Kryosektionierung synthetischer biokompatibler Implantate mit UV-aushärtendem Harz zur verbesserten Immunfluoreszenzanalyse

Summary

Diese Arbeit präsentiert ein Kryosektionsprotokoll, das UV-härtbare Harzstabilisierung verwendet, um die Integrität der Implantat-Gewebe-Schnittstelle zu erhalten und gleichzeitig die Antigenzugänglichkeit zu erhalten, was eine zuverlässige, hochauflösende Immunfluoreszenzanalyse synthetischer Polymerimplantate ermöglicht.

Abstract

Die histologische Bewertung synthetischer, biokompatibler Implantate stellt aufgrund der Inkompatibilität zwischen herkömmlichen Gewebeverarbeitungsmethoden und den physikochemischen Eigenschaften dieser Materialien erhebliche technische Herausforderungen dar. Aktuelle Ansätze mit vollständiger Harz-Einbettung bieten eine angemessene strukturelle Erhaltung, beeinträchtigen jedoch die Epitope-Zugänglichkeit erheblich, wodurch immunhistochemische Anwendungen eingeschränkt werden, die für die Charakterisierung der Immunantworten des Wirts unerlässlich sind. Umgekehrt zeigt die konventionelle Paraffin-Einbettung eine schlechte Haftung an synthetischen Substraten und begrenzt die Antikörperauswahl für eine umfassende immunologische Profilierung. Standard-Kryosektionierungsprotokolle verbessern die immunhistochemische Kompatibilität durch Verbesserung der Antigenkonservierung; Diese Methoden führen jedoch häufig zu unzureichender struktureller Integrität von implantathaltigen Proben, was die morphologische Bewertung und Schnittqualität beeinträchtigt. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde ein neuartiges Verarbeitungsprotokoll entwickelt, das ein UV-aushärtbares Harz zur selektiven Stabilisierung von Implantatgewebe-Konstrukten vor der Kryosektion integriert. Diese Methodik verwendet ein photopolymerisierbares Harz, um mechanische Unterstützung zu bieten, während gleichzeitig die Epitope-Zugänglichkeit und antigene Determinanten erhalten bleiben, die typischerweise durch vollständige Harzpolymerisation beeinträchtigt werden. Das Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare Erzeugung hochwertiger Schnitte mit optimaler Dicke für die Immunfluoreszenzbewertung, wodurch eine überlegene strukturelle Erhaltung im Vergleich zur Standard-Tiefschnittschnitte erreicht wird, ohne die umfangreiche Querverbindung, die die Antikörperpenetration in konventionellen, harzeingebetteten Proben begrenzt. Dieser Ansatz stellt eine praktische und kosteneffiziente Lösung für die histologische Verarbeitung synthetischer Implantate dar, bietet verbesserte analytische Fähigkeiten zur Biokompatibilitätsbewertung und erleichtert eine detaillierte Charakterisierung lokaler Immunantworten an Implantat-Gewebe-Schnittstellen.

Introduction

Die Immunfluoreszenzmikroskopie ist eine wesentliche analytische Technik in der Forschung zur regenerativen Medizin, die die Visualisierung der Gewebearchitektur und zellulären Zusammensetzung mittels fluorophorkonjugierter Antikörper erleichtert. Diese Methodik verbindet die molekulare Spezifität der immunchemischen Erkennung mit der Sensitivität und Vielseitigkeit der Fluoreszenzdetektion und ermöglicht so eine detaillierte Beobachtung zellulärer Zielverteilungen innerhalb ihrer Gewebemikroumgebungen. Immunofluoreszenz-Ansätze umfassen sowohl direkte als auch indirekte Markierungsstrategien, wobei indirekte Immunfluoreszenzprotokolle eine verbesserte Signalverstärkung durch sekundäre Antikörpersysteme ermöglichen, die an verschiedene Fluorophore im sichtbaren und nahen infraroten^{Spektrum 1} konjugiert sind. Die inhärente Fähigkeit der Methodik zur gleichzeitigen Multi-Ziel-Erkennung durch spektrale Trennung ermöglicht eine umfassende phänotypische Charakterisierung heterogener zellulärer Populationen und ihrer räumlichen Beziehungen innerhalb komplexer Gewebemikroumgebungen².

Die technischen Fähigkeiten der Immunfluoreszenzmikroskopie gehen über die konventionelle Proteinlokalisierung hinaus und umfassen quantitative analytische Anwendungen, einschließlich Messungen der Fluoreszenzintensität, Kolokalisationsanalysen und räumlicher Verteilungsbewertungen, die für das Verständnis der zellulären Funktion und Gewebeorganisation entscheidend sind³. Im Kontext der Implantat-Biokompatibilitätsforschung liefert die Immunfluoreszenzanalyse entscheidende Einblicke in die Immunantworten des Wirts, einschließlich Fremdkörperreaktionen, entzündlichen Kaskaden und Gewebeintegrationsprozessen, die auf zellulärer und molekularer Ebene die Akzeptanz oder Abstoßung von Implantaten bestimmen⁴.

Die erfolgreiche Umsetzung von Immunfluoreszenzprotokollen erfordert sorgfältige Überlegung von Gewebeverarbeitungsmethoden, die die morphologische Integrität bewahren, während das fluoreszente Signal erhalten bleibt und die Hintergrundautofluoreszenz minimiert wird. Die Auswahl traditioneller Einbettungsmedien hängt vom Gewebetyp, den nachgelagerten analytischen Anforderungen und den spezifischen Antigenen von Interesse ab. Für synthetische Materialien und Implantate empfiehlt die aktuelle Literatur in erster Linie eine vollständige Harzeinbettung, um die strukturelle Stabilität während der Schnittverfahren^{zu erhalten 5}. Dieser Ansatz stellt jedoch erhebliche Einschränkungen dar, da spezialisierte Ultramikrotome und Klingen zur Sektionierung von polymerisierten Harzblöcken benötigt werden, was erhebliche Ausrüstungsinvestitionen und technische Expertise darstellt. Paraffin-Einbettung bietet zwar eine ausreichende strukturelle Unterstützung für das Schneiden, bringt aber während der Fixierung und Verarbeitung konformationelle Veränderungen an antigenen Determinanten durch umfangreiche Dehydrierung, chemische Härtung und Infiltration mit organischen Lösungsmitteln mit sich, die Proteine denaturieren und Epitope abdecken können. Die Paraffinverarbeitung erzeugt außerdem intrinsische Autofluoreszenzstörung, die die Signalerkennung und quantitative Analyse beeinträchtigt. Diese Veränderungen erfordern Antigenentnahmeverfahren, die typischerweise hitzinduzierte Epitopenabnahme (HIER) oder proteolytisch induzierte Epitopenabnahme (PIER) umfassen, um die Antikörperzugänglichkeit^{wiederherzustellen}. Trotz dieser Maßnahmen bleiben zahlreiche kommerziell erhältliche Antikörper mit paraffinhaltigen Proben unvereinbar, und die harten Entnahmebedingungen können die Fluoresziersignalqualität weiter beeinträchtigen und Photobleichartefakte einführen.

Die Kryosektion bietet eine alternative Verarbeitungsmethode für Immunfluoreszenzanwendungen. Für die Gewebepräparation können zwei Kryokonservierungsmethoden verwendet werden. Der erste Ansatz beinhaltet eine schnelle Kryokonservierung durch direktes Eintauchen von frischen Gewebeproben in ein mit flüssigem Stickstoff vorgekühltes Isopentanbad, um Temperaturen unter –20 °C zu erreichen, gefolgt von Schnitten mit Kryostat-Mikrotomen, die mit temperaturkontrollierten Schneidkammern ausgestattet sind. Das zweite Protokoll verwendet eine kurze Fixierungszeit in Paraformaldehyd (PFA) oder Formalin, gefolgt von Kryoprotektion durch graduierte Saccharoseinfiltration vor dem Einfrieren. Der Kryokonservierungsprozess schafft eine starre Matrix, die die Gewebeintegrität erhält und gleichzeitig die nativen Proteinkonformationen bewahrt, die für die Antikörpererkennung unerlässlich sind. Die gefrorene Sektion hält das Gewebe mit minimalen chemischen Veränderungen in einem nahezu natürlichen Zustand^{, wodurch} der Bedarf an harten Antigenentnahmeverfahren reduziert und die Verwendung einer breiteren Palette primärer Antikörper ermöglicht wird, einschließlich solcher, die aufgrund von Epitopenmaskierung oder^{Denaturierung mit} paraffineingebetteten Geweben nicht kompatibel sind.

Der Kryosektionierungsprozess verwendet typischerweise eine optimale Schneidetemperatur (OCT)-Verbindung, ein wasserlösliches Einbettungsmedium aus Polyvinylalkohol und Polyethylenglykol, das während des Schnitts strukturelle Unterstützung bietet und dabei transparent und kompatibel mit Fluoreszenzdetektionssystemen bleibt. Die OCT-Einbettung erleichtert die Erzeugung dünner, gleichmäßiger Schnitte mit einer Dicke von 5–15 μm, abhängig von den spezifischen analytischen Anforderungen und Gewebeeigenschaften⁹. Die Erhaltung nativer Proteinkonformationen in eingefrorenen Schnitten erhält optimale Signal-Rausch-Verhältnisse, die für die quantitative Immunfluoreszenzanalyse unerlässlich sind, während gleichzeitig intakte Epitope erhalten bleiben, die die Nutzung einer breiteren Palette primärer Antikörper ermöglichen, einschließlich solcher, die mit paraffin eingebetteten Geweben nicht kompatibel sind⁸.

Das Einschneiden von gefrorenem Gewebe stellt jedoch besondere technische Herausforderungen dar, insbesondere bei der Verarbeitung synthetischer Implantatmaterialien, die im Vergleich zu natürlichen biologischen Geweben unterschiedliche physikochemische Eigenschaften besitzen. Die differenzielle thermische Ausdehnung zwischen synthetischen Polymeren und biologischen Gewebeoberflächen während des Einfrierens kann zu lokalisierter mechanischer Belastung führen, die die strukturelle Integrität beeinträchtigt und Schnittartefakte erzeugt¹⁰. Darüber hinaus kann die inhärente Steifigkeit vieler synthetischer Materialien im Vergleich zu gefrorenen biologischen Geweben während des Schnitts zu Durchbiegungen der Klinge führen, was zu ungleichmäßiger Schnittdicke und Schäden an der Probe und Schneidgeräten führt. Diese technischen Einschränkungen erfordern spezialisierte Verarbeitungsprotokolle, die die besonderen Anforderungen von implantathaltigen Proben erfüllen und gleichzeitig die Vorteile der Tiefkühlschnitte für Immunfluoreszenzanwendungen erhalten.

Um diese Einschränkungen zu beheben, entwickelte diese Studie ein Kryosektionierungsprotokoll, das selektive, UV-aushärtbare Harzstabilisierung mit kontrollierten Kryostatschnittparametern kombiniert, um eine hochauflösende, multiparametrische Immunfluoreszenzanalyse von Implantatgewebekonstrukten zu ermöglichen.

Protocol

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) unter der Genehmigungsnummer A00003765 18.24 durchgeführt. Alle Verfahren mit synthetischen biokompatiblen Implantaten wurden unter sterilen Bedingungen gemäß den entsprechenden Biosicherheitsprotokollen durchgeführt.

1. Probenverarbeitung und Kryoschutz

HINWEIS: Formalin ausschließlich in einer chemischen Dampfhaube handhaben und geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, da Formalin Formaldehyd enthält, einen starken Reizstoff, Sensibilisator und Karzinogen.

1. Fixieren Sie gewebeintegrierte, biokompatible synthetische Implantatproben in 10 % neutralem Formalin über Nacht bei 4° C mit mindestens 10 Volumina Fixativ relativ zum Gewebevolumen, um eine vollständige Eintauchung und ausreichende Penetration sicherzustellen. Ziel dieser begrenzten Fixierungszeit ist es, minimale Vernetzung zu erreichen und gleichzeitig die Gewebemorphologie zu erhalten. ( Siehe Materialtabelle für im Protokoll verwendete Materialien.)
2. Proben in eine 15%ige Saccharoselösung, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt wird, für die Übernachtung bei 4° C mit sanftem Rühren. Sicherstellen Sie eine vollständige Saccharose-Infiltration, wie durch das Absinken des Gewebes nachgewiesen wird.
3. Proben in eine 30%ige Saccharoselösung in PBS für eine zweite Übernachtung bei 4° C überführen. Vollständiges Gleichgewicht durch Gewebeabsinken auf den Behälterboden bestätigen, was eine ausreichende Saccharose-Filtration und Wasserverdrängung anzeigt.
4. Bereite ein 1:1-Volumenverhältnis aus 30 % Saccharoselösung und OCT-Verbindung vor. Inkubieren Sie Exemplare in diesem Übergangsmedium für 2 Stunden bei 4° C und übertragen Sie dann für 1 Stunde auf 100 % OCT, um ein vollständiges Gleichgewicht zu erreichen, was sich an einem gleichmäßig undurchsichtigen Gewebe zeigt.
5. Positionieren Sie die Proben sorgfältig in Standard-Kryomolds, die mit frischem OCT-Stoff gefüllt sind, um eine optimale Ausrichtung für die Schnittebenen zu gewährleisten. Orientieren Sie sich an der Implantat-Gewebe-Schnittstelle für weitere Eingriffe. Beseitigen Sie Luftblasen mit vorgekühlter Pinzette.
6. Platziere gefüllte Kryomolds sofort auf der Trockeneisplattform, um einen Temperaturgradienten zu erzeugen, der die schnelle Eiskristallbildung von unten nach oben fördert. Überwachen Sie 10–15 Minuten bis zur vollständigen Erstarrung, bestätigt durch das charakteristische undurchsichtige weiße Erscheinungsbild der gefrorenen OCT-Verbindung. Umstellen Sie gefrorene Blöcke auf eine Lagerung von –80° C oder direkt in die Kryostatkammer zur sofortigen Sektionierung.

2. Kryostat-Aufbau und erste Sektionierung

1. Halten Sie die temperaturkontrollierte Kammer des Kryostats bei –15° C. Überprüfen Sie die Temperatur mittels integrierter digitaler Überwachung und gleichen Sie sich über Nacht vor der Probeeinführung ein.
2. Setze neue Einwegklingen ein. Stellen Sie den Klingenwinkel für das kombinierte Segmentieren synthetisch-biologischer Materialien gemäß den Herstellerspezifikationen ein.
3. Die gewünschte Schnittdicke (50–100 μm) wird in den Kryostat programmiert, indem die Dicken-Einstellung auf dem Bedienfeld gewählt, mit den Pfeiltasten angepasst und der Parameter durch Drücken der Set-Taste bestätigt wird.
4. Gehen Sie durch die eingebettete Probe vor, um die vorgegebene Tiefe zu erreichen, die der Schnittstelle zwischen Implantat und Gewebe entspricht. Überwachen Sie die vorrückende Schnittfläche, um die optimale Ebene für die Anwendung von UV-Harz zu identifizieren, gekennzeichnet durch subtile Veränderungen der Gewebeopazität und der initialen Implantat-Peripherie-Exposition, und die Tiefe wird bestätigt, wenn diese Merkmale über aufeinanderfolgende geschnittene Schnitte hinweg konstant sichtbar bleiben.
   HINWEIS: Stoppen Sie die Sektionierung sofort nach Erreichen der kritischen Schnittstelle, um ein Vormarsch über das Zielgebiet hinaus zu verhindern.

3. UV-härtbare Harzanwendung

HINWEIS: Behandeln Sie UV-aushärtendes Harz in einem gut belüfteten Bereich, während Sie geeignete PSA tragen, und schützen Sie Augen und Haut vor LED-UV-aushärtendem Licht. Diese Harze enthalten Reizstoffe, die Haut- und Augenreaktionen verursachen können, und LED-UV-Exposition kann zu UV-induzierten Augenschäden führen.

1. Schneiden Sie den Parafilm mit einer Schere auf 2–3 mm Abmessungen, die den Implantatumfang überschreiten. Trennen Sie vorsichtig von der schützenden Papierrückseite mit steriler Pinzette.
2. Dosieren Sie 5–10 μL UV-härtbares Harz auf die belichtete Parafilmoberfläche (Abbildung 1A). Das Harzvolumen wird durch vorläufige Testanwendungen optimiert, bei denen inkrementelle Volumina verteilt werden, und die resultierende Verteilung wird visuell bewertet, um eine gleichmäßige Abdeckung der Probeoberfläche ohne Überlauf oder übermäßige Harzansammlung zu gewährleisten, die das Schneiden beeinträchtigen würden.
3. Ersetzen Sie die Schutzpapierrückseite sofort über harzgeladenen Parafilm. Tragen Sie eine Polyurethan-Nahtwalze (2 Zoll) mit gleichmäßigem Druck in überlappenden, parallelen Durchgängen auf, gefolgt von senkrechten Durchgängen, um eine dünne, gleichmäßige Harzschicht zu erzielen (Abbildung 1B).
4. Entfernen Sie die Schutzpapierschicht vorsichtig und zeigen Sie eine gleichmäßig verteilte Harzfolie. Positionieren Sie Harz-Parafilm direkt über der freiliegenden Implantatoberfläche, um eine präzise Ausrichtung mit der Schnittfläche zwischen Implantat und Gewebe sicherzustellen (Abbildung 1C).
5. Tragen Sie eine Polyurethan-Nahtwalze vom Implantatzentrum nach außen auf, um Luftblasen zu beseitigen und einen engen Kontakt zwischen Harz und sowohl synthetischen als auch biologischen Oberflächen sicherzustellen (Abbildung 1D).
6. Positioniere eine UV-LED-Lichtquelle mit 405 nm Wellenlänge in 2–3 cm Abstand direkt an der Implantatoberfläche. 90 Sekunden lang belichten, um eine vollständige Polymerisation sicherzustellen, verifiziert durch taktile Bewertung der Harzhärte und der nicht klebrigen Eigenschaften (Abbildung 1E). Setzen Sie vor der UV-Photopolymerisation eine UV-Schutzabdeckung über das Fenster der Kryostatkammer, um den Bediener während des Harzhärtenverfahrens vor schädlicher UV-Exposition zu schützen.

4. Schnittbergung und Vorbereitung von Objektträgern

1. Entfernen Sie den Parafilm mit einer einzigen kontinuierlichen Bewegung, um eine mechanische Störung der Harz-Gewebe-Schnittstelle zu verhindern. Die vollständige Harzhaftung wird durch Inspektion der freiliegenden Oberfläche unter Kryostatbeleuchtung auf gleichmäßige Harzabdeckung, fehlendes Anheben am Geweberand und fehlendes sichtbares Parafilmrückstand bestätigt.
2. Proben auf eine vorgegebene Dicke von 8 μm mit einem kalibrierten Mikrotom-Advance-Mechanismus schneiden. Überwachen Sie jeden Abschnitt auf eine gleichbleibende Dicke und das Fehlen von Artefakten (Kompression, Reißen, unvollständige Schnittteilung). Positioniere die Antirollplatte optimal, um ein Einrollen zu verhindern (Abbildung 1F).
   HINWEIS: Hydrophile, positiv geladene Klebeglasträger werden verwendet, da sie eine bessere Bindung anspruchsvoller Proben gewährleisten und die Haftung beim Schnitttransfer und der anschließenden Verarbeitung verbessern. Etikettieren Sie die Dias einzeln vor der Sektionsübergabe.
3. Positioniere die Klebefläche der Schiebe, wobei der erste Kontakt am Schnittrand gewährleistet ist, bevor der progressive Kontakt über die gesamte Fläche hinweg stattfindet. Stellen Sie sicher, dass die UV-gehärtete Harzoberfläche am Objektträger haftet, während die Gewebeoberfläche für die Immunfluoreszenz nach oben gehalten wird (Abbildung 1G).
4. Drücken Sie die Querschnittsschieber-Baugruppe sanft, um Luftblasen zu vermeiden. Überprüfen Sie die korrekte Ausrichtung unter Kryostatbeleuchtung und bestätigen Sie die intakte Schnittstelle zwischen Implantat und Gewebe.

5. Lagerung und Erhaltung

1. Platzieren Sie fertige Objektträger in vorbeschrifteten Aufbewahrungsboxen bei –20° C für Anwendungen, die innerhalb von 72 Stunden bearbeitet werden müssen.
2. Nutzen Sie – 80° C Bedingungen für Erhaltungszeiten von mehr als einer Woche.

6. Immunfluoreszenzfärbungsprotokoll

HINWEIS: Behandeln Sie Pepsin mit geeigneter PSA, da es ein Haut- und Atemreizstoff ist.

1. Entnahme der Objektträger aus dem Lager und Übergabe in Feuchtigkeitskammern für 15–20 Minuten zur Gleichstellung der Raumtemperatur.
2. Führen Sie drei aufeinanderfolgende 2-minütige PBS-Waschzyklen durch.
3. Antigengewinnung:
   1. Hitzeinduzierte Epitope-Rückgewinnungsmethode (HIER): Positionierung der Folien horizontal in mikrowellensicheren Behältern mit 1x Ziel-Rückhollösung. Mikrowelle (1000-Watt-Ausgangsleistung) mit hoher Leistung für 15 Minuten, gefolgt vom Abkühlen auf Raumtemperatur.
   2. Proteolytisch-induzierte Epitope-Rückgewinnungsmethode (PIER): Verwenden Sie pro Abschnitt 100–150 μL Pepsinlösung mit Fertigkeit. Decken Sie sie mit temporären Kunststoff-Deckschichten ab und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37° C in einer befeuchteten Kammer.
4. Führen Sie drei aufeinanderfolgende PBS-Waschzyklen durch (jeweils 2 Minuten).
5. Trage 1 ml Blockierlösung mit 0,1 % Saponin und 2,5 % normalem Ziegenserum in PBS auf. Inkubiere 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
6. Führen Sie drei aufeinanderfolgende PBS-Waschzyklen durch (jeweils 2 Minuten).
7. Verwenden Sie 100 μL primäre Antikörperlösungen bei optimierten Konzentrationen:
   1. Anti-Kollagen IV Kaninchenpolyklonal bei 1:100 Verdünnung.
   2. Anti-Laminin-Kaninchen polyklonal bei 1:500 Verdünnung.
   3. Anti-F4/80 Rabbit monoklonaler Antikörper bei Verdünnung von 1:500.
8. Decken Sie sie mit temporären Kunststoffabdecken ab und bebrüten Sie sie über Nacht bei 4°C in befeuchteten Kammern.
9. Führe drei PBS-Waschzyklen durch (jeweils 2 Minuten).
10. Sekundäre Antikörper mit einer Konzentration von 10 μg/mL auftragen.
    1. Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG Alexa Fluor 488
11. Inkubieren Sie 60 Minuten bei Zimmertemperatur unter dunklen Bedingungen.
12. Optionale Weizenkeim-Agglutinin-(WGA)-Färbung:
    1. Trage WGA-Alexa Fluor 647 bei 5 μg/mL in PBS mit 2,5 % normalem Ziegenserum auf.
    2. Decken Sie ab und bebrüten Sie sie 30 Minuten bei 37° C. Führe drei aufeinanderfolgende 2-minütige PBS-Waschzyklen durch.
13. Tragen Sie pro Abschnitt 80 μL Hardfixiermaterial mit nuklearer Gegenverfärbung auf.
14. Decken Sie den Deckzettel mit dem Deckglas ab, um Luftblasen zu vermeiden.
15. Lass die Objektträger bei Raumtemperatur 2 Stunden lang horizontal aushärten.
16. Lagern Sie bis zu einer Woche bei 4°C für optimale Bildqualität.

7. Fluoreszenzmikroskopie und Bildaufnahme

1. Führen Sie Bildgebung mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit Herstellerfiltersätzen durch: 360/460 nm Anregung/Emission, 470/525 nm Anregung/Emission, 545/605 nm Anregung/Emission, 620/700 nm Anregung/Emission.
2. Bilder werden aufgenommen, indem jeder Fluoreszenzkanal im Filtermenü der Mikroskopsoftware ausgewählt wird. Vor der Belichtungsoptimierung wird ein Schwarzbilanzverfahren durchgeführt, indem Schwarzabgleich angepasst wird, um eine genaue Basiskorrektur für jeden Kanal sicherzustellen. Die Belichtungsparameter werden dann optimiert, indem das Bildaufnahmefenster geöffnet, der Live-Modus aktiviert und die Belichtungs- und Lichtintensitätsregler angepasst werden, bis ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis ohne Pixelsättigung erreicht wird. Die Sättigung wird mit der Histogrammanzeige der Software und dem Tool Highlight Saturated Pixels überwacht. Jeder Kanal wird vor der Bildaufnahme unabhängig angepasst.
3. Führen Sie automatisierte Kachelerfassung mit einer 10%igen Überlappung des Herstellers zwischen benachbarten Feldern durch. Automatische Fokusanpassung während der gesamten Aufnahmesequenz aufrechterhalten.

Results

Qualitätsbewertung und Optimierung der Abschnitte
Nach der UV-Harz-Stabilisierung und dem Schneiden bei 8 μm Dicke sammeln Sie Schnitte auf Klebekörperungen und bewerten sie zur Qualitätskontrolle. Hochwertige Schnitte zeigen eine intakte Morphologie ohne nennenswerte Risse oder Bruchartefakte, mit kontinuierlicher Gewebearchitektur und einer erhaltenen Implantat-Gewebe-Schnittstelle (Abbildung 2A). Schnitte mit erheblichen strukturellen ...

Discussion

Diese UV-härtbare Harzstabilisierungsmethode bietet einen alternativen Ansatz zur Kryosektion von OCT-eingebetteten Gewebeproben, die synthetische Materialien enthalten, die sonst mit Standard-Tiefkühlschnittstechniken schwer zu verarbeiten sind. Obwohl es verschiedene Klebstoffoptionen gibt, wie geladene Objektträger, Gewebeklebebänder und andere Haftunterlagen, um Gewebeschnitte oder empfindliche Proben beim Handling zu verhindern, bieten diese Produkte eine Verkleidungshaftung und lie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5W Gooseneck Ultraviolett Licht 395 & Dash; 405 nm für Harzhärtung	Amazon	UPC ‎ 603335835561
Antikörper – Anti-F4/80 (monoklonal)	Abcam	ab300421	1:500
Antikörper – Kollagen IV (polyklonal)	Abcam	ab6586	1:100
Antikörper – Donkey Anti-Rabbit IgG AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10 μg/mL
Antikörper – Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG AlexaFluor 488	Invitrogen	A-11008	10 μg/mL
Antikörper – Laminin (polyklonal)	Invitrogen	PA1-16730	1:500
BioMed Clear	Formlabs	FLBMCL01	Biokompatibles Material #1
BioMed Durable	Formlabs	FLBMDU01	Biokompatibles Material #2
Gepuffertes 10 % Formalin	Kardinalgesundheit	C4320-101
BZ-X Filter Cy5	Schlüssel	OP-87766	Filtersatz
BZ-X Filter DAPI	Schlüssel	OP-87762	Filtersatz
BZ-X Filter GFP	Schlüssel	OP-87763	Filtersatz
BZ-X Filter TRITC	Schlüssel	OP-87764	Filtersatz
BZ-X800 Analyzer-Software	Schlüssel	BZ-X800	Integrierte Software
Fisherbrand Premium Coverglass  50 x 24 mm	Fisher Scientific	12-544-14
Form4B 3D-Drucker	FormLabs	F4B-Drucker
Form4 Harztank	Formlabs	RT-F4-01
Ziegenserum	Gibco	16210064
HM525 NX Kryostat	Epredia	956641EC
Haushaltsmikrowelle	Panasonic	NN-S766BA	1000 Watt Leistung
IHC-Tek Kunststoff-Überdeckfolien 24 mm x 60 mm	IHC World	IW-2601	Temporärer Deckungsrutsch
JDiction UV-Harz mit niedriger Viskosität	Amazon	6974143904430	Hohe Autofluoreszenz
Keyence BZ-X800	Schlüssel	BZ-X800
Lass uns Resin UV Resin Clear Hard Type verwenden	Amazon	ALR00038	Hohe Autofluoreszenz
Lass uns Resin Clear UV-Harz mit hoher Viskosität machen	Amazon	ALR00048
Matsunami MAS Micro Slide Glasobjektträger	Neuankömmling-Versorgung	SUMAS1190	Klebeverschluss
Medpor Chirurgisches Implantat	Stryker	8662	Biokompatibles Material #3
Mr. Resin UV Resin Kristallklar	Amazon	B08FRF9QTB	Hohe Autofluoreszenz
MX35 Ultra Microtome Klinge	Epredia	3053835
Parafilm M Laborfilm	Parafilm	P7543-1EA
Pepsin	Sigma	R2283-15ML
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4	Sigma	P3813
Plan Apo & Lambda; 40X	Schlüssel	BZ-PA40	Objektivlinse
Plan Apo & Lambda; 4X	Schlüssel	BZ-PA04	Objektivlinse
Polyurethan-Nahtwalze	Amazon	682698799567
ProLong Glass Antifade Mountant mit NucBlue Stain	Invitrogen	P36985	Hoechst 33342 Gegenfarbe
Saponin	Millipore	558255-100GM
StainTray	Simport	M920-2
Sterile Silikonbeschichtung	Bentec	PR72034-51N
Ziel-Retrieval-Lösung, Citrat pH6	Agilent	S236984-2
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583
Weizenkeim Agglutinin AlexaFluor 647	Invitrogen	W32466	5 μG/mL