivität mit einer 200%igen Fluoreszenzsteigerung bei Serotoninbindung, unabhängig von Dopamin- oder Serotoninoxidation. Um oxidative Interferenz auszuschließen, bestätigte unsere vorherige Studie die Stabilität dieser Neurotransmitterlösungen; UV-Vis- und NMR-Analysen zeigten keine oxidativen Veränderungen oder neue Peak-Formationen im Vergleich zu reinem 5HT¹². Darüber hinaus sind die kurze Inkubationszeit und die neutralen pH-Bedingungen im System darauf ausgelegt, eine bedeutende Chinonbildung zu verhindern. Ähnlich war die Strano-Gruppe Pionier bei der Molekularerkennung der Koronaphase (CoPhMoRe) und zeigte, dass (GT)₁₅-umwickelte SWCNTs Dopamin bei 11 nM-Konzentrationen¹³ nachweisen. Unsere Gruppe hat dieses Feld kürzlich durch maschinell-lerngesteuerte Optimierung weiterentwickelt und eine 2,5-fache Sensitivitätsverbesserung durch Hochdurchsatz-Screening systematisch mutierter Sequenzen^erreicht.

Trotz dieser Fortschritte besteht eine grundlegende Einschränkung in der unzureichenden Selektivität zwischen Serotonin und Dopamin. Beide Neurotransmitter enthalten aromatische Ringe und Ethylaminketten, die sich nur um eine einzige Hydroxylgruppe¹⁵ unterscheiden. Aktuelle fluoreszenzbasierte SWCNT-Sensoren erreichen typischerweise Selektivitätsverhältnisse unter 5:1, was unzureichend ist, um gemeinsam freigesetzte Neurotransmitter in synaptischen Umgebungen zu unterscheiden¹⁶. Diese Selektivitätsherausforderung ist besonders entscheidend, da Serotonin und Dopamin oft in Hirnregionen kolokalisieren, die Belohnung und Motivation steuern¹⁷.

Die Raman-Spektroskopie liefert ergänzende chemische Informationen durch die Schwingungsmodenanalyse des SWCNT-Analyt-Komplexes¹⁸. Das G-Band (~1580 cm⁻¹) der SWCNTs teilt sich in G⁺- und G⁻-Komponenten auf, mit Frequenzen, die für molekulare Adsorption und elektronisches Doping¹⁹ empfindlich sind. Eine frühere Studie zeigte, dass nicht-kovalente Tensiden auf SWCNT deutliche Raman-spektrale Veränderungen im G-Band-Bereich²⁰ induzieren.

In dieser Arbeit demonstrieren wir maschinell-learning-unterstützte Raman-spektrale Analyse des nIRHT-Sensors, um eine erhöhte Selektivität zwischen Serotonin und Dopamin zu erreichen. Wir charakterisierten systematisch konzentrationsabhängige Raman-Antworten von 0,01 bis 100 μM und zeigten für jeden Neurotransmitter unterschiedliche spektrale Fingerabdrücke. Drei Machine-Learning-Modelle – Convolutional Neural Network (CNN), Support Vector Machine (SVM) und Random Forest (RF) – wurden auf spektralen Datensätzen trainiert, um die Analytenidentität zu klassifizieren. Entscheidend ist die Einführung der differenziellen Raman-Verarbeitung, die Basissignale entfernt, um analytspezifische Merkmale zu isolieren. Das optimierte RF-Modell mit DR-Verarbeitung erreicht eine Klassifikationsgenauigkeit von 95,8 %, was einen bedeutenden Fortschritt in der molekularen Diskriminierung darstellt. Dieser multimodale Ansatz, der nIR-Fluoreszenzsensitivität mit Raman-chemischer Spezifität kombiniert, bietet einen Weg zur Echtzeit-selektiven Serotoninüberwachung in komplexen biologischen Umgebungen.

Protocol

1. ssDNA-funktionalisierte SWCNT nIRHT-Nanosensorfertigung

1. Kombinieren Sie 1 mg einwandige Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs), 100 μL 1 mM E6#9 ssDNA und 900 μL 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einem 1,5 mL Rohr.
   VORSICHT: Trockenes SWCNT-Pulver ist eine potenzielle Einatmungsgefahr. Führen Sie das Pulver in einer zertifizierten chemischen Abgashaube und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Maske und Handschuhe.
2. Die Mischung mit einem Bade-Sonikator für 5 Minuten verteilen. Sonikieren Sie die Mischung mit einem Tip-Sonikator mit einer 3-mm-Sonde bei 50 % Amplitude für 30 Minuten in einem Eisbad.
3. Zentrifugiere die sonikierte Lösung bei 21.500 x g für 1 Stunde, um nicht dispergierte SWCNTs auszufällen. Sammeln Sie vorsichtig 850 μL des Überstandsmittels und übertragen Sie es in ein neues Rohr.
4. Messen Sie die Absorption der gesammelten SWCNT-Suspension bei einer Wellenlänge von 632 nm. Berechnen Sie die Konzentration mit dem SWCNT-Extinktionskoeffizienten von 0,036 (mg/L)⁻¹ cm⁻¹. Lagern Sie die endgültige nIRHT-Sensorlösung bis zur weiteren Nutzung bei 4 °C.

2. Raman-Spektrenmessung

1. Laden Sie 90 μL der 10 mg/L nIRHT-Dispersion in eine 96-Well-Platte. Messen Sie das Raman-Spektrum des Sensors in einem PBS-Puffer mit einer 532-nm-Laseranregungsquelle. Setze dieses aufgezeichnete Spektrum als Basislinie.
   VORSICHT: Es ist entscheidend, die Laserleistung bei 10 mW und die Wellenlänge bei 532 nm bei der Untersuchung lebender biologischer Proben streng zu halten. Höhere Laserleistungen können schwere Phototoxizität induzieren und die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen. Der 532-nm-Laser bei 10 mW, der in diesem Protokoll verwendet wird, ist als sicher und zerstörungsfrei für die Analyse lebender Zellen etabliert, wodurch empfindliche Organellen²¹ und die elektrophysiologische Aktivität der Primärneuronen²² erhalten bleiben und gleichzeitig eine robuste Raman-Signalaufnahme gewährleistet werden.
2. Jede 90-μL-Sensorlösung (10 mg/L) mit 10 μL der Analytlösung spitzen, um die Endkonzentrationen von 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50 und 100 μM zu erreichen. Warten Sie 5 Minuten nach der Analytzugabe, um eine ausreichende Inkubation zu ermöglichen.
3. Missen Sie die Raman-Spektren der inkubierten Proben. Bereiten Sie Proben für jede Konzentration in dreifacher Form vor und wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.2, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

3. Datenanalyse basierend auf maschinellem Lernen

1. Stellen Sie den Datensatz aus insgesamt 208 Raman-Spektren zusammen, darunter 77 Dopamin- (DA)-Reaktionen, 76 Serotonin-(5HT)-Reaktionen und 47 Kontrollgruppenreaktionen (PBS).
2. Führen Sie eine Hintergrundsubtraktion im G-Band-Bereich der Spektraldaten durch. Normalisiere die im Hintergrund subtratrahierten Daten basierend auf dem G+-Band-Peak.
3. Wenden Sie einen Medianfilter an, um das Rauschen in den normalisierten Spektren zu reduzieren. Spektrale Veränderungen (ΔRaman) isolieren, indem das normalisierte Kontrollspektrum von jedem analytisch behandelten Spektrum subtrahiert wird.
4. Entwicklung eines Convolutional Neural Network (CNN), eines Random Forest (RF) und eines Support Vector Machine (SVM)-Modells für die ternäre Klassifikation von 5HT, DA oder der Kontrollgruppe.
5. Teilen Sie den gesamten Datensatz in Training, Validierung und Testsätze mit einem Verhältnis von 6:2:2 auf.
6. Konfigurieren Sie die CNN-Architektur mit drei 1D-Faltungsschichten, die eine ReLU-Aktivierungsfunktion und eine maximale Poolgröße von 2 verwenden, gefolgt von zwei vollständig verbundenen Schichten.
7. Konfigurieren Sie das SVM mit einem Radial Basis Function (RBF)-Kernel für nichtlineare Klassifikation.
8. Konfigurieren Sie das RF-Modell mit den Standard-Hyperparametern.
9. Trainieren Sie die konstruierten Modelle mit 5-facher Kreuzvalidierung. Berechnen Sie die durchschnittlichen Leistungskennzahlen über alle 5 Seiten, um statistische Robustheit sicherzustellen.
10. Wählen Sie das Modell aus, das die höchste Genauigkeit der Validierungsdaten für die Endanalyse liefert.
11. Bewerten Sie das ausgewählte Modell im Testsatz, um seine Verallgemeinerungsfähigkeit zu überprüfen.
12. Bestimmen Sie die indirekte Detektionsgrenze (LOD), indem Sie sequentiell Daten aus dem Trainingssatz ausschließen, die unter einer Konzentrationsgrenze von 0,1 μM liegen.
13. Testen Sie das trainierte Modell im gesamten Konzentrationsbereich, einschließlich Konzentrationen unterhalb der Kriterien, um die endgültige LOD festzulegen.

Results

Der E6#9 ssDNA-funktionalisierte SWCNT-Nanosensor (nIRHT), der zuvor mit der SELEC-Methodik entwickelt wurde, zeigt reversible nIR-Fluoreszenzverstärkung bei 5HT-Bindung und ermöglicht so Echtzeit-5HT-Bildgebung in vitro und ex vivo¹². Die E6#9-Sequenz (5'-CCCCCCCACACACACACACTCCCCCC-3') umschließt SWCNTs, um Bindungsstellen für 5HT zu schaffen. Allerdings fehlt diesem Sensor die Spezifität: Sowohl 5-HT als auch DA führen zu einer vergleichbaren I...

Discussion

Die Raman-spektroskopische Analyse verbesserte die Spezifität des nIRHT-Sensors erheblich, eine Fähigkeit, die mit seiner konventionellen Fluoreszenzantwort nicht erreichbar war. Wir beobachteten, dass DA eine ausgeprägtere Unterdrückung des G⁻-Bands (1570 ^cm-1) im Vergleich zu 5HT induzierte. Diese differenziellen Signaturen entstehen wahrscheinlich durch unterschiedliche molekulare Orientierungen und Bindungsgeometrien auf der SWCNT-Oberfläche. Konkret bildet die Katechol-Mo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	Nanointegris
iDus1.7 InGaAs	ANDOR	DU490A-1,9
Ramantouch	Nanophoton
Vibra-Zelle 130	SONICS