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Methodenartikel

Phosphorus-31-Magnetresonanzspektroskopie für serielle Messungen kardialer Energetik während temperaturkontrollierter Herzkonservierung

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DOI:

10.3791/70070

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17. März 2026

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1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Division of MR Research, Russell H. Morgan Department of Radiology and Radiological Science, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University, 4Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pediatric Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel haben wir ein reproduzierbares, temperaturkontrolliertes Protokoll für die ex vivo Phosphorus-31-Magnetresonanzspektroskopie beschrieben, das eine serielle, quantitative Beurteilung der myokardialen Energetik während der Organerhaltung ermöglicht.

Zusammenfassung

Eine zuverlässige Organerhaltung ist entscheidend, um die Verfügbarkeit von Spendern zu erhöhen und die Transplantationsergebnisse zu verbessern. Während statische Speicherung weiterhin der Standard für Spenderherzen ist, besteht ein Bedarf an präzisen Methoden zur Überwachung der Myokardienergetik während der gesamten Konservierung.

Die Phosphorus-31-Magnetresonanzspektroskopie (31P MRS) ermöglicht eine direkte, dynamische Messung wichtiger Energiemetaboliten, darunter Phosphokreatin (PCr), Adenosin-Triphosphat (ATP), anorganisches Phosphat (Pi) und intrazellulären pH-Wert. Diese Technik ermöglicht eine longitudinale, quantitative und präzise Bewertung des myokardialen Stoffwechselstatus während der ex vivo Speicherung. Vorteile von MRS umfassen eine dynamische Bewertung des Energiestatus und eine globale Bewertung der ventrikulären Energie.

Das Protokoll beginnt mit der Erholung des Schweinespenders, der Verabreichung von Kardiopleigie und der Herzsektomie. Der Aortenbogen wird proximal zum brachiozephalen Stamm durchschnitten, um die Länge der aufsteigenden Aorta zu maximieren. Eine gerippte Kanüle wird in der distalen aufsteigenden Aorta befestigt, das linke Vorhof markiert, und das Herz wird in einen zylindrischen, isolierten Behälter gelegt, der mit temperaturspezifischer Kardioplegie vorgefüllt ist. Der Deckel ist mit der Kanüle verbunden, schwebt das Herz darin, und der Behälter wird versiegelt, sodass eine Temperatur innerhalb von 1 °C für 1 Stunde gehalten wird.

Der Behälter wird in eine maßgeschneiderte Styroporbox mit einer Öffnung für eine phosphorabgestimmte Spule platziert, wodurch das Zentrum der Spirale mit dem Zentrum des linken Ventrikels (LV) ausgerichtet ist. Scout-Bilder bestätigen die Position des LV in der Nähe der 31-P-Spule. B-0-Shimming sorgt für eine gleichmäßige Anregung, gefolgt von der Erfassung eines nicht lokalisierten 31-P-MR-Spektrums. Die Nachbearbeitung identifiziert spektrale Spitzen zur Berechnung von PCr/ATP, PCr/Pi-Verhältnissen und intrazellulärem pH-Wert.

In unserem Protokoll wird 31P MRS zu seriellen Zeitpunkten zwischen H0 und 8 durchgeführt. Zwischen den Zeitpunkten wird das Herz in einem Standardspeichergerät bei der gewünschten Temperatur gespeichert.

31P MRS hat es uns ermöglicht, zeitabhängige Veränderungen der Energieentlastung und die Rolle der Speichertemperatur bei der Abschwächung von Energieverlust im Laufe der Zeit zu untersuchen.

Einleitung

Die Herztransplantation bleibt die maßgebliche Behandlung für ausgewählte Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium1. Ein anhaltender Mangel an geeigneten Spenderorganen und die Einschränkungen der aktuellen Erhaltungsstrategien sind jedoch große Hindernisse für optimale Ergebnisse und eine erweiterte Verfügbarkeit von Transplantationen 2,3. Traditionell werden Spenderherzen durch kalte, statische Lagerung konserviert, was unkompliziert und kosteneffizient ist, aber anfällig für subklinische energetische Erschöpfung bei längerem Transport 2,4 ist. Da Programme zunehmend risikoreichere und geografisch weit entfernte Organe akzeptieren, wächst der Bedarf an objektiven Werkzeugen, die den Stoffwechselzustand des Myokards während der Konservierung charakterisieren, anstatt sich ausschließlich auf ischämische Zeit und Makroinspektionzu verlassen 5,6,7. Darüber hinaus werden Myokardstoffwechsel und ischämische Toleranz stark von der Temperatur beeinflusst, und sowohl unzureichende Kühlung als auch übermäßige Unterkühlung können die energetische Erschöpfung und Zellverletzungen während der Speicherung verschlimmern. Die Bewertung von Spenderherzen bei mehreren, klinisch relevanten Erhaltungstemperaturen hilft daher, Bedingungen zu identifizieren, die die Myokardlebensfähigkeit über die Zeit am besten erhalten3.

Eine genaue, dynamische Bewertung der myokardialen Bioenergetik während der Lagerung ist unerlässlich, um Konservierungstechniken zu verbessern und die Organnutzung zu maximieren. Derzeit basiert die gängige Praxis auf statische Kühlspeicherung bei Temperaturen im Bereich von etwa 4–8 °C8. Obwohl dieses Protokoll über kurze Speicherzeiten erfolgreiche Ergebnisse gezeigt hat, kann eine längere Lagerung bei dieser Temperatur die Myokardintegrität gefährden. Daher ist es unerlässlich, serielle Messungen der Stoffwechselaktivität über verschiedene Temperaturen und Dauern durchzuführen, um die optimalen Speicherbedingungen für eine erfolgreiche Organtransplantation festzulegen. Die konventionelle Bewertung von Erhaltungsverletzungen basiert oft auf histologischer Untersuchung oder biochemischen Tests aus Myokardbiopsien, die invasiv, zerstörerisch sind und nur intermittierende, regionale Momentaufnahmen des Gewebestatus9 liefern. Im Gegensatz dazu ist die Phosphor-31-Magnetresonanzspektroskopie (31P MRS) eine leistungsstarke, nicht-destruktive Methode, die direkte, serielle Messungen wichtiger Energiemetaboliten wie Phosphokreatin (PCr), Adenosintriphosphat (ATP), anorganisches Phosphat (Pi) und intrazellulärer pH-Wert im intakten Herzgewebe 6,10,11,12 ermöglicht. Indem wiederholte Messungen im selben Organ ohne zusätzliche Gewebebehandlung ermöglicht werden, liefert 31P MRS globale und longitudinale Einblicke in den myokardialen Energiezustand und verbessert die experimentelle Präzision und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu biopsiebasierten oder serum-surrogatbasierten Ansätzen 6,13.

Die Beurteilung der kardialen Transplantatlebensfähigkeit mit 31P MRS wurde von Bernard et al.14 überprüft. Hier wird ein detailliertes, temperaturkontrolliertes Protokoll für ex vivo 3 Tesla 31 PMRS des Schweineherzens während der Konservierung vorgestellt. Diese Methode bietet einen praktischen Rahmen zur Überwachung des Substratverbrauchs, zum Testen von Speichervariablen und zur Validierung von Konservierungsmaßnahmen. Das Protokoll ist besonders geeignet für Labore, die serielle, ganzventrikle Messungen während statischer Kühllagerung durchführen, wie etwa Studien zur temperaturabhängigen Konservierung, Ischämie-Reperfusionsverletzungen oder zur Optimierung von Lösungen für Rand- und Extended-Kriterien-Spenderherzen.

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Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der institutionellen Tierpflege und wurde vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee (Protokollnummer SW24M319) für alle Verfahren mit lebenden Tieren bis einschließlich chirurgischer Ernte genehmigt. Alle nachfolgenden ex-vivo-Experimente wurden mit Geweben durchgeführt, die nach der Euthanasie gewonnen wurden.

1. Vorernteverfahren

  1. Stellen Sie den Inkubator auf eine Temperatur ein, die 2 °C unter der Ziel-Erhaltungstemperatur liegt. Lassen Sie den Inkubator mindestens 2 Stunden stabilisieren.
  2. Lege 6–7 Eispacks in den Inkubator, um sie auf die eingestellte Temperatur vorabzukühlen. Stellen Sie sicher, dass die Eispacks ausreichend sind, um die Temperatur während des Transports zu halten.
  3. Bereiten Sie eine modifizierte Kardioplegielösung für Saint Thomas vor:
    1. In 1 L des Lactated Ringers Lösungsbeutel fügen Sie hinzu
      1. 30 ml 8,4 % Natriumbicarbonat
      2. 5 ml 30 mmol/10 mL Kaliumchlorid
      3. 2,5 ml 20 mmol/10 ml Magnesiumsulfat
      4. 15 ml 50 % Dextrose
      5. 100 mg 50 mg/10 ml Nitroglyzerin
      6. 5000 U kaltes Erythropoietin
    2. Bereiten Sie insgesamt 3 Liter Kardiopleiielösung vor und lagern Sie die Lösung im vorgekühlten Inkubator.
  4. Stellen Sie den isolierten Kühler mit einem eingebauten Silikonschlauch beiseite, der eine optimale Positionierung der vertikalen Höhe des Herzens ermöglicht. Setzen Sie eine schwarze Referenzmarkierung auf den Silikonschlauch an der Stelle, die direkt unter der Öffnung des Kühldeckels liegt.
  5. Stellen Sie eine gerippte Kanüle beiseite, um das geerntete Herz zu sichern und aufzuhängen. Setzen Sie eine schwarze Referenzmarkierung auf die Außenseite der Kanüle, um als reproduzierbarer Ausrichtungspunkt zu dienen.

2. Ernteverfahren

  1. Sedieren Sie das Tier mit einer Kombination aus Telazol, Ketamin und Xylazin, gemischt in einer einzigen Spritze, die intramuskulär verabreicht werden, um den Stress und die Schmerzen durch mehrere Injektionen zu minimieren.
    1. Telazol (50 mg Tiletamin + 50 mg Zolazepam) mit 4,4 mg/kg pro Komponente.
    2. Ketamin mit 2,2 mg/kg.
    3. Xylazin mit 2,2 mg/kg.
  2. Intubieren und betäuben Sie das Tier.
    1. Gezeitenvolumen bei 5-10 mL/kg.
    2. Atemfrequenz liegt bei 12–15 Atemzügen pro Minute.
    3. Positiver endexspiratorischer Druck bei 5 cm H2O.
    4. Isofluran wurde mit 0,5–2 % inhaliert, mit einem Sauerstofffluss von 1–2 L/min.
  3. Setze periphere intravenöse Linien, führe eine Sternotomie durch und öffne dasPerikard 15. Verabreichen Sie bei Bedarf Antiarrhythmika.
  4. Setzen Sie eine Kardioplegie-Nadel in die aufsteigende Aorta, oberhalb der Aortenklappe, aber unterhalb des Aortenbogens.
  5. Spike und verbinde eine 1-Liter-Tüte mit Kardiopleigielösung an die Nadel.
  6. Belüften Sie den linken Vorhof, die untere Vena cava und die obere Vena cava.
  7. Setzen Sie eine Aortenkreuzklemme proximal zum Bogen an.
  8. Initiieren Sie den Kardioplei-Fluss durch die Koronaren bei einem Druck von etwa 75–80 mmHg. Überwachen Sie den Druck mit einem Inline-Messgerät.
  9. Ernten Sie das Herz und bewahren Sie die anatomische Integrität.
  10. Gieße vorgekühlte Kochsalzlösung über das geerntete Herz, um die Oberfläche schnell abzukühlen.
  11. Legen Sie das Herz in eine Schüssel mit kalter Kardiopleielösung.
  12. Führen Sie eine Myokardtemperatursonde an der Herzspitze ein und ein Thermometer in die Schale mit kardioplegischer Lösung zur Temperaturmessung.
  13. Trennen Sie die Aorta von der Lungenarterie (PA).
  14. Sichern Sie die gerippte Kanüle in der Aorta mit Seidenbindern und Kabelbindern und stellen Sie sicher, dass der markierte Teil der Kanüle der Position des linken Ventrikels (LV) entspricht.
  15. Fülle die Kühlbox mit der Saint-Thomas-Lösung auf 60–70 % Kapazität und übertrage dann das Herz und die Lösung der Schüssel in die Kühlbox für eine vollständige Füllung und maximiere so das Eintauchen.
  16. Messen und dokumentieren Sie die sowie die Gewebetemperatur.
  17. Befestigen Sie die gerippte Kanüle am Kühldeckel mit Silikonschlauch an der vordefinierten Markierung. Stellen Sie sicher, dass die Spuren an der gerippten Kanüle und dem Silikonschlauch ausgerichtet sind, sodass das LV beim schließenden Kühler eine gleichmäßige Ausrichtung zum Deckel beibehält und so eine reproduzierbare Positionierung des LV bei jedem Scan gewährleistet ist (Abbildung 1A).
  18. Entlüften Sie das Organ, um eine optimale Homogenität des MR-Feldes und ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis während der MR-Datenerhebung zu gewährleisten.
  19. Sichern Sie den Kühlerdeckel und stellen Sie sicher, dass der LV ausgerichtet ist.
  20. Packe Eispacks und eine Kühlbox in eine Transporttasche.

3. Spektroskopieprotokoll

  1. Dieses Protokoll ist für einen 3T-MR-Scanner optimiert. Der MR-Scanner ist mit einer Multinuklei-Spektroskopie-Option ausgestattet, einschließlich eines 4-kW-Breitband-Hochfrequenzverstärkers und -empfängers, einschließlich der vom Hersteller bereitgestellten Standard-Phosphorspule (P140). Die 31-P-Spule ist eine 14 cm große Einzelschleifen-Sende-/Empfangsspule mit zwei Stäben zum Stimmen und Abstimmen.
  2. Benachrichtigen Sie das Personal der MRT-Einrichtung vor dem Transport und bestätigen Sie die Verfügbarkeit des Ultraschalls.
  3. Bereiten Sie eine Styroporbox mit folgenden äußeren Maßen vor: Länge 33,5 cm, Breite 28 cm (längere Kante), Breite 23 cm (kürzere Kante) und Dicke 4 cm. Machen Sie auf einer Seite der Box einen Schlitz von 3,3 cm Breite, um die 31-P-Spule neben das Herz zu platzieren (Abbildung 1B).
  4. Setzen Sie den Kühler mit dem schwebenden Herzen neben der zentralen Achse der Spule ein und zielen Sie auf die LV-Position ab (Abbildung 1C). Bereiten Sie eine Kühlbox vor, die 25,4 cm hoch und 11,4 cm breit ist. Der Silikonschlauch ist in einer Länge von 7 cm von der Innenseite des Deckels an der Befestigungsstelle des Herzens befestigt (Abbildung 1D).
  5. Platzieren Sie Eispacks in Lücken rund um den Kühler, achten Sie darauf, keinen Raum zwischen Kühler und Spule zu schaffen, und kleben Sie dann den Deckel der Box ab, um während des Scannes für Stabilität zu sorgen (Abbildung 1E).
  6. Zentriere den Kühler mit den Laserführungen und dem Zentrierungs-Orientierungspunkt am Magnet-Isozentrum, um eine optimale B-0-Homogenität zu gewährleisten (Abbildung 1F).
  7. Stecken Sie die 31-P-Spule in den Scan-Anschluss und befestigen Sie Stimm- und Anpassungsstäbe an der Spule (Abbildung 1F).
  8. Erwache Tri-Plane-Localizer-Scout-Bilder, um die Spulenplatzierung und die optimale LV-Nähe zur 31-P-Spule zu überprüfen (Abbildung 2).
  9. Wenn die LV-Position falsch ist, drehe den Kühlerdeckel und führe den Scout-Scan erneut durch.
  10. Erfassen Sie ein statisches Feld B0-Map für lokalisierte 2. Ordnung Shimming16 , um ein gleichmäßiges Magnetfeld über den für eine hohe spektrale Qualität erforderlichen Interessensbereich zu gewährleisten:
    1. Nach dem Erwerb derB-0-Karte startet automatisch ein "Shimtool"16 mit geladener Karte (Abbildung 3).
    2. Klickpunkte eines geglätteten Polygons, das den Herzmuskel in allen Schnitten umreißt (Abbildung 3A).
    3. Das "Shimtool" führt dann eine eingeschränkte Fit-Small-Square-Anpassung durch, um die lokalisierte Resonanzfrequenz sowie erste (x, y, z) und zweite Ordnung (xy, xz, yz, x2-y 2, z2-(x2+y2)/2) Shim-Feldkorrekturen zu bestimmen (Abbildung 3C). Laden Sie diese Korrekturbedingungen auf den Scanner hoch und wenden Sie sie auf die folgenden Scans an.
  11. Vor der 31-P-MRS-Aufnahme drehen Sie die Stimmstangen der Spule, um eine optimale Abstimmung der Hochfrequenzspule sicherzustellen und ihre Impedanz an das MR-System anzupassen, wodurch die Effizienz der Signalübertragung maximiert und Reflexionen im Hochfrequenzsystem minimiert wird (Abbildung 4).
  12. Erfassen Sie zunächst nicht lokalisierte 31P MR-Spektren (Wiederholungszeit [TR]: 10 s, Flip-Winkel = 90° mit adiabatischen B1-Insensitive Rotation-4 (BIR-4)-Impulsen; Echozeit [TE] = 0,1 ms; Bandbreite = 3000 Hertz (Hz); 1024 Spektralpunkte, 5 Durchschnitte), um die Resonanzfrequenz im Zentrum zwischen den PCr- und γ-ATP-Peaks zu bestimmen. Gesamt-Erwerbszeit: 50 S.
  13. Anschließend erhält man vollständig entspannte, nicht lokalisierte 31-P-MR-Spektren, nachdem man die Versatzfrequenz anhand der Berechnung in 3,12 angepasst hat (TR: 16 s, Flip-Winkel = 90° unter Verwendung adiabatischer BIR-4-Impulse; TE = 0,1 ms; Bandbreite = 3000 Hz; 512 Spektralpunkte, 20 Durchschnitte). Gesamtaufnahmezeit: 5 Minuten und 20 Sekunden.
  14. Nach dem Scannen missen Sie die Flüssigkeits- und Myokardtemperaturen; die Abweichung vom Ziel beträgt ≤1 °C.
  15. Lagere das Herz im Inkubator bei der gewünschten Temperatur bis zum nächsten geplanten Ultraschall.

4. Datenanalyse

  1. Exportiere die vollständig entspannten 31-P-MRS-Daten als . SDAT-Datendateien und in eine grafische Benutzeroberfläche zur Verarbeitung geladen werden (Abbildung 5A)17.
  2. Zuerst apodisiere die Spektren mit einem 15-Hz-Lorentzschen Filter (Abbildung 5B), wende dann eine 0- und 1. Ordnung-Phasenverschiebung an und stelle die Frequenz im Zentrum des PCr-Peaks auf 0 Teile pro Million (ppm) ein (Abbildung 5C).
  3. Passen Sie die Spektren mit der AMARES-Funktion18 anhand der in Tabelle 1 aufgeführten Wissenswerte an.
  4. Überprüfen Sie die Analyse auf eine angemessene Anpassung im nächsten Fenster (Abbildung 6), indem sichergestellt wird, dass jeder Peak korrekt identifiziert wird (einzelne Komponenten) und dass nach der Analyse (Rest) ein minimales Restsignal erhalten bleibt.
  5. Berechnen Sie die Myokardmetabolitenverhältnisse PCr/ATP und PCr/Pi basierend auf der spektroskopischen Spitzenamplitude (Abbildung 7). Die γ-ATP-Resonanz wird als Maß für ATP verwendet.
  6. Berechnen Sie den intrazellulären pH-Wert basierend auf der chemischen Verschiebung zwischen Pi und PCr nach der Anpassung, um die Temperaturbedingung14 widerzuspiegeln.
    HINWEIS: Das Protokoll kann nach jedem MRT-Scan (Schritt 3.15) pausiert werden. Stellen Sie sicher, dass die Temperaturkontrolle während des gesamten Einsatzes aufrechterhalten wird.

5. Gleichungen

  1. Berechnen Sie den intrazellulären pH-Wert (pHi) wie zuvor beschrieben19:
    Gleichung 1
    Dabei ist T die Temperatur in °C und δ0 die beobachtete chemische Verschiebungsdifferenz zwischen den PCr- und Pi-Resonanzen in ppm.

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Ergebnisse

Das lokalisierte 2. Ordnungs-Shimming16 führte zu einem homogenerenB-0-Magnetfeld über den interessierenden Bereich, was sich an einer Verringerung der Standardabweichung an jedem Zeitpunkt zeigt (0 H: 14,0 bis 4,0 Hz; 4 H: 17,5 bis 3,2 Hz; 8 H: 16,0 bis 3,2 Hz). Dies stellte sicher, dass an jedem Zeitpunkt eine ausgezeichnete spektrale Qualität erreicht wurde (Abbildung 7). Die myokardialen Stoffwechselveränderungen während der ex-vivo-Kühll...

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Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt eine chirurgische Vorbereitung sowie ein 31P MRS-Erfassungs- und Analyseprotokoll zur seriellen Beurteilung myokardialer Energetika während der Herzkonservierung. 31P MRS ermöglicht eine serielle, nicht-destruktive Bewertung wichtiger Herzmetaboliten bei unterschiedlichen Kaltlagertemperaturen, was neuartige Einblicke in die metabolische Lebensfähigkeit des Myokardgewebes liefert. Dieses 31-P-MRS-Protokoll ist relativ schnell und benötig...

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Offenlegungen

Wir haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir möchten unser Team von Johns Hopkins in der Abteilung für Herzchirurgie und Radiologie für die erfolgreiche Durchführung dieser Forschung würdigen. Diese Studie wurde von der American Association for Thoracic Surgery (AATS) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
InkubatorBenchmark Scientific H2265-HCMyTemp 65HC Heizkühlung Inkubator
IsolierkühlerGatoradeUPC-052000047097Gatorade isolierter Sportgetränkekühler
jMRUI Version 7.0Javawww.jmrui.euGrafische Benutzeroberfläche für Datenanalyse
MyokardtemperatursondeDeRoyal81-030415DeRoyal 400-Serie Myokardialtemperatursonde (15 mm)
MagnetresonanzscannerPhilipshttps://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingAchieva 3T, Philips Healthcare
Einzelschleifen-PhosphorspulePhilips Healthcare https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingP140, Philips Healthcare

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