Method Article

Auswirkungen verschiedener Extraktionsmethoden auf die in-vitro-Bioaktivitätsprofile von Terfezia claveryi

DOI:

10.3791/69950

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March 20th, 2026

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1Department of Biophysics, Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Genetics and Bioengineering, Faculty of Engineering and Architecture, Kirsehir Ahi Evran University, 3Department of Physiology, Gulhane Faculty of Medicine, University of Health Sciences, 4Department of Medical Services and Techniques, Medical Laboratory Techniques Program, Vocational School of Health Services, Kirsehir Ahi Evran University, 5Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Kirsehir Ahi Evran University

In This Article

Summary

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Die in-vitro-Bioaktivität von Terfezia claveryi-Extrakten hing von der biophysikalischen Extraktionsmethode und der Lösungsmittelpolarität ab. Der Wasserextrakt aus Maceration-assisted extraction (MAE) zeigte die stärkste antioxidative Aktivität, während der Soxhlet-Extrakt (SE)-Extrakt eine stärkere Zytotoxizität in SH-SY5Y-Zellen hervorrief. Diese Ergebnisse zeigen klare methodabhängige Unterschiede in der in-vitro-Bioaktivität von Terfezia claveryi-Extrakten.

Abstract

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Terfezia claveryi ist ein essbarer Wüstentrüffel, der traditionell in trockenen Gebieten verzehrt wird. In den letzten Jahren hat es aufgrund seiner potenziellen antioxidativen, antimikrobiellen und therapeutischen Eigenschaften zunehmendes wissenschaftliches Interesse geweckt, was auf mögliche Anwendungen im Lebensmittel- und Gesundheitsbereich hindeutet. Trotz wachsender Belege für ihr biologisches Potenzial ist der Einfluss verschiedener Extraktionsstrategien auf die Gewinnung bioaktiver Verbindungen und das resultierende In-vitro-Bioaktivitätsprofil von Terfezia claveryi in der Literatur bislang nicht geklärt. In dieser Studie wurde die in-vitro-Bioaktivität von Terfezia-claveryi-Extrakten bewertet, die mit verschiedenen Extraktionsmethoden und Lösungsmitteln mit unterschiedlicher Polarität gewonnen wurden. Die Extraktionserträge wurde bestimmt, und die gewonnenen Extrakte wurden mit etablierten Testsystemen auf antioxidative, antimikrobielle, antibiofilmische und zytotoxische Aktivitäten geprüft. Die antioxidative Kapazität wurde mit 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-Azino-bis(3-Ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure) (ABTS) und Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP)-Tests gemessen, während zytotoxische Effekte in SH-SY5Y-Neuroblastomzellen untersucht wurden. Die Extraktionserträge variierte je nach Methode und Lösungsmittelpolarität, wobei der höchste Ertrag aus dem wässrigen Extrakt mit der ultraschallunterstützten Extraktionsmethode (UAE) erzielt wurde (18,40 %). Es wurde festgestellt, dass die antioxidative Aktivität je nach Extraktionsmethode signifikante Unterschiede aufwies, und wässrige Extrakte, die mit der macerationsunterstützten Extraktion (MAE) gewonnen wurden, zeigten ein Profil reich an phenolischen Verbindungen sowie die stärkste Radikal-Scavenging-Fähigkeit. Die LC-MS/MS-Analyse dieses Extrakts ergab das Vorhandensein von neun phenolischen Verbindungen; Quininsäure und Chlorogensäure wurden als die dominanten Komponenten identifiziert. Im Gegensatz dazu führten Soxhlet-abgeleitete Extrakte zu stärkeren zytotoxischen Effekten in SH-SY5Y-Zellen. Antimikrobielle und antibiofilmische Antworten wiesen relativ begrenzte Unterschiede zwischen den Extraktionsmethoden auf, was auf eine geringere Abhängigkeit von der Extraktionsstrategie für diese Aktivitäten hinweist. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die biophysikalische Extraktionsmethode und die Auswahl des Lösungsmittels entscheidende Faktoren für das in-vitro-Bioaktivitätsprofil von Terfezia claveryi-Extrakten sind, mit ausgeprägten Effekten für antioxidative und zytotoxische Aktivitäten.

Introduction

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Die Verwendung verschiedener Pilzarten zur Verbesserung der Gesundheit sowie zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten reicht bis in die antike Zeit 1,2,3 zurück. Makropilze werden im Allgemeinen in zwei Gruppen eingeteilt: Epigäous (Pilze) und hypogäöse (Trüffel)4. Bekannt als Wüstentrüffel, ist Terfezia claveryi (T. claveryi) eine weltbekannte und essbare Trüffelart aus der Gattung Terfezia5. T. claveryi ist häufig in trockenen und halbtrockenen Regionen verbreitet, in denen Helianthemum-Arten häufig vorkommen: 6,7,8,9,10,11. In den letzten Jahren hat die weltweite Belastung durch chronische Krankheiten wie Krebs und neurodegenerative Erkrankungen deutlich zugenommen, was den dringenden Bedarf an neuen, sicheren und wirksamen Therapeutika unterstreicht. Laut globalen Gesundheitsberichten bleibt Krebs eine der häufigsten Todesursachen weltweit, während neurodegenerative Erkrankungen parallel zu einer alternden Bevölkerung weiterhin zunehmen. Angesichts dieses wachsenden öffentlichen Gesundheitsproblems ist die Untersuchung von Naturprodukten, die aus Pilzen und Heilpflanzen gewonnen werden, als potenzielle Quellen bioaktiver Verbindungen zu einer wichtigen Forschungspriorität12 geworden.

Parallel dazu stellt das rasche Aufkommen der antimikrobiellen Resistenz eine weitere große Bedrohung für die globale Gesundheit dar. Die Arzneimittelresistenz hat die Wirksamkeit traditioneller Antibiotika erheblich verringert, was einen dringenden Bedarf an alternativen antimikrobiellen Strategien schafft13. Sekundärmetabolite, die aus natürlichen Quellen stammen, insbesondere phenolische und polyphenolische Verbindungen, erregen aufgrund ihrer vielfältigen antimikrobiellen Mechanismen und ihrer geringen Tendenz zur Entwicklung von Resistenzenzunehmendes Interesses 14. Oxidativer Stress ist ein grundlegender mechanistischer Faktor, der vielen chronischen Krankheiten zugrunde liegt, darunter Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und metabolische Syndrome. Eine übermäßige Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) kann letztlich die zelluläre Homöostase stören, indem sie DNA-Schäden, Lipidperoxidation und Proteinoxidation verursacht. In diesem Zusammenhang gelten natürliche Antioxidantien, die freie Radikale abfressen und das Redox-Gleichgewicht regulieren können, als vielversprechende Mittel zur Abschwächung oxidativer Schäden und des Krankheitsverlaufs15.

Trüffel sind reich an ungesättigten Fettsäuren, Proteinen, Mineralstoffen, Vitaminen, Aminosäuren, Phenolen und Polyphenolen, Komponenten, die mit antimikrobiellen, antioxidativen und krebshemmendenEigenschaften in Verbindung gebracht werden. Ihre antioxidative Kapazität wurde mit ihrer Wirksamkeit bei der Zerstreuung freier Radikale in Verbindung gebracht 25,26,27. Unter Trüffelarten ist T. claveryi besonders bemerkenswert wegen seiner essbaren Struktur, seines regionalen wirtschaftlichen Werts und des gemeldeten Reichtums an phenolischen Verbindungen23. Trotz aufkommender Belege bezüglich seines traditionellen Konsums und biologischen Wirkens bleiben umfassende Studien, die untersuchen, wie Extraktionsstrategien seine chemische Zusammensetzung und biologische Effekte beeinflussen, begrenzt.

Die Rückgewinnung biologisch aktiver Verbindungen aus Trüffeln wird stark von Extraktionsparametern beeinflusst, einschließlich der aufgetragenen Extraktionstechnik und der Lösungsmittelpolarität. Biophysikalische Extraktionsmethoden wie ultraschallunterstützte Extraktion (VAE), Maceration-unterstützte Extraktion (MAE) und Soxhlet-Extraktion (SE) zeigen signifikante Unterschiede hinsichtlich Energieeinsatz, Extraktionseffizienz und Selektivität für polare Verbindungen28. Die meisten Forschungen basieren jedoch auf einer einzigen Extraktionsmethode oder begrenzten Lösungsmittelsystemen, und Studien, die die Auswirkungen dieser Methoden auf das in-vitro-biologische Aktivitätsprofil von T. claveryi vergleichend untersuchen, sind begrenzt. Daher vergleicht diese Studie systematisch mehrere biophysikalische Extraktionsmethoden mit Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität, um die in vitro biologischen Aktivitäten von T. claveryi-Extrakten zu bewerten. Es wurde vermutet, dass die Extraktionsmethode und die Lösungsmittelpolarität zu methodenabhängigen Unterschieden in biologischen Aktivitäten führen würden. Dementsprechend sind die Ziele der Studie: (i) der Vergleich der Extraktionserträge zwischen verschiedenen Methoden und Lösungsmitteln, (ii) die Bewertung methodabhängiger Variationen in antioxidativen und zytotoxischen Aktivitäten sowie (iii) die Untersuchung antimikrobieller und antibiofilmischer Reaktionen unter Berücksichtigung ihrer Empfindlichkeit gegenüber der Extraktionsstrategie.

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Protocol

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HINWEIS: Der gesamte experimentelle Arbeitsablauf für die Herstellung und Analyse von T. claveryi-Extrakten ist schematisch in Abbildung 1 zusammengefasst. Alle in der Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle beschrieben.

1. Authentifizierung und Herstellung von Pilzmaterialien

  1. Sammlung und Verarbeitung von Materialien
    HINWEIS: Frische T.claveryi-Trüffel wurden im Mai 2023 aus Steppen und sandigen, unbebauten (nicht-landwirtschaftlichen) Flächen in der Provinz Kırsehir, Zentralanatolien, Türkei, gesammelt. Die Probenahme erfolgte an drei verschiedenen Orten: Dedeli Village (38°54′15,8" N, 34°06′40,3" E; ~1050 m über dem Meeresspiegel), Buyukkayapa Village (38°53′45,1" N, 34°19′37,5" E; ~1020 m über dem Meeresspiegel) und Akcaagıl Village (39°01′39,9" N, 34°12′39,8" E; ~1100 m über dem Meeresspiegel). Die Sammelstellen zeichnen sich durch ein halbtrockenes kontinentales Klima mit kalten Wintern, heißen und trockenen Sommern sowie einer durchschnittlichen jährlichen Niederschlagsmenge von etwa 380–420 mm aus. Alle Proben wurden während der natürlichen Fruchtzeit aus Gebieten ohne jüngste landwirtschaftliche Aktivitäten entnommen, um eine mögliche anthropogene Kontamination zu minimieren.
    1. Wählen Sie saubere und unbeschädigte Trüffel aus, schälen Sie sie und waschen Sie dreimal mit destilliertem Wasser.
    2. Schneiden Sie die Proben in kleine Stücke und trocknen Sie im Schatten, bis ein konstantes Gewicht erreicht ist (etwa 20 Tage).
    3. Pulverisieren Sie das getrocknete Material mit einer mechanischen Mühle und führen Sie ein Sieb mit 328 Mikron (50 Gitter).
    4. Lagern Sie die verarbeiteten Proben in Ziplock-Beuteln in einer kühlen, trockenen und dunklen Umgebung bei Raumtemperatur auf, bis weitere Analysen.
  2. Molekulare Identifikation von T. claveryi
    1. Isolieren Sie genomische DNA aus getrockneten T. claveryi-Proben zur molekularen Identifikation.
    2. Bewerten Sie die DNA-Menge und Reinheit spektrophotometrisch.
    3. Durchführung der Speziesidentifikations-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch Amplifizierung des internen transkribierten Abstandsraums (ITS) mit den Universalprimern ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) und ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′).
    4. PCR-Amplifikationsprodukte werden durch Elektrophorese auf einem 1,5%igen Agarosegel aufgelöst, das in einem 1x-TAE-Puffer hergestellt und unter UV-Beleuchtung nach Ethidiumbromid-Färbung visualisiert wird.
    5. Reinigen Sie Einzelband-PCR-Produkte gemäß den Herstelleranweisungen29. Subjekt gereinigte Amplicons zur Sanger-Sequenzierung.
    6. Assembler Vorwärts- und Rückwärtssequenzlesungen in Konsenssequenzen mithilfe des Contig Assembly Programme (CAP)-Algorithmus.
    7. Die Artidentität wurde durch den Vergleich der Konsens-ITS-Sequenz mit Referenzsequenzen in öffentlichen Datenbanken bestätigt.
      HINWEIS: Ein Gutscheinexemplar von T. claveryi wurde zur zukünftigen Referenz in der Laborsammlung aufbewahrt. Die Artenbestimmung wurde durch eine ITS-basierte molekulare Analyse bestätigt (Supplementary File 1).

2. Herstellung und Extraktion von Pilzmaterialien

  1. Zubereitung von T. Claveryi-Extrakten
    1. Wiege etwa 30 g getrocknetes T. claveryi-Pulver .
    2. Fügen Sie 150 ml Lösungsmittel (Methanol, Aceton, N-Hexan, Ethylacetat oder destilliertes Wasser) hinzu, um ein konstantes Feststoff-Flüssigkeits-Verhältnis über alle Extraktionsmethoden hinweg aufrechtzuerhalten.
    3. Verwenden Sie für alle Extraktionsverfahren analytische Lösungsmittel.
    4. Filtern Sie jeden Extrakt unter reduziertem Druck mit hochwertigem Filterpapier.
    5. Konzentrieren Sie die Filtrate unter reduziertem Druck bei 30–45 °C mit einem Rotationsverdampfer.
    6. Gefriertrocknen (lyophilisieren) die konzentrierten Extrakte, bis die vollständige Lösungsmittelentfernung erreicht ist.
    7. Lagern Sie die getrockneten Rohölextrakte bei −20 °C bis zur weiteren Analyse.
      HINWEIS: Wenden Sie identische Nachbearbeitungsschritte auf alle Proben an, um methodische Konsistenz und Vergleichbarkeit sicherzustellen.
  2. Biophysikalische Extraktionsmethoden
    1. Macerationsunterstützte Extraktion (MAE)
      1. Geben Sie die pulverisierte T. claveryi-Probe in einen geschlossenen Extraktionsbehälter.
      2. Fügen Sie das ausgewählte Lösungsmittel hinzu und halten Sie dabei ein konstantes Verhältnis von Lösungsmittel zu Feststoff.
      3. Die Mischung bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen 72 Stunden inkubieren.
      4. Halten Sie die Behälter geschlossen, um eine Verdunstung von Lösungsmitteln zu verhindern.
      5. Wenden Sie während der Macerationsphase keine äußere Bewegung an.
      6. Lassen Sie die Mischung am Ende der Extraktionsphase absetzen.
      7. Filtern Sie den Extrakt vor der weiteren Verarbeitung.
    2. Soxhlet-Extraktion (SE)
      HINWEIS: Sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Zirkulation des Kondensatorwassers und vermeiden Sie trockenes Erwärmen während des Rückflusses.
      1. Geben Sie die pulverisierte Probe in einen Cellulose-Extraktions-Fingerhut.
      2. Positioniere den Fingerhut in der Soxhlet-Extraktionskammer, verbunden mit einer Rundbodenflasche.
      3. Fügen Sie das ausgewählte Lösungsmittel in die Flasche und halten Sie dabei ein konstantes Verhältnis von Lösungsmittel zu Feststoff bei.
      4. Erhitze das Lösungsmittel mit einem thermostatisch gesteuerten Heizmantel zum Reflux.
      5. Kontinuierliche Extraktion für 24 Stunden aufrechterhalten.
      6. Halten Sie die Extraktionstemperatur am Siedepunkt jedes Lösungsmittels (n-Hexan: 68,7 °C; Ethylacetat: 77,1 °C; Methanol: 64,7 °C; Aceton: 56 °C; destilliertes Wasser: 100 °C).
    3. Ultraschallunterstützte Extraktion (VAE)
      HINWEIS: Überwachen Sie die Temperatur kontinuierlich, um Überhitzung während der Sonikation zu vermeiden.
      1. Geben Sie die pulverisierte T. claveryi-Probe in das Extraktionsgefäß.
      2. Fügen Sie das ausgewählte Lösungsmittel hinzu und halten Sie dabei ein konstantes Verhältnis von Lösungsmittel zu Feststoff.
      3. Sonikieren Sie das Gemisch auf einer festen Frequenz von 35 kHz und einer Ausgangsleistung von 520 W für 25 Minuten.
      4. Halten Sie die Extraktionstemperatur bei etwa 30 °C.
      5. Füge Eis in 5-Minuten-Intervallen hinzu, um die Temperatur während der Sonikation bei 25–28 °C zu halten.
  3. Extraktionseffizienz
    1. Wiegen Sie das getrocknete Pilzmaterial (Wp) vor der Extraktion.
    2. Wiegen Sie den getrockneten Rohölextrakt (Wext.) nach vollständiger Lösungsmittelentfernung.
    3. Berechnen Sie die Extraktionseffizienz mit Gleichung (1).
      figure-protocol-1(1)
    4. Jeden getrockneten Rohölextrakt wird in seinem jeweiligen Lösungsmittel erneut aufgelöst, um eine Lagerlösung mit einer standardisierten Konzentration von 10 mg/mL herzustellen.
    5. Bereiten Sie vor jedem In-vitro-Bioaktivitätsexperiment frisch Brühlösungen vor.
      HINWEIS: Standardisieren Sie alle Extraktkonzentrationen, um eine vergleichbare Dosierung bei nachfolgenden Bioaktivitätstests sicherzustellen.

3. Bestimmung der antioxidativen Aktivität

  1. Führen Sie eine Analyse der antioxidativen Aktivität mit DPPH-, ABTS- und FRAP-Assays durch.
  2. Bereiten Sie fünf verschiedene Extraktkonzentrationen von 0,25 bis 1,0 mg/mL aus frisch zubereiteten Brühlösungen her.
  3. Führen Sie alle Messungen in dreifacher Ausführung durch, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
  4. Zeichnen Sie Absorptionswerte spektrophotometrisch mit einem Mikroplattenleser auf.
    HINWEIS: Führen Sie alle Assays gemäß etablierten Literaturprotokollen mit geringfügigen Änderungen durch.
  5. DPPH-Radikal-Plünderungsaktivität
    HINWEIS: Die DPPH-Radikal-Scavenging-Aktivität von T. claveryi-Extrakten wurde nach der in der Literatur beschriebenen Methode mit geringfügigen Änderungen30 bewertet. Schützen Sie DPPH-Lösung und Reaktionsgemische vor Lichteinwirkung.
    1. Bereiten Sie eine DPPH-Lösung in 70 % Methanol vor.
    2. Stellen Sie die DPPH-Lösung auf eine Absorption von 1,00 ± 0,02 bei 517 nm ein.
    3. Pipette 50 μL Extrakt in unterschiedlichen Konzentrationen in einen Mikroplattenbrunnen.
    4. Fügen Sie jedem Bohrloch 250 μL DPPH-Lösung hinzu.
    5. Inkubiere die Reaktionsmischung im Dunkeln bei Zimmertemperatur für 30 Minuten.
    6. Missen Sie die Absorption bei 517 nm mit einem Mikroplattenspektrophotometer.
    7. Verwenden Sie Methanol als Negativkontrolle und Ascorbinsäure als positive Kontrolle.
    8. Konstruiere Dosis-Antwort-Kurven und berechne IC₅₀-Werte, um die Radikal-Scavenging-Aktivität zu quantifizieren.
  6. ABTS-Kationenradikal-Fressenaktivität
    HINWEIS: Führen Sie den ABTS-Radikal-Scavning-Test nach der in der Literatur beschriebenen Methode mit geringfügigen Änderungen31 durch. Bereiten Sie die ABTS⁺-Radikallösung mindestens 16 Stunden vor der Anwendung vor und schützen Sie sie vor Licht.
    1. Erzeugen Sie die ABTS-Radikallösung, indem Sie das Reaktionsgemisch 16 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Verdünnen Sie vor der Analyse 1 ml ABTS-Lösung mit 80 ml Ethanol.
    3. Stellen Sie die Absorption der verdünnten ABTS-Lösung auf 0,80 ± 0,02 bei 734 nm an.
    4. Pipette 50 μL Extrakt in unterschiedlichen Konzentrationen in einen Mikroplattenbrunnen.
    5. Fügen Sie jedem Bohrloch 250 μL ABTS-Lösung hinzu.
    6. Die Mischung 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren lassen.
    7. Missen Sie die Absorption bei 734 nm mit einem Mikroplattenspektrophotometer.
    8. Konstruiere Dosis-Antwort-Kurven und berechne IC₅₀-Werte.
  7. Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) Test
    HINWEIS: Führen Sie den FRAP-Test nach der in der Literatur vorgeschlagenen Methode mit geringfügigen Änderungen32 durch. Bereiten Sie das FRAP-Reagenz vor der Verwendung frisch vor und schützen Sie das Reaktionsgemisch vor Licht.
    1. Bereiten Sie das FRAP-Reagenz gemäß dem referenzierten Protokoll vor.
    2. Pipettieren Sie 20 μL Extrakt in unterschiedlichen Konzentrationen in einen Mikroplattenbrunnen.
    3. Fügen Sie 280 μL frisch vorbereitetes FRAP-Reagenz hinzu.
    4. Das Reaktionsgemisch 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
    5. Missen Sie die Absorption bei 593 nm mit einem Mikroplattenspektrophotometer.
    6. Erzeugen Sie eine Kalibrierungskurve unter Verwendung von Trolox als Standard.
    7. Die antioxidative Kapazität wird als mg Trolox-Äquivalente (TE) pro Gramm Extrakt ausgedrückt.

4. Analyse des Gesamtphenolgehalts (TPC)

HINWEIS: Bestimmen Sie den gesamten phenolischen Gehalt (TPC) von T. claveryi-Extrakten mit der Folin–Ciocalteu-Methode, wie in der Literatur beschrieben, mit geringfügigen Änderungen33. Schützen Sie die Reaktionsgemische während der Inkubation vor Licht. Bereiten Sie die Natriumcarbonatlösung vor der Anwendung frisch vor.

  1. Bereiten Sie Extraktlösungen mit einer Konzentration von 1 mg/mL aus frisch zubereiteten Brühlösungen vor.
  2. Pipettieren Sie 25 μL Extrakt in einen Mikroplattenbrunnen, fügen Sie 75 μL destilliertes Wasser hinzu und geben Sie anschließend 25 μL Folin–Ciocalteu-Reagenz.
  3. Die Mischung 6 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
  4. Gib 100 μL 7 % (w/v) Natriumcarbonatlösung zu jedem Brunnen hinzu.
  5. Das Reaktionsgemisch 90 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren lassen.
  6. Missen Sie die Absorption bei 665 nm mit einem Mikroplattenspektrophotometer.
  7. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve unter Verwendung von Gallensäure als Standard und berechnen Sie den gesamten phenolischen Gehalt, wobei die Ergebnisse als mg Gallsäureäquivalente (GAE) pro ml Extrakt angegeben werden.

5. Phytochemische Analyse mittels LC-MS/MS

HINWEIS: Führen Sie eine LC-MS/MS-Analyse nach zuvor veröffentlichten chromatographischen Methoden mit geringfügigen Änderungendurch 34. Filtern Sie alle Proben und mobilen Phasen durch 0,22-μm-Membranfilter und entfetten Sie die mobilen Phasen vor der Analyse.

  1. Wählen Sie den Extrakt mit dem höchsten Gesamtphenolgehalt für quantitative phytochemische Profilierungen.
  2. Führen Sie eine chromatographische Trennung mit einer umgekehrten C18-Säule durch, die bei 30°C gehalten wird.
  3. Bereite die mobile Phase vor, bestehend aus (A) 0,1 % Ameisensäure in deionisiertem Wasser und (B) 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril, setze die Durchflussrate auf 0,4 mL/min, passe das Injektionsvolumen auf 5 μL an und stelle die Gesamtlaufzeit auf 17 Minuten fest.
  4. Durchführung von massespektrometrischer Detektion unter Elektrosprüh-Ionisationsbedingungen (ESI) unter Verwendung von Stickstoff als Trocknungs-, Mantel- und Vernebelgas.
  5. Stellen Sie die Temperatur des Trocknungsgases auf 350 °C mit einer Durchflussrate von 12 L/min ein, stellen Sie die Temperatur des Mantelgases auf 250 °C mit einer Durchflussrate von 5 L/min ein und stellen Sie den Verneblerdruck auf 55 psi ein.
  6. Erstellen Sie externe Kalibrierungskurven für jeden phenolischen Standard und quantifizieren Sie die Analyten anhand der entsprechenden Kalibrierungskurven.

6. Antimikrobieller Aktivitätstest

HINWEIS: Bewerten Sie die antibakterielle Wirkung mit der Agar-Brunnen-Diffusionsmethode gemäß etablierten mikrobiologischen Protokollen. Führen Sie alle mikrobiologischen Verfahren unter aseptischen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank durch. Sterilisiere alle Materialien vor und nach der Anwendung.

  1. Wählen Sie folgende Typstämme für antimikrobielle Tests aus: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 14579, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Acinetobacter baumannii ATCC 17978, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 und Enterobacter aerogene ATCC 13048.
  2. Inokulieren Sie jeden Bakterienstamm in Trypton-Sojabrühe (TSB) und inkubieren Sie bei der optimalen Wachstumstemperatur, bis eine optische Dichte von OD₆₀₀ = 0,7 erreicht wird.
  3. Verteile die Bakterienkulturen gleichmäßig auf Trypton-Sojaagar-(TSA)-Platten mit einem sterilen Abstrich.
  4. Punch bohrt aseptisch in den Agar mit einem sterilen Korkbohrer.
  5. Fügen Sie 100 μL jedes Extrakts (100 μg/mL) in die entsprechenden Bohrungen ein.
  6. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 18 Stunden.
  7. Messen Sie die Durchmesser der Hemmungszonen um jeden Brunnen, um die antimikrobielle Aktivität zu bewerten.
  8. Führen Sie alle Experimente in dreifacher Ausführung durch und geben Sie die Ergebnisse als Mittelwerte aus.

7. Biofilm-Hemmung

HINWEIS: Bewerten Sie die Antibiofilmaktivität mit einem Kristallviolett-Färbungstest im Vergleich zu Referenz-Bakterienstämmen. Führen Sie alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen durch und vermeiden Sie es, die haftenden Biofilme während der Waschschritte zu stören.

  1. Wählen Sie Escherichia coli ATCC 25922 und Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 als Referenzstämme aus und kultivieren Sie sie in TSB bei 37 °C bis zum Erreichen der logarithmischen Wachstumsphase.
  2. Stellen Sie die bakteriellen Suspensionen auf eine optische Dichte von OD₆₀₀ = 0,132 ein.
  3. Pipettieren Sie 100 μL Extraktlösungen (0,625–10 mg/mL) in sterile 96-Bohrloch-Polystyrol-Mikrotiterplatten, geben Sie 100 μL bakterielle Suspension zu jedem Brunnen und mischen Sie vorsichtig.
  4. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 24 Stunden. Verwenden Sie Brunnen, die nur TSB enthalten, als Rohlinge und Brunnen mit bakterieller Suspension ohne Extrakt als Kontrollen.
  5. Entfernen Sie vorsichtig nicht haftende Zellen, waschen Sie die Brunnen zweimal mit destilliertem Wasser und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen.
  6. Gib 200 μL 0,4% (w/v) Kristall-Violettlösung zu jedem Brunnen und inkubiere 30 Minuten.
  7. Entfernen Sie überschüssige Flecken, spülen Sie die Brunnen zweimal mit destilliertem Wasser aus und lassen Sie die Platten vollständig trocknen.
  8. Fügen Sie Ethanol hinzu, um den gebundenen Farbstoff zu löslich zu machen, und messen Sie die Absorption bei 595 nm mit einem Mikroplattenleser.
  9. Berechnen Sie die Antibiofilmaktivität mit Gleichung (2).
    figure-protocol-2(2)

8. Analyse von Zellkultur und zytotoxischer Aktivität (MTT-Assay)

HINWEIS: Bewerten Sie zytotoxische Effekte mit dem MTT-Assay gemäß den Standard-Zellviabilitätsprotokollen. Führen Sie alle Verfahren unter sterilen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank durch und erwärmen Sie Medium und Reagenzien auf 37 °C vor der Benutzung.

  1. Beziehen Sie die humane Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y aus einem akkreditierten Zelldepot und kultivieren Sie die Zellen im modifizierten Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin in 25 cm2-Kulturkolben .
  2. Halten Sie die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %CO2 und wachsen Sie die Zellen auf etwa 80 % Konfluenz.
  3. Trennen Sie die Zellen durch Trypsinisierung, säen Sie sie in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 104 Zellen pro Brunnen und inkubieren Sie 24 Stunden, um eine Anheftung zu ermöglichen.
  4. Behandeln Sie die Zellen mit T. claveryi-Extrakten in Konzentrationen von 150, 300, 600, 1200 und 2000 μg/mL und inkubieren Sie 24 Stunden.
  5. Entfernen Sie das Kulturmedium, geben Sie 100 μL frisches Medium mit 10 μL MTT-Lösung zu jedem Brunnen und inkubieren Sie 4 Stunden bei 37 °C.
  6. Aspiratiere das Medium, löse die Formazankristalle durch Zugabe von 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) zu jedem Bohrloch auf und messe die Absorption bei 570 nm mit einem Mikroplattenspektrophotometer.
  7. Führen Sie alle Experimente in dreifacher Ausführung durch.

figure-protocol-3
Abbildung 1: Schematische Übersicht des experimentellen Arbeitsablaufs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

9. Statistische Analyse

  1. Führen Sie statistische Analysen mit geeigneten Statistiksoftwarepaketen durch und vergleichen Sie Kontroll- und Behandlungsgruppen mit dem Student's t-Test oder einer zweiseitigen Varianzanalyse (ANOVA), je nach Anwendung.
  2. Drücken Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus.
  3. Definiere statistische Signifikanz bei p < 0,05.
  4. Zeigen Sie die statistische Signifikanz in Zahlen mit Sternchen wie folgt an: **** für p < 0,0001, *** für p < 0,001, ** für p < 0,01 und * für p < 0,05, und verwenden Sie "ns" zur Kennzeichnung der Nicht-Signifikas.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Molekulare Identifikation von T. claveryi
Die PCR-Amplifikation des ITS-Bereichs erfolgte mit den universellen Primern ITS1 und ITS4 zur molekularen Identifikation von T. claveryi. Die resultierenden Sequenzen wurden analysiert und mit Referenzsequenzen in der NCBI-Datenbank mit dem BLAST-Algorithmus verglichen, was eine endgültige Artenidentifikation ermöglichte (Ergänzungsdatei 1).

Extraktionseff...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die vorliegende Studie etabliert eine vergleichende und standardisierte Extraktions-Bioaktivitätsplattform für T. claveryi und zeigt, dass die Extraktionsstrategie ein entscheidender Faktor sowohl für die chemische Zusammensetzung als auch für die biologische Funktionalität ist. Die wichtigste methodologische Stärke dieses Protokolls liegt in der strengen Kontrolle der Extraktionsparameter, insbesondere des festen Feststoff-Flüssig-Verhältnisses, des standardisierten Lösungsmitt...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen. Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Hauptmanuskript und in den ergänzenden Informationsdateien verfügbar. Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze stehen dem korrespondierenden Autor auf angemessener Anfrage zur Verfügung.

Acknowledgements

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Die Autoren erklärten, dass diese Studie keine finanzielle Unterstützung erhalten habe.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-Bohrloch-Polystyrol-MikrotiterplattenNest Scientific701001Zellkultur- / Prüfplatten
ABTS (2,2'-Azino-bis(3-Ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure))Sigma-AldrichA3219Kationenradikal-Assay
Aceton (analytische Qualität)Sigma-Aldrich179124Extraktionslösungsmittel
Acetonitril (LC-MS-Qualität)Sigma-Aldrich34851Organische mobile Phase
Acinetobacter baumanniiATCCManassas, VA, USAATCC 17978
Triple Quad LC-MS/MS mit 1290 Infinity UPLC-SystemAgilent Technologien6460Quantitative Analyse
Analytische Spalte (C18, 4,6 & Times; 100 mm, 3,5 & mu; m)Agilent Technologien (Zorbax)959990-902Umgekehrte Phasen-Säule
Antioxidative Standards (Ascorbinsäure / Trolox)Sigma-AldrichA7506 / 238813Positive Kontrollen
Angewandte Biosystems 3730xl DNA-AnalysatorenAngewandte Biosysteme 3730xl DNA-AnalysatorenDNA-Sequenzierungssystem
Angewandte Biosysteme & Handel; BigDye™ Terminator v3.1 Zyklus-SequenzierungskitAngewandte Biosysteme 4337455Sanger-Sequenzierungsset
Bacillus cereusATCCManassas, VA, USAATCC 14579
Bioinformatik-Analyse, BioEdit-Software, verwendeter Algorithmus: CAP-Contig-AssemblyIbis BiosciencesNASequenz-Assemblersoftware
Cellulose-Extraktions-FingerhutFischerbrand & Handel;  11724043Verwendet für die Extraktion von Soxhlet
Dimethylsulfoxid (DMSO)Merck102952Lösungsmittel
DNA-Isolationsset (Plant& Pilz-DNA-Isolationsset (Polen)EurX GeneMATRIXE3595DNA-Isolierung 
DPPH (2,2-Diphenyl-1-Pikrylhydrazyl)Sigma-AldrichD9132Radikaler Plünderungsassay
Dulbeccos modifiziertes Eagle MediumSteinbock, DMEM-HA
Enterobacter-AerogeneATCCManassas, VA, USAATCC 13048
Enterococcus faecalisATCCManassas, VA, USAATCC 29212
Escherichia coliATCCManassas, VA, USAATCC 25922
EthanolMerck100983Lösungsmittel
EthylacetatMerck109623Extraktionslösungsmittel
Fetales Rinderserum (FBS)Steinbock-WissenschaftFBS-16A
BigDyeTerminator v3.1 Zyklus-SequenzierungskitThermoFisher4337455Sequenzierungsset
Folin-Ciocalteu-ReagenzSigma-Aldrich 47641Gesamtgehalt des Phenols
AmeisensäureSigma-Aldrich 33015Mobilphasenadditiv
Gallische SäureCarlo Erba406335Kalibrierungskurve
Gen MATRIX Pflanze & Pilz-DNA-IsolationskitEurX E3595DNA-Isolationskit
GraphPad-Prisma (v9)Datenvisualisierung und statistische AnalyseN/AStatistische Analyse
HeizmantelElektrothermisch EME30500Verwendet zur Aufrechterhaltung des Lösungsmittel-Reflux
HighPrep™ PCR Clean-upSystemMAGBIOAC-60005
EisLaborqualität—Temperaturkontrolle während der VAE
Klebsiella pneumoniaeATCCManassas, VA, USAATCC 13883
L-GlutaminSteinbock-WissenschaftDeutschland
Listeria monocytogenesATCCManassas, VA, USAATCC 19115
LyophilisatorScientzN/AGefriertrocknung von Extrakten
Magnetische Perle; basiertes PCR-ReinigungssystemMAGBIOAC-60005PCR
MethanolMerck106009Extraktionslösungsmittel
n-HexanMerck103701Extraktionslösungsmittel
Penicillin/StreptomycinSteinbock-WissenschaftDeutschland
Pseudomonas aeruginosaATCCManassas, VA, USAATCC 27853
Filterpapier (Nr. 541)Cytiva1541–125 VIm Extraktfiltrationsprozess
RotationsverdampferBuchi R10011100V101Lösungsmittelentfernung
Shigella dysenteriaeATCCManassas, VA, USAATCC 13313
NatriumcarbonatMerck106392Totale phenolische Analyse
SPECTROstar Nano Mikroplattenleser BMG LabtechAbsorptionsmessungen
Staphylococcus aureusATCCManassas, VA, USAATCC 25923
Staphylococcus epidermidisATCCManassas, VA, USAATCC 12228
Statistische Analysesoftware (SPSS, v23)DatenanalyseNA
Thermo Scientific Nanodrop 2000 Thermo Fisher ScientificND-2000
Trypton-Sojaagar (TSA)MerckDeutschland—
Trypton-Sojabrühe (TSB)MerckDeutschland—
UltraschallhomogenisatorScientzSCIENTZ-650LUltraschallunterstützte Extraktion

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