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Methodenartikel

Postoperative Erholung und Stabilität der chronischen intrakraniellen Multielektroden-Elektroenzephalographie bei Ratten

148 Ansichten

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DOI:

10.3791/69937

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24. April 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Core Facility Center, Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Intensive Care Unit, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 3Department of Neurosurgery, Anesthesiology, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 4First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 5Department of Cardiology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 6Institute of Heart Lung and Blood Vessel Disease, Beijing Key Laboratory of Precision Medicine of Coronary Atherosclerotic Disease, Clinical center for coronary heart disease, Capital Medical University, 7Laboratory for Clinical Medicine, Capital Medical University, 8Department of Physiology, Amsterdam University Medical Centre

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten Rahmen für die postoperative Untersuchung nach chronischer Mehrelektroden-EEG-Implantation bei Ratten, einschließlich sequentieller Überwachung der Signalqualität, der Verhaltenswiederherstellung und neuroinflammatoriser Marker, um die angemessene Initiierung stabiler Langzeitaufnahmen zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die intrakranielle Multi-Elektroden-Implantation ermöglicht die gleichzeitige Erfassung neuronaler Signale über Hirnregionen, führt jedoch zu postoperativen Störungen, die die Datenqualität und den experimentellen Zeitpunkt beeinträchtigen können. Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten Arbeitsablauf für chronische multi-standortale intrakranielle EEG-Elektrodenimplantation und strukturierte postimplantierte Beurteilung bei Sprague–Dawley-Ratten. Wolframdrahtelektroden werden stereotaktisch an drei vordefinierten intrakraniellen Stellen (vorderer cingulära Kortex, Hippocampus CA1 und entorhinalkortex) implantiert, wobei eine chirurgische Strategie darauf ausgelegt ist, Gewebestörungen zu minimieren.

Nach der Implantation spezifiziert das Protokoll eine longitudinale Bewertung in fünf Bereichen: Genauigkeit der Elektrodenlokalisierung, Integrität des lokalen Feldpotentials, schmerzbezogenes Verhalten, Ernährungsverhalten und neuroinflammatoriske Marker. Elektrophysiologische und verhaltensbezogene Bewertungen werden zu vordefinierten postoperativen Zeitpunkten (Baseline und postoperative Tage 1, 4, 7, 10 und 13) durchgeführt, um eine konsistente Überwachung der frühen postoperativen Effekte zu unterstützen (n = 3). Histologische Analysen werden verwendet, um lokale Gewebereaktionen am Ende der Studie zu charakterisieren (n = 3 pro Zeitpunkt).

Betriebskriterien und Bewertungsintervalle werden bereitgestellt, um Entscheidungen bezüglich der experimentellen Bereitschaft und der Initiierung von Langzeitaufzeichnungen zu leiten. Dieses Protokoll bietet einen strukturierten Ansatz zur Überwachung nach der Implantation und informiert den angemessenen Zeitpunkt für nachgelagerte neurophysiologische Experimente.

Einleitung

Die intrakranielle Elektroenzephalographie (EEG) ermöglicht eine hochauflösende Messung neuronaler Aktivität durch direkte Aufzeichnung von Signalen aus Hirngewebe 1,2, was Vorteile in räumlicher Spezifität und Signaltreue gegenüber Kopfhaut-EEG-Ansätzen3 bietet. Mehrfachregionen-intrakranielle Aufzeichnungen bieten Einblicke in Netzwerk-Interaktionen, die weit verbreitet zur Untersuchung neuronaler Dynamiken zugrunde liegender Kognition und Krankheit verwendet werden und häufig in Nagetiermodellen für mechanistische und longitudinale Studien implementiert werden 4,5.

Wolframdrahtelektroden werden häufig für chronische Aufzeichnungen verwendet, da sie ihre mechanische Stabilität und Biokompatibilität 6,7,8 haben. Die Implantation erfordert jedoch invasive Operationen, die vorübergehend die neuronale Physiologie, die Gewebeintegrität und das Tierverhalten störenkönnen 9,10,11. Herausforderungen wie akuter chirurgischer Stress, lokale Entzündungen, gliale Reaktionen und Veränderungen im Fress- oder Nozizeptionsverhalten können die Signalqualität und die experimentelle Interpretation während der frühen Post-Einpflanzungsphasebeeinflussen 12,13,14. Diese Erholungsphase bleibt jedoch weitgehend empirisch, mit berichteten Erholungsfenstern von 5 bis 7 Tagen15,16. Längere Verzögerungen hingegen können zusätzliche Störungen im Zusammenhang mit Geweberemodellierung oder Elektrodenverschiebung17 verursachen.

Trotz der weitverbreiteten Anwendung des chronischen intrakraniellen EEG gibt es keinen standardisierten Rahmen für die Überwachung nach der Implantation, der elektrophysiologische, verhaltensbezogene, inflammatoriske und histologische Bewertungen zur Durchführung des experimentellen Timings integriert. Daher schließt das vorliegende Protokoll diese Lücke, indem es einen strukturierten Ansatz zur Bewertung des Status nach der Implantation in einem chronischen intrakraniellen Multi-Elektroden-Implantationsmodell bei anästhesierten Sprague–Dawley (SD) Ratten (6 Wochen alt) vorstellt. Mit Wolframdrahtelektroden, die im vorderen cingulära Kortex (Cg1), Hippocampus CA1 und Entorhinalkortex (EC) implantiert wurden, sieht das Protokoll eine längsgraduale Beurteilung der Elektrodenstabilität, EEG-Signalmerkmale, Verhaltensindikatoren und Entzündungsmarker über einen Zeitraum von zwei Wochen vor. Obwohl die Untersuchungen aus praktischer Gründe unter Vollnarkose durchgeführt werden, beeinträchtigt dieser Ansatz nicht das Hauptziel zur Etablierung eines Rahmens für Elektrodenimplantation und -stabilität. Dieses Protokoll soll die postoperative Überwachung steuern und eine konsistente Bestimmung geeigneter Zeitpunkte für den Beginn der neurophysiologischen Studien unterstützen.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Capital Medical University genehmigt (Genehmigungs-ID: AEEI-2024-391).

1. Tiervorbereitung

  1. Besorge 6 Wochen alte männliche SD-Ratten (Körpergewicht 220–230 g). Halte die Tiere in einer spezifischen, krankheitserregerfreien Umgebung (24 ± 2 °C, 50 ± 10 % Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Licht/Dunkelheit-Zyklus). Versorge Nahrung und Wasser ad libitum. Gewöhne die Ratten 7 Tage vor der Operation.
  2. Nach der Elektrodenimplantation werden Hausratten einzeln unter denselben Umweltbedingungen eingesetzt, um Schäden am Kopf zu verhindern.
    HINWEIS: Das Studienflussdiagramm und die entsprechenden Messungen sind in Abbildung 1A dargestellt. Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

2. Multielektroden-Implantationsoperation

  1. Betäuben Ratten mit Isofluran (3–4 % Induktion, 2 % Erhaltung), das mit Sauerstoff in 2 L/min verabreicht wird.
  2. Setzen Sie die Ratte in einen stereotaxischen Rahmen und halten Sie die Körpertemperatur mit einem thermostatisch gesteuerten Heizkissen bei 37 °C. Tragen Sie eine Erythromycin-Ophthalmsalbe auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
  3. Rasieren Sie die Kopfhaut und desinfizieren Sie mit 0,5 % Iodophorlösung.
  4. Führen Sie einen Schnitt auf der Kopfhaut in der Mitte durch (1 × 2 cm), um den Schädel freizulegen, und entfernen Sie vorsichtig das Periost mit sterilen Wattestäbchen.
  5. Schädelvorbereitung und Bohrung
    1. Identifizieren Sie Bregma und Lambda und richten Sie den Schädel sowohl in vorder-hinteren als auch in medial-lateralen Ebenen aus.
    2. Bohrlöcher (≤2 mm Durchmesser) werden an Zielkoordinaten mit einem langsamen Zahnbohrer mit intermittierender Kochsalzbewässerung gebohrt.
  6. Elektrodenvorbereitung und Einfügung
    1. Verwenden Sie polyimidisolierte Wolframdrahtelektroden (Schaftdurchmesser: 300 μm) mit einer freiliegenden Spitzenlänge von 4–8 mm (durchtrenntes Ende). Missen Sie die Elektrodenimpedanz (| Z|) bei 1 kHz; zulässige Werte liegen zwischen 7–10 kΩ mit einem Phasenwinkel von 1°–2°.
    2. Elektroden werden langsam in folgende Bereiche eingesetzt: Cg1 (vorderer cingulärer Kortex): AP +1,2 mm, ML −0,2 mm, DV −2,4 mm; CA1 (Hippocampus): AP −3,3 mm, ML −1,8 mm, DV −3,0 mm; EC (entorhinaler Cortex): AP −6,7 mm, ML −4,0 mm, DV −8,0 mm.
    3. Implantiere eine Edelstahl-Schädelschraube über den kontralateralen CA1-Bereich und benutze sie als Masseelektrode.
  7. Elektrodenfixierung und -abschluss
    1. Überprüfen Sie die korrekte Elektrodentiefe und Zielerfassung mit stereotaxischen Koordinaten während der Implantation; Bestätigen Sie die Elektrodenlokalisierung post-hoc durch histologische Identifikation der Elektrodenspuren.
    2. Elektroden und Schrauben mit Zahnharz sichern (30–60 s pro Schicht aushärten).
    3. Verbinden Sie Elektrodenleitungen mit einem Headstage-Stecker und nähen Sie die umliegende Haut.
  8. Zeichnen Sie die Ausgangs-EEG-Aktivität für 30 Minuten zum entsprechenden Zeitpunkt auf (Abbildung 1A) auf, während die Anästhesie aufrechterhalten wird.

3. Postoperative Versorgung und Behandlung

  1. Lassen Sie die Ratten sich auf einer Wärmeplattform erholen, bis sie vollständig gehfähig sind.
  2. Hausratten unter kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit, weicher Einstreu und ad libitum Zugang zu Futter und Wasser zur Stressminderung.
  3. Inspizieren Sie täglich die Schnittstellen, die Stabilität der Elektroden und die Integrität der Kopfbühne.
  4. Haustiere einzeln, tägliche Wundpflege (0,5 % Iodophorlösung) und Überwachung des Wohlstands ohne pharmakologische Wirkstoffe zur Vermeidung von Störeffekten, wie frühere Studien 6,18 zeigen.

4. Längsschnitt-EEG-Aufzeichnung

  1. Führen Sie EEG-Aufnahmen an den Tagen 1, 4, 7, 10 und 13 nach der Einnistung durch.
  2. Betäuben Ratten mit Isofluran (3–4 % Induktion, 1,5 % Erhaltung).
  3. Stabilisiere Aufnahmekabel, um Bewegungsartefakte und elektromagnetische Störungen zu minimieren.
  4. Zeichnen Sie das EEG für 30 Minuten ab 9:00 Uhr auf, um die zirkadiane Variabilität zu kontrollieren.
  5. Verwenden Sie folgende Erfassungsparameter: Abtastrate: 1.000 Hz; Hardware-Bandpassfilter: 0,5–40 Hz; Verstärkung: 8–10. Zusätzliche Filterung und Artefaktunterdrückung offline durchführen.
  6. Akzeptable EEG-Signale zeigen stabile Basislinien, minimales Rauschen oder Drift sowie physiologisch plausible Amplitude und Frequenzgehalt; Aufnahmen werden ausgeschlossen, die diese Kriterien nicht erfüllen.

5. EEG-Signalanalyse

  1. EEG-Signale mit der referenzierten Software analysieren.
  2. Signale visuell inspizieren und Segmente mit Bewegungs- oder elektrischen Artefakten entfernen.
  3. Berechnen Sie die Leistungsspektraldichte (PSD) mit FFT (Pwelch-Funktion).
  4. Quantifizieren Sie die oszillatorische Aktivität durch Berechnung der Fläche unter der PSD-Kurve (AUCpsd) für vordefinierte Frequenzbänder.
  5. Berechnen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) als Verhältnis von Leistung im Zielsignalband (0,5–40 Hz) zum Hintergrundrauschband (40–80 Hz).
    HINWEIS: Stabile Signale zeigen konsistente PSD-Profile über aufeinanderfolgende Aufzeichnungstage.

6. Schmerzbeurteilung

  1. Schmerz wird mit der Rat Grimace Scale19,20 einen Tag vor der Operation (Baseline) und an allen Aufzeichnungstagen bewertet.
  2. Verwenden Sie eine Beobachtungskammer (25 cm × 15 cm × 15 cm) und positionieren Sie die Kamera in der oberen linken Ecke in einem 45°-Winkel.
  3. Erfassen Sie Gesichtsaufnahmen, randomisieren Sie die Bildreihenfolge und bewerten Sie Orbitalverengung, Nasen-/Wangenverflachung, Schnurrhaarveränderungen und Ohrposition (Skala 0–2).
  4. Summieren Sie Werte, um einen Gesamtschmerzwert pro Tier und Zeitpunkt zu erzeugen.

7. Fressverhalten und Körpergewicht

  1. Wiegen Sie Ratten und messen Sie täglich die Nahrungsaufnahme. Berechnen Sie die Nahrungsaufnahme, indem Sie die restliche Nahrung nach 24 Stunden von vorgewogenem Futter abziehen.
  2. Rattenverhalten kontinuierlich 24 Stunden mit einem Videoaufzeichnungssystem aufzeichnen. Fressverhalten offline von Experimentatoren analysieren, die experimentell blind sind.
  3. Überwachen Sie das Füttern kontinuierlich. Definieren Sie einen Fütterungsangriff als ≥1 Ereignis, das 5 S. bis 15 Minuten21 dauert.
  4. Berechnung der Körpergewichtsanpassung (g × 100/g Körpergewicht); mittlere Nahrungsaufnahme pro Mahlzeit (g/Anzahl der Mahlzeiten-Ereignisse); und Aufnahmerate (g/gesamte Fütterungsdauer in Min).

8. Neuroinflammationsbewertung

  1. Ratten werden mit einer Überdosis Isoflran eingeschläfert, gefolgt von Enthauptung.
  2. Nehmen Sie Hirngewebe aus implantierten Hemisphären an den Basis- und postoperativen Tagen 1, 4, 7, 10 und 13 (n = 3 pro Zeitpunkt).
  3. Westliche Blotting
    1. Entfernen Sie das gesamte Protein aus dem Gehirngewebe und quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinconinsäure-(BCA)-Test. Stellen Sie alle Proben auf eine Endkonzentration von 2 μg/μL an und denaturieren Sie bei 100 °C für 5 Minuten.
    2. Proteine durch 10 % SDS-PAGE bei 120 V für 90 Minuten trennen und pro Lane 20 μg Protein laden.
    3. Proteine auf eine PVDF-Membran bei 300 mA für 1 Stunde übertragen.
    4. Blockieren Sie Membranen und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) (1:1.000).
    5. Inkubieren mit HRP-konjugiertem Sekundärantikörper (1:20.000, 2 H, Raumtemperatur).
    6. Visualisieren Sie Bänder mit ECL und bilden Sie mit einem chemilumineszenzbildenden Bildgebungssystem im automatischen Belichtungsmodus.
    7. Führe Densitometrie mit ImageJ durch.

9. Sicherheit und Abfallentsorgung

  1. Behandle Isofluran mit einem aktiven Plünderungssystem.
  2. Entsorgen Sie scharfe Gegenstände und biologisches Gewebe in ausgewiesenen Bio-Hazard-Behältern.
  3. Entsorgen Sie chemische Reagenzien gemäß institutionellen Sicherheitsvorschriften.

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Ergebnisse

Alle 21 SD-Ratten tolerierten die intrakranielle Elektrodenimplantation und schlossen das Studienprotokoll ab. Längsschnittmessungen (EEG, Körpergewicht, Fressverhalten und Schmerzwerte) wurden zeitweise von denselben Tieren erfasst (n = 3), während neuroinflammatoriske Bewertungen zu jedem Zeitpunkt terminale Messungen waren (n = 3 Ratten pro Tag: Ausgangswert, 1, 4, 7, 10, 13). Die Daten wurden mit Shapiro-Wilk-Tests auf Normalität geprüft. Normal verteilte Daten werden als Mittelwert ...

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Diskussion

Die chronische intrakranielle Elektrodenimplantation für die EEG-Überwachung bei Nagetieren bleibt eine Grundtechnik zur Untersuchung neuronaler Dynamik mit hoher temporaler Auflösung. Die Einrichtung eines geeigneten postoperativen Überwachungs- und Erholungsfensters ist entscheidend, um sowohl die Signalzuverlässigkeit als auch das Tierwohl sicherzustellen. Diese Studie bietet einen strukturierten Rahmen zur Bewertung der elektrophysiologischen Stabilität, der Verhaltensergebnisse und ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Excellent Young Talents Project der Capital Medical University (A2308) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aktives Isofluoran-Scavening-SystemRDWR510-31-6
TiereCharles River
BCA-TestkitSolarbioPC0020
ChemiDoc BildgebungssystemBio-Rad17001401
ZahnharzScheitelpunktXG473P03
ECL-DetektionsreagenzSolarbioPE0010
Erythromycin-AugensalbeRenhe1,00E+11
Sekundärer Anti-Kaninchen-AntikörperProteintechSA00001-2
GraphPad Prism 9.0GraphPad-SoftwareStatistische Analyse-Software
Headstage-VerstärkerBIOPAC Systems IncEEG100C
HeizpolsterYuYan-TechnologieS-100
ImageJNationale GesundheitsinstituteBildanalyse-Software
IL-6 polyklonaler AntikörperProteintech21865-1-AP
IodophorCleanboom430-DFXDY100
IsofluraneHeckantriebR510 & Strich; 31
Neuro-Aufzeichnungsgerät mit NeuroExplorer (v 5.012)PlexonOPX-A1600-128-16CElektrophysiologische Datenanalyse-Software
PVDF-MembranCytivaRPN303F
SDS-PAGE-SystemBio-Rad1658004
Stereotaktische ApparaturZhongShi-WissenschaftstechnologieZS-PDC
TNF-α Polyklonaler AntikörperProteintech17590-1-AP
TransfergerätBio-Rad1703937
WolframdrahtA-M-Systeme785500
VideoaufzeichnungssystemBasleracA1920
Β-Aktin monoklonaler AntikörperProteintech2D4H5

Referenzen

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