Ein Mausmodell der lymphatischen Ablation des Spenderherzs mittels Elektrokauterie für die Transplantationsforschung

Zusammenfassung

Wir entwickelten ein neuartiges Mausmodell der Spender-kardialen lymphatischen Ablation bei Herztransplantationen. Dieses Modell zeigt, dass die Störung der Spenderlymphatik die akute Abstoßung abschwächt, Myokardschäden reduziert und das Überleben des Transplantats verlängert, was neue Einblicke in die kardiale lymphatische Funktion in der Transplantationsimmunität liefert.

Zusammenfassung

Obwohl kardiale Lymphgefäße in den letzten Jahren zunehmend Aufmerksamkeit erlangt haben, bleibt die Beziehung zwischen dem Spender-Lymphsystem und der akuten Abstoßung bei Herztransplantationen noch zu klären.

Die kardiale elektrophysiologische Aktivität wurde mittels Elektrokardiographie (EKG) bei normalen Mäusen vor und nach der kardialen lymphatischen Ablation beurteilt. Die wichtigsten lymphatischen Gefäße der Spenderherzen wurden durch eine Evans-Blue-Injektion visualisiert und anschließend durch Elektrokauterisation abliert. Ein Herztransplantationsmodell mit einer kardialen lymphatischen Dysfunktion des Spenders wurde unter Verwendung von Herzen entwickelt, die einer lymphatischen Ablation unterzogen wurden. Die Funktion des Herztransplantats wurde mittels Echokardiographie, Western Blotting und ELISA bewertet. Die Wirkung der Spenderlymphablation auf die akute Abstoßung wurde mittels Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Überwachung der Überlebenszeit des Transplantats bewertet.

Die EKG-Ergebnisse zeigten keine signifikanten Veränderungen der kardialen Elektrophysiologie vor und nach der lymphatischen Ablation, was bestätigte, dass die großen Herzgefäße unversehrt blieben. Evans Blue wurde in den Herzapex injiziert, um die Lymphgefäße zu markieren. Große Lymphkaten wurden anschließend mittels Elektrokauterisation abliert. Nach Abschluss des Ablationsverfahrens wurden die Mäuse heparinisiert und ihre Herzen anschließend entnommen. Die Aorta und die Lungenarterie wurden durchschnitten, und die obere/untere Höhlenvene sowie die Lungenvenen wurden ligiert. Die vorbereiteten (ablierten) Spenderherzen wurden anschließend transplantiert. Die cTnI-Werte und die Ejektionsfraktion zeigten, dass die lymphatische Ablation die Herzverletzung nicht verschlimmerte. Die HE-Färbung zeigte, dass die Ablation der Spender-Herzlymphatiken die akute Abstoßung linderte, Myokardschäden verringerte und das Überleben des Transplantats verlängerte.

Wir haben erfolgreich ein Modell der Mausherztransplantation mit kardieller lymphatischer Dysfunktion des Spenders etabliert und gezeigt, dass die Ablation von Spender-Herzlymphatiken akute Abstoßungen mildern, Myokardschäden abschwächen und das Überleben des Transplantats verlängern kann. Diese Erkenntnisse liefern neue Erkenntnisse und eine Grundlage für das Verständnis der Rolle des kardialen lymphatischen Systems bei der Herztransplantation.

Einleitung

Die kardiale Allograft-Abstoßung bleibt eine der häufigsten und schwerwiegendsten Komplikationen nach einer Herztransplantation und wird hauptsächlich in akute zelluläre Abstoßung und antikörpervermittelte Abstoßung eingeteilt. Obwohl moderne immunsuppressive Therapien die Überlebensraten von Transplantaten deutlich verbessert haben, bleibt Abstoßung ein wesentlicher Faktor für Transplantationsergebnisse. Laut Literatur erleben etwa 12 % der Patienten mindestens eine Episode moderater oder schwerer akuter Abstoßung im ersten Jahr nach der^{Transplantation 1}.

Das kardiale lymphatische System hat zunehmend Aufmerksamkeit für seine potenzielle Rolle bei der Abstoßung von Transplantationen erhalten. Über seine gut etablierten Funktionen im Flüssigkeitsgleichgewicht und bei der Immunüberwachung hinaus spielt das Lymphsystem eine wichtige Rolle bei der Modulation von Immunantworten. Lymphgefäße dienen als primäre Kanäle für Immunzellen, um Gewebe zu betreten und zu verlassen ^2,3. Im Herzen stellt das lymphatische Netzwerk die grundlegende Infrastruktur für den Transport und die Rezirkulation von Immunzellen, einschließlich Lymphozyten, bereit. Über diesen Weg wandern Lymphozyten aus dem Blutkreislauf in den interstitiellen Raum, wo sie Immunüberwachung durchführen. Anschließend werden sie zu den Lymphknoten entwässert und kehren schließlich in den systemischen Kreislauf^{zurück 2,4}. Darüber hinaus zeigen Studien, dass T-Zellen und ihre Untergruppen eine zentrale Rolle bei akuten Abstoßungsreaktionen spielen und die Aktivierung und Migration dieser Zellen vom^{Lymphsystem beeinflusst} werden könnte.

Obwohl bekannt ist, dass Lymphgefäße im Herzen existieren und ähnliche Netzwerke wie Blutgefäße bilden, hat ihre Bedeutung im Laufe der Jahre keine vergleichbare Aufmerksamkeit erhalten. Studien haben gezeigt, dass das Fehlen funktioneller lymphatischer Gefäße zu ausgeprägter Herzhypertrophie und Ödem führt, was auf eine entscheidende Rolle der Lymphatik bei der Aufrechterhaltung der Herzgewebshomöostase⁶ hinweist. Darüber hinaus kann eine beeinträchtigte oder fehlende Lymphdrainage die Effizienz der entzündlichen Zellbeseitigung verringern, wodurch lokale Entzündungsreaktionen verschärft und der Prozess der kardialen Remodellierung beeinflusst^wird.

Bei Herzerkrankungen existieren verschiedene Interventionen, die sich auf lymphatische Gefäße konzentrieren. In Mausmodellen kann eine kardiale lymphatische Defizienz durch die Erzeugung von Vegfc+/- Mäusen⁸ induziert werden. Klinisch können interventionelle mediastinale lymphatische Embolisation⁹ und minimalinvasive Perikardfenster-Operation¹⁰ zur Behandlung des hylösen Perikardergusses eingesetzt werden. Bei Patienten mit Fontan-Kreislaufphysiologie kann die lymphatische Dekompression^{chirurgisch 11}, durch perkutane thorakale Gangdekompression¹² oder durch Etablierung lymphovenöser Anastomose¹³ erreicht werden. Zu den Okklusionstechniken gehören die Embolisation des Thoraxkanals¹⁴, die selektive Lymphatik-Embolisation¹⁵ und die Ligation des Thoraxkanals¹⁶. Direkte Interventionen, die sich auf die kardialen Lymphgefäße selbst konzentrieren, bleiben jedoch begrenzt.

Angesichts der entscheidenden Rolle der kardialen Lymphgefäße entwickelten wir ein neuartiges Modell der Mausherztransplantation, indem wir große lymphatische Gefäße in Spenderherzen mittels Elektrokauterie abließen. Dieses Modell wurde verwendet, um die Auswirkungen der lymphatischen Dysfunktion des Spendertransplantats auf die akute Abstoßung nach der Transplantation zu untersuchen.

Protokoll

Männliche C57BL/6J- und BALB/c-Mäuse (männlich, 6-8 Wochen alt, 25-28 g Körpergewicht) wurden unter spezifischen krankheitserregerfreien Bedingungen gehalten. Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den vom Tierethikausschuss des Fuwai-Krankenhauses genehmigten Protokollen durchgeführt (Genehmigungsnummer: 0108-7-800-ZX(X)-019).

Visualisierung und Ablation der kardialen lymphatischen Gefäße bei Mäusen
Um eine kardiale lymphatische Dysfunktion zu simulieren, wurden die wichtigsten kardialen Lymphgefäße mittels Elektrokauterie abliert.

Alle Mäuse wurden mittels intraperitonealer Injektion von 1,25 % Tribromoethanol in einer Dosierung von 0,2 ml pro 10 g Körpergewicht betäubt und während des gesamten Eingriffs mechanisch belüftet. Nach der Anästhesie mit Tribromoethanol unterzogen sich BALB/c-Mäuse einer endotrachealen Intubation mit einem 22-Gauge-Katheter und wurden an Elektrokardiogramm-(EKG)-Leitungen angeschlossen (Abbildung 1A, ergänzende Abbildung S1). In den Beatmungsparametern wurde das Atemverhältnis auf 1:1 oder 1:2 gesetzt, mit einem Gezeitenvolumen von 0,3 ml und einer Atemfrequenz von 100 Atemzügen/min. Nachdem der Katheter mit dem Beatmungsgerät verbunden war, wurde der Zustand der Maus genau überwacht; Die Intubation galt als erfolgreich, wenn die Atemfrequenz der Maus mit der des Beatmungsgeräts übereinstimmte, während inkonsistente Raten oder Bauchdehnung auf ein Versagen hindeuteten, das eine Wiedertubation erforderlich machte. Anschließend wurde eine Thorakotomie im linken Zwischenrippenraum 3-4 mit einer Schnittlänge von etwa 1 cm durchgeführt, und ein Retraktor wurde verwendet, um das gesamte Herz freizulegen (Abbildung 1B). Anschließend wurden 5 μL Evans Blue Farbstoff intramuskulär in den Herzapex injiziert, um die lymphatischen Gefäße sichtbar zu machen, mit einer Wartezeit von 1 Minute nach der Injektion, um eine vollständige Opakifikation zu ermöglichen (Abbildung 1C, E; Ergänzende Abbildung S2A-B), wobei darauf hingewiesen wird, dass Evans Blue sehr langsam injiziert werden sollte. Nach der Visualisierung wurde die Lage der großen kardialen Lymphgefäße durch Vergleich mit zuvor berichteten anatomischen Daten^17,18 bestätigt, und die Ablation erfolgte mit einem Elektrokauteriestift auf 10 W im kontinuierlichen Modus mit einer Koagulationszeit von etwa 3–7 Sekunden (Abbildung 1D,F). Die Elektrokardiographie (EKG) wurde vor und nach der Ablation überwacht, um das Fehlen einer Gefäßverletzung sicherzustellen (Abbildung 1G, H). Abschließend wurden die Mäuse nach einer größeren lymphatischen Ablation heparinisiert, um sich auf die anschließende Spenderherzentnahme vorzubereiten. Eine schematische Darstellung des chirurgischen Eingriffs ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abdominale heterotopische Herztransplantation
Die heterotopische Herztransplantation in der Bauchhöhle von Mäusen wurde wie zuvor beschrieben^{durchgeführt}. Ein kurzes Protokoll wird unten zusammengefasst:

Spenderverfahren
Bei BALB/c-Mäusen wurde entlang der Linea alba eine Laparotomie durchgeführt, und 1 ml 50 U/ml Heparin-Kochsalzlösung bei 4 °C wurde in die untere Vena cava injiziert, während die Bauchaorta durchtrennt wurde, um systemische Heparinisierung zu induzieren. Daraufhin wurde das Herz freigelegt, und 8:0 stand Nähte wurden verwendet, um die linke und rechte obere Vena cava zu ligadieren, die dann am distalen Ende der Nähte durchschnitten wurden (Abbildung 3A,B). Anschließend wurde die Aorta vom umgebenden Fettgewebe isoliert und in der Nähe des Aortenbogens aufgeschnitten (Abbildung 3C), und ein ähnliches Verfahren wurde durchgeführt, um die Lungenarterie zu isolieren und zu durchschneiden (Abbildung 3D). Die untere Vena cava im thorakalen Abschnitt wurde mit 8-0 ligiert Nähte und am distalen Ende durchschnitten (Abbildung 3E), danach wurden die Lungenvenen ligiert und mit 7-0 Seidenflechtnähten durchschnitten (Abbildung 3F). Schließlich wurde das entfernte Spenderherz in physiologischer Kochsalzlösung bei 4 °C für die anschließende Transplantation konserviert, wobei alle Herzen für die gleiche Dauer von etwa 30 Minuten konserviert wurden, um eine experimentelle Konsistenz zu gewährleisten.

Empfängerverfahren
Betäuben Sie die C57BL/6J-Empfängermäuse zur Vorbereitung auf die Bauchherztransplantation. Eine Laparotomie wurde entlang der Linea alba durchgeführt, um die Abdominaulaorta und die untere Vena cava der Empfängermaus freizulegen (Abbildung 4A). Nach dem Ligieren der dorsalen Zweiggefäße der unteren Vena cava mit 10-0 Nylonnähten wurden Gefäßklemmen verwendet, um den Blutfluss durch die Bauchaorta und die untere Vena cava zu blockieren (Abbildung 4B). Anschließend wurde ein Fenster in der Bauchaorta und der unteren Vena cava der empfangenden Maus geschaffen, und das Blut wurde mit Heparin-Kochsalzlösung aus den Gefäßen gespült. Mit 11-0-Nylonnähten wurde eine Ende-zu-Seiten-Anastomose durchgeführt, um die Lungenarterie des Spenderherzens mit der unteren Vena cava des Empfängers und die Aorta des Spenderherzens mit der abdominalen Aorta des Empfängers zu verbinden (Abbildung 4C-E). Abschließend wurden die Gefäßklemmen gelöst, um den Blutfluss zur empfangenden Maus wiederherzustellen (Abbildung 4F).

Versuchsdesign
Experimentelle Gruppe: Herzlymphgefäße bei BALB/c-Mäusen wurden mit Evans-Blue-Farbstoff visualisiert und mit einem Elektrokauteriestift abliert. Die Herzen von BALB/c-Mäusen mit ablierten Lymphgefäßen wurden in C57BL/6J-Mäuse transplantiert.

Kontrollgruppe: Herzlymphgefäße bei BALB/c-Mäusen wurden mit Evans Blue Farbstoff visualisiert, aber keine Ablation durchgeführt. Die Herzen von BALB/c-Mäusen wurden in C57BL/6J-Mäuse transplantiert.

In dieser Studie wurde die Stichprobengröße für alle experimentellen Gruppen und Zeitpunkte standardisiert: n=5 Mäuse pro Gruppe für Assays 24 Stunden nach der kardialen Transplantation, n=5 pro Gruppe für Assays 7 Tage nach der Transplantation und n=5 pro Gruppe für die Beobachtung der Überlebenszeit des kardialen Transplantats.

Die entnommenen Spenderherzen wurden vor der Herztransplantation 30 Minuten in 4 °C eiskalter Kochsalzlösung konserviert. Sowohl experimentelle als auch Kontrollgruppen-Spenderherzen wurden für eine identische Dauer in Kochsalzlösung aufbewahrt.

Die Schlagdauer von Herztransplantaten wurde in beiden Gruppen täglich durch Palpation bewertet (n=5 pro Gruppe).

Histologische Beurteilung und Parenchymalabstoßung (PR) Bewertung
Myokardgewebeproben wurden 48 Stunden lang in 10 % Formalin fixiert, gefolgt von Dehydrierung durch eine graduierte Ethanolserie (70 %, 80 %, 95 %, 100 %), Xylengreinigung, Paraffineinbettung und Mikrotomschnitt (4 μm), wobei die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt wurden. Die Abstoßung des Transplantats wurde mit dem PR-Score für Herztransplantationen bewertet, und das Ausmaß der Transplantatsverletzung wurde blind mit²⁰ bewertet.

Echokardiographische Untersuchung
Die Herzfunktion wurde mit dem Ultraschallsystem (40 MHz 550-Sondenwandler) bewertet. Die Mäuse wurden in Rückenposition auf einer 360-Grad-drehbaren Tierplattform platziert. Nach der Entfernung von Bauchhaaren wurde die Herzfunktion unter 1,0 % Isofluran-Anästhesie bewertet. Die Auswurffraktion (EF) des Herztransplantats wurde mittels M-Mode-Echokardiographie gemessen.

Erkennung von Myokardverletzungsmarkern
Das Ausmaß der Myokardingewebeschädigung wurde durch Messung der Expression kardiomyozytspezifischer Enzyme im Serum bewertet. Die kardialen Troponin-I (cTnI)-Werte wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.

Westliche Blotting
Um 24 Stunden nach der kardialen Transplantation wurde Myokardgewebe aus den Hauptlymphgefäßregionen der Herztransplantate sowohl in der Kontroll- als auch in der experimentellen Gruppe entnommen. Nach dem zuvor beschriebenen Protokoll²¹ wurde die Expression lymphatisch-gefäßassoziierter Marker analysiert. Das Herzgewebe wurde vollständig in einem RIPA-Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren (Phenylmethansulfonylfluorid) lysiert. Vor der Wärmedenaturierung wurde die Proteinkonzentration mit einem BCA-Kit bestimmt und auf eine gleichmäßige Konzentration eingestellt. Das gesamte Protein jeder Gruppe wurde über SDS-PAGE getrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran übertragen. Die PVDF-Membran wurde mit 5 % Magermilch (Raumtemperatur 1–2 Stunden) blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit den entsprechenden primären Antikörpern inkubiert. Am folgenden Tag wurde die Membran mit einem sekundären Antikörper (Antikaninchen, 1:1000) bei Zimmertemperatur für 30 Minuten behandelt. Die Membranstreifen wurden mit ECL-Lösung (1–2 ml) inkubiert und belichtet, um die Bilder aufzunehmen.

Die verwendeten Antikörper waren: LYVE1 Polyklonaler Antikörper (1:500), Podoplanin-Antikörper (1:500) und Anti-VEGF-Rezeptor 3 (1:50).

Statistische Analyse
Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben. Beim Vergleich zweier Gruppen wurden statistische Analysen mit dem Student's t-Test oder dem Wilcoxon-Rangsummentest durchgeführt, abhängig von der Datenverteilung und den Merkmalen. Die statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert.

Ergebnisse

Beurteilung der kardialen Transplantatfunktion
Mausmodelle der kardialen Transplantation wurden sowohl in Kontroll- als auch in experimentellen Gruppen gemäß dem beschriebenen Protokoll entwickelt. Der funktionelle Zustand der Transplantate wurde 24 Stunden nach der Transplantation bewertet. Der Expressionsstand von serumkardialem Troponin I (cTnI) war in der experimentellen Gruppe höher als in der Kontrollgruppe, aber der Unterschied war statistisch nicht signifikant...

Diskussion

Das kardiale Lymphsystem stellt eine wichtige Komponente zur Aufrechterhaltung der Gewebeflüssigkeitshomöostase und zur Unterstützung der Immunfunktion im Herzen dar. Durch die Erleichterung der Resorption von interstitieller Flüssigkeit, dem Lipidtransport und dem Austausch von Immunzellen gewährleistet es die Herzleistung sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen. In den letzten Jahren hat zunehmende Evidenz die entscheidende Beteiligung des kardialen Lymph...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Elektrokoagulationsstift	Weitai	V70
Mikroskopisch kleine Pinzetten	Jinzhong	WA3030
Mikroskopisch kleine Pinzetten	Jinzhong	WA2040
Mikroskopischer Nadelhalter	Jinzhong	YZE010
Mikroskopischer Nadelhalter	Jinzhong	YZE020
Mikroskopische Schere	Jinzhong	YBC010
Mikroskopische Schere	Jinzhong	YBC020
Nadelhalter	Jinzhong	J32010
Schere	Jinzhong	Y00010
Beatmungsgerät für kleine Tiere	Zhuodi	DW-300