RNA-assoziierte Chromatin-DNA-Interaktionsmethode

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erfassung RNA-assoziierter Chromatin-DNA-Interaktionen zur Kartierung der RNA-bezogenen dreidimensionalen Genomorganisation.

Zusammenfassung

Die RNA-assoziierte Chromatin-DNA-Interaktionsmethode (RDD) ist eine gezielte Strategie zur Kartierung von Chromatin-Interaktionen, die durch eine bestimmte RNA verankert sind. Gleichzeitig identifiziert es genomische Loci, die mit der interessierenden RNA assoziiert sind, und löst langfristige DNA-DNA-Kontakte zwischen diesen Loci auf, was die Schlussfolgerung räumlicher Organisation und regulatorischer Beziehungen ermöglicht. Bei RDD werden biotinylierte Antisense-Sonden, die zur Ziel-RNA ergänzen, zur Anreicherung von RNA-Chromatinkomplexen verwendet. Die Zellen werden vernetzt, Chromatin fragmentiert und am Ende repariert, und die Proximitätsligatur erfolgt mittels eines entworfenen Linkers, der DNA-Fragmente verbindet, die räumlich benachbart innerhalb der eingefangenen Komplexe liegen. Die Ligationsprodukte werden gereinigt, in Sequenzierungsbibliotheken umgewandelt und durch Hochdurchsatzsequenzierung analysiert, um RNA-verankerte Interaktionskarten zu erzeugen. RDD ist sowohl auf endogene RNAs als auch auf exogene RNAs anwendbar, die von wirtsinfizierenden Mikroorganismen und Viren abgeleitet sind, und ist mit verschiedenen Zelltypen und experimentellen Bedingungen kompatibel. Die Methode liefert locusspezifische, hochauflösende Kontaktprofile, die sich für die Dissektion der Enhancer-Promotor-Paarung, Langstreckenregulation und eine dreidimensionale Genomarchitektur eignen, die mit regulatorischer Codierung und nicht-kodierenden RNAs assoziiert sind. Durch die Integration biochemischer Anreicherung mit Proximity-Ligation und Next-Generation-Sequenzierung bietet RDD einen robusten und reproduzierbaren Workflow, um zu zeigen, wie RNAs Chromatin organisieren und die Genexpression beeinflussen.

Einleitung

Hi-C und ChIA-PET haben Studien zur dreidimensionalen (3D) Genomorganisation transformiert, indem sie räumliche Nähe zwischen Chromatinfragmenten in kovalente DNA-Junctions umwandeln, die sequenziert werden können, um physische Kontakte über Skalen hinweg von Schleifen bis zu Kompartimenten ^1,2 abzuleiten. Über Proteine hinaus sind zahlreiche RNAs an Chromatin-Interaktionen beteiligt und beeinflussen die Kommunikation zwischen Enhancer/Repressor und Promotor sowie die Organisation höherer^{Chromatin-Ordnung 3}; trotz Fortschritten bei proteingeankerten Tests bleibt es jedoch schwierig, direkt festzustellen, wie eine bestimmte RNA langfristige DNA-DNA-Interaktionen zwischen ihren gebundenen Loci organisiert. Das übergeordnete Ziel der RNA-assoziierten Chromatin-DNA-Interaktionsmethode (RDD)⁴ ist es, hochauflösende, RNA-verankerte Chromatin-Interaktionskarten zu erstellen, die zeigen, wie eine definierte RNA-Spezies mit Chromatin assoziiert und DNA-DNA-Kontakte in ihrer lokalen Nachbarschaft orchestriert, wodurch mechanistische Schlussfolgerungen über die Kommunikation zwischen Enhancer/Repressor-Promotor und die auf dieser RNA zentrierte Genomarchitektur höherer Ordnung ermöglicht. Methodisch bereichert RDD gekreuzte RNA-Chromatin-Komplexe mit biotinylierten Antisense-Sonden gegen die relevante RNA, führt eine On-Komplex-Proximitätsligation mit einem entworfenen Linker durch, um räumlich benachbarte DNA-Fragmente zu verbinden, und konstruiert Sequenzierungsbibliotheken, um lokusspezifische Kontaktprofile zu erhalten, die für hypothesenbasierte Analysen über verschiedene Zelltypen und Bedingungen hinweg geeignet sind, einschließlich Kontexten mit exogenen bakteriellen oder viralen RNAs in infizierten Wirten. Diese Merkmale positionieren RDD als RNA-verankertes Gegenstück zu etablierten Chromosomen-Konformationsmethoden und liefern interpretierbare Kontaktinformationen zu Resolutionen, die für regulatorische Analysen geeignet sind.

Die Begründung für RDD beruht auf den Einschränkungen bestehender RNA-Chromatin-Kartierungsstrategien. Gezielte Capture-Ansätze wie ChIRP-seq und CHART-seq identifizieren die genomweite DNA-Besetzung einer einzelnen RNA, einem Ein-RNA-zu-alle DNA-Paradigma, das die Bindung meldet, aber nicht die physischen DNA-DNA-Kontakte zwischen besetzten Loci ^6,7. Globale Assays, darunter GRID-seq und MARGI, haben sich auf alle RNA auf alle DNA-Systeme ausgeweitet und katalogisieren RNA-DNA-Näherungen im gesamten Genom, ohne jedoch eine explizite Auflösung von DNA-DNA-Kontakten innerhalb RNA-zentrierter Komplexe ^3,8. Multiplexierte Methoden wie RD-SPRITE berichten über höherordnungige Kolokalisierung zwischen vielen RNAs und DNA-Loci und vermitteln Aspekte der Kerntopologie⁹, doch Signale werden typischerweise von reichlich vorhandenen RNAs dominiert, die regulatorische RNAs mit geringer Häufigkeit verschleiern und die Zieltiefe für das Interaktionsnetzwerk einer einzelnen RNA einschränken können. Protein- oder mark-verankerte Anreicherungs-plus-Ligation-Strategien wie ChIA-PET¹⁰, PLAC-seq¹¹ und HiChIP¹² kartieren effektiv faktorzentrierte Schleifen, verankern jedoch keine Interaktionen an eine definierte RNA ohne ein RNA-spezifisches Fangmodul, sodass die RNA-verankerte DNA-DNA-Dimension ungelöst bleibt. Durch die Integration gezielter biochemischer Anreicherung mit komplexer Proximitätsligation erfasst RDD direkt DNA-DNA-Kontakte zwischen Chromatinfragmenten, die von der RNA von Interesse⁴ besetzt sind, erhöht die Sensitivität und Spezifität für RNAs mit niedriger bis mittlerer Häufigkeit und erzeugt hochauflösende, lokusspezifische Kontaktkarten, die die belegungszentrierten (ChIRP/CHART)^6,7 und proximitätszentrierten globalen Methoden (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE)³ ergänzen^{, 8,9}, während konzeptionell Proteinfaktor-verankerte Ligationsstrategien (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP^{) parallel} gingen. Leser sollten RDD in Betracht ziehen, wenn eine biologische Frage die Auflösung räumlicher Beziehungen zwischen Chromatinloci, die speziell mit einer Ziel-RNA assoziiert sind – insbesondere wenn diese RNA angenommen wird, langfristige genomische Interaktionen zu unterstützen, zu überbrücken oder einzuschränken, um die Transkription abzustimmen – oder wenn vermutete regulatorische Ziele aus dem RNA-Bindungsset priorisiert werden, wobei direkte RNA-zentrierte Hubs von bloßer Kobesetzung unterschieden werden. Die Abgrenzung von Enhancer-/Repressornetzwerken für spezifische RNAs oder die Nachverfolgung der Neuverdrahtung RNA-verankerter Kontakte über Störungen, Entwicklungsstadien oder Infektionen hinweg. In solchen Szenarien adressiert RDD einen ungedeckten Bedarf, indem RNA-verankerte DNA-DNA-Interaktionsinformationen mit der Sensitivität, Spezifität und Auflösung geliefert werden, die für rigorose mechanistische Studien erforderlich sind.

Protokoll

HINWEIS: Für diese RDD-Methode verwendet das Beispielsystem Drosophila S2-Zellen sowie sowohl die roX2 - als auch die 7SK-ncRNAs ; Reaktionsreagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt, Pufferzusammensetzungen sind in Tabelle 2, Reagenzdetails und Instrumentdetails sind in Materialien aufgeführt. Abbildung 1 bietet einen Überblick über das Protokoll zur Erstellung von RDD-Bibliotheken. Verfahren mit Rotation (F8) verwenden folgende Parameter: F8, 20 U/min, uu20 und UU30. Für alle Puffer, die von Stufe 2 bis Stufe 10 verwendet werden, wird frisch mit einem 1x-Proteinase-Inhibitor (PI) und einem RNase-Inhibitor (RI, 0,05 U/μL) ergänzt.

Sondendesignprinzipien: Für neuartige, nicht gemeldete RNA werden Sonden online mit dem Stellaris Probe Designer entworfen und anschließend unspezifische Sequenzen mit Ausrichtungswerkzeugen (z. B. BLAST-ähnliche Ausrichtung) oder UCSC BLAT herausgefiltert, gefolgt von einer 3′-Biotinylierung der ausgewählten Sonden. Für neue Ziel-RNAs werden Sequenzen entworfen, die mit der Ziel-RNA übereinstimmen, um als Negativkontrolle zu dienen, die ebenfalls einer 3′-Biotinylierung unterzogen werden. Die Qualitätskontrolle beinhaltet die Entwicklung von Reverse-Transkriptionsprimern gegen die Ziel-RNA zur Transkriptionsvalidierung sowie genomisch DNA-gezielte Primer für qPCR zur Bewertung der Kontamination; Primer enthalten, die genomische Bindungsstellen und nichtbindende Regionen lokalisieren, um die Bindungsspezifität zu bewerten. roX2 - und 7SK-verwandte Sonden sind in Tabelle 1 dargestellt.

1. Zellernte und duales Crosslinking

1. Drosophila S2-Zellen bei 27 °C kultivieren. Ziel ist es, insgesamt etwa 3 x 10^{Zellen zu} sammeln. Die Zellen direkt im Kulturmedium wieder suspendieren und nach Trypan-Blau-Zählung 8 x 10 bis⁸ Zellen in jedes 50-mL konische Zentrifugenrohr einführen.
   1. Mischen Sie 2 μL Zellen mit 8 μL DPBS, fügen Sie 10 μL Trypan Blue hinzu und laden Sie dann auf das Hämozytometer zur Zellzählung.
      HINWEIS: Drosophila S2-Zellen werden als Beispiel präsentiert. Typischerweise entsprechen 8 x 10^{8 Zellen etwa} 40 ml Kulturvolumen, das in einem einzigen 50-mL konischen Rohr verarbeitet wird. Nutzer können die Kulturbedingungen anpassen und die Zellmengen je nach verwendetem Zelltyp und der Häufigkeit der Ziel-RNA ernten.
2. Formaldehyd auf eine Endkonzentration von 1 % (W/V) hinzufügen und 20 Minuten bei 27 °C drehen.
   HINWEIS: Fixieren Sie bei Kulturtemperatur oder bei Raumtemperatur (RT; 20-25°C). Sofern nicht anders angegeben, drehen Sie den Mixer (F1, 12 U/min). Für adhärente Zellen verwenden Sie einen Orbitalshaker (50 U/min).
   VORSICHT: Formaldehyd ist giftig; Benutze eine Abzugshaube.
3. Pelletzellen bei 845 x g für 5 Minuten bei RT; Entsorgen Sie Supernatant auf die entsprechenden chemischen/biologischen Abfälle. Das Zellpellet aus 8 x 10 8 S2-Zellen misst typischerweise etwa 1 cm³ im Volumen.
4. Die Kugel wird in frisch zubereitetem 2 mM EGS auf ein Gesamtvolumen von 40 mL in DPBS wieder suspendiert und bei 27 °C für 40 Minuten gedreht.
   HINWEIS: EGS im DMSO auflösen und an DPBS übertragen (siehe Tabelle 2). EGS in DMSO ist gefährlich.
5. Abschrecken Sie durch Zugabe von 2 ml 2,5 M Glycin (finales 0,125 M); Drehen Sie sich 10 Minuten bei 27 °C.
6. Pellet bei 845 x g für 5 Minuten bei RT; Entsorgen Sie Supernatant auf die entsprechenden chemischen/biologischen Abfälle. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 40 ml vorgewärmtem DPBS bei 27 °C.
7. Pellet bei 845 x g für 5 Minuten. Das Zellpellet in 10 ml DPBS wieder suspendieren und die Zellen zählen. Die Zellzahl kann während des Vernetzungsschritts abnehmen, typischerweise um etwa 30 %.
8. Aliquot 1 x 10^{9 Zellen in} jedes 50-mL-Rohr; Pellet mit 845 x g für 5 Minuten bei RT; Supernatant wegwerfen. Lagern Sie die Pellets bei −80 °C.
   HINWEIS: Alle folgenden Reaktionsschritte gelten für eine RDD-Bibliothek.

2. Zelllyse und Permeabilisierung der Kerne

1. Nimm 1 x 10 9 S2 doppelt vernetzte Zellen aus dem −80 °C Gefrierschrank. 30 Minuten auf Eiswasser tauen.
2. Die Zellen in 50 mL DPBS wieder suspendieren, bei 845 x g für 5 Minuten bei RT zentrifugieren und das Überstandsmittel entsorgen.
3. Zelllyse: Das Zellpellet wird in 20 mL 0,1 % FA-Lysepuffer (ohne Triton X-100) wieder suspendiert. Rotiere 15 Minuten bei RT. Mikroskopisch prüfen; Passen Sie die Zeit nach Zelltyp an. Eine erfolgreiche Lyse wird durch die Permeabilisierung der Plasmamembran und zytoplasmatische Freisetzung angezeigt, sodass Kerne unter einem Standardlichtmikroskop als eigenständige Strukturen sichtbar werden (Abbildung 2A).
4. Kernpermeabilisierung: Fügen Sie 1,8 ml 10 % SDS hinzu (finales 1 %). Drehen Sie bei 37 °C für 15 Minuten. Zentrifugiere bei 3.200 x g für 20 Minuten bei RT und entsorge den Supernatanten. Überprüfung mittels Mikroskopie (Abbildung 2B); Passen Sie die Zeit nach Zelltyp an. Die Kerne erscheinen dunkler, membranartig oder einige sind abgelöst. Wiederholen, bis die Lyse abgeschlossen ist.
5. Nucleus-Wash: Das Pellet in einem 20 mL 0,1 % FA-Lysepuffer (ohne Triton X-100) wieder suspendieren, 10 Minuten bei RT drehen, dann bei 3.200 x g 20 Minuten bei RT zentrifugieren, den Supernatant entsorgen und die Größe des Kernpellets markieren. Lagern Sie das Kernpellet bei −80 °C für spätere Nutzung.

3. Chromatinfragmentierung

1. Restsuspendieren Sie das Kernpellet in 15 mL 0,1 % FA-Lysepuffer (mit Triton X-100). Aliquot 1,5 mL der Kernsuspension in jedes 14-mL-Reagenzglas mit rundem Boden und vermeide dabei Blasen.
   1. Markiere die Größe des Pellets vor der Sonikation zum Vergleich und wiederhole die Sonikation, falls das Pellet nach der Sonikation noch groß bleibt.
2. Sonikiere mit Amplitude 38 % für 4,5 Minuten, mit 30 s AN / 30 s AUS Zyklen. Sammeln Sie das gesamte sonizierte Chromatin in ein 15-mL-Rohr und zentrifugieren Sie bei 3.200 x g für 20 Minuten bei RT, dann übertragen Sie das Supernatant (~13 mL) in ein neues 15-mL-Rohr.

4. Preclear-Chromatin mit C1-Perlen

1. Streptavidin C1-Perlen bereiten: Aliquot 400 μL Streptavidin C1-Perlen in ein 1,5 mL Rohr (100 μL pro 1 × 10 9 S2-Zellen), für 30 Sekunden auf einen Magneten setzen und Supernatant entfernen. Waschen Sie zweimal mit 200 μL 0,1 % FA-Lysepuffer (mit Triton X-100) und suspendieren Sie dann in 100 μL 0,1 % FA-Lysepuffer (mit Triton X-100).
2. Chromatin-Preclear: Geben Sie die 100 μL präparierten Streptavidin-C1-Perlen in das Rohr mit ~13 mL soniziertem Chromatin-Supernatant (ab Schritt 3.2); 20 Minuten bei RT rotieren; 1 Minute auf ein magnetisches Rack gelegt und das Supernatant (vorfreigegebenes Chromatin) auf neue 50-mL-Röhren übertragen; nehmen Sie 10 μL und speichern Sie bei −20 °C für QC1 (Abbildung 3A).

5. Hybridisieren der RNA-Sonde mit dem vorfreigegebenen Chromatin

1. Fügen Sie 2 Bände (26 mL) frisch vorbereiteten Hybridisierungspuffer zu 1 Volumen (13 mL) vorgeklärtem Chromatin hinzu; Rotiere 30 Minuten bei RT.
2. Aliquot die Mischung in drei 15-mL-Röhren; fügen Sie 6 μL 100 μM biotinylierte Sonden (DNA-Oligonukleotid, Tabelle 1) zu jeder Probe hinzu (2 μL pro 15 mL Röhre); Über Nacht bei 37 °C drehen. Versiegeln Sie die Röhrchenkappen mit Film.

6. Immobilisierungssonde – Chromatinkomplex auf C1-Perlen

1. Blockstreptavidin C1-Perlen mit Blockpuffer: Nehmen Sie 400 μL frische Streptavidin-C1-Perlen und waschen Sie zweimal mit 800 μL 0,1 % FA-Lysepuffer (ohne Triton X-100); 400 μL Blocking Buffer hinzufügen und 30 Minuten bei RT auf einem Mischer (F8) inkubieren. 10 Minuten auf einen Magneten legen und das Supernatant entsorgen; Dreimal mit 800 μL 0,1 % FA-Lysepuffer (ohne Triton X-100) waschen. Bei jeder Wäsche vorsichtig mit einer Pipette zum Mischen, auf den Magneten für mindestens 30 Sekunden legen und dann den Überschlagsstoff entsorgen.
2. Setzen Sie die C1-Perlen in 400 μL Hybridisierungspuffer wieder auf.
3. Immobilisieren Sie den Probe-Chromatin-Komplex auf Streptavidin-C1-Perlen: Fügen Sie die Blocking Buffer-behandelten Streptavidin-C1-Perlen dem entsprechenden hybridisierten Chromatin hinzu und drehen Sie sie 2,5 Stunden bei RT.
4. Übertragen Sie die Immobilisierungsreaktion von 15-mL-Röhren auf ein 1,5-mL-Rohr mittels eines magnetischen Racks. Jede 15-mL-Röhre für 5 Minuten auf ein magnetisches Rack setzen; Entferne das Supernatant. Perlen mit 1 ml Waschpuffer wieder suspendieren und auf ein neues 1,5-mL-Rohr übertragen.
5. Wasche die Perlen fünfmal mit 800 μL Waschpuffer, dann zweimal mit TE-Puffer. Zum Waschen fügen Sie Puffer hinzu, inkubieren Sie 5 Minuten auf einem Mischer (F1, 12 U/min) bei 37 °C, legen Sie es 30 Sekunden auf ein magnetisches Gitter und entsorgen Sie das Supernatant.
6. Halten Sie die Perlen in 1.000 μL TE-Puffer (1x PI) bei RT.

7. Blockieren unbewohnter Stellen auf C1-Perlen mit denaturiertem Iodoacetyl-PEG2-Biotin (IPB)

1. 4,8 mg IPB in 400 μL IPB Wash-Puffer auflösen; Rotiere 15 Minuten bei RT.
2. β-ME-Lösung: Fügen Sie 1 μL β-ME zu 312 μL H₂O hinzu; Mixen und 15 Minuten bei RT rotieren.
3. Denature-IPB: 44 μL der β-ME-Lösung zu 400 μL IPB hinzufügen; Mixen und 15 Minuten bei RT rotieren.
4. Blockieren Sie die C1-Perlen: Fügen Sie 220 μL des denaturierten IPB zu den C1-Perlen hinzu, die mit dem Probe-Chromatin-Komplex gebunden sind (in 1.000 μL TE); Rotiere 15 Minuten bei RT.
5. Wasche die C1-Perlen fünfmal mit TE. Puffer hinzufügen, 5 Minuten auf einem Mixer (F8) bei RT inkubieren, dann 30 Sekunden auf ein magnetisches Rack legen und das Supernatant entsorgen.

8. Chromatin-Endreparatur (auf Perlen)

1. Fügen Sie 693 μL Endreparaturmischung dem Chromatin bei C1-Perlen hinzu und mischen Sie gut; dann 7 μL T4-DNA-Polymerase hinzufügen.
2. Inkubieren auf einem Thermomixer (800 U/min) bei 12 °C für 30 Minuten; dann auf Mixer (F8) bei 16 °C für 15 Minuten.
3. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 800 μL eiskalten ChIA-PET-Puffer, dann einmal mit TE. Bei jeder Wäsche vorsichtig mit einer Pipette zum Mischen, auf den Magneten für mindestens 30 Sekunden legen und dann den Überschlagsstoff entsorgen.

9. Chromatin A-Tailing (auf Perlen)

1. Fügen Sie 693 μL A-Tailing-Mischung dem Chromatin der C1-Perlen hinzu und mischen Sie gut, dann geben Sie 7 μL Klenow-Fragment (3'-5' exo-).
2. Inkubiere auf dem Mischer (F1, 12 U/min) bei 37 °C für 50 Minuten. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 800 μL eiskaltem ChIA-PET-Puffer, dann einmal mit einem Elutionspuffer.

10. Chromatin-Proximitätsligation (auf Perlen)

1. Fügen Sie 1.390 μL Proximity-Ligationsmischung zum Chromatin bei C1-Perlen hinzu. Inkubiere auf dem Mixer (F8) bei RT für 5 Minuten.
2. Dann fügen Sie 10 μL T4-DNA-Ligase hinzu. Schalte den Mixer (F8) auf RT für 5 Minuten, dann schalte auf F1 (12 U/min) bei RT für 50 Minuten, gefolgt von 16 °C über Nacht.
3. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 800 μL eiskaltem ChIA-PET-Puffer, dann zweimal mit TE-Puffer.

11. Freisetzung der proximitätsligierten Chromatin-DNA aus den C1-Perlen

1. Füge 480 μL LC ChIP-Elutionspuffer zum Chromatin auf C1-Perlen hinzu, mische gut und gib 20 μL 20 mg/mL Proteinase K zur Entvernetzung hinzu.
2. Inkubieren Sie über Nacht auf einem Thermomixer (950 U/min) bei 65 °C.

12. Proximitäts-ligierte DNA-Reinigung (mit Phenol: Chloroform: IAA-Reagenzien)

1. Drehen Sie das Hochdichte-Phasen-Lock-Rohr bei 13.500 x g für 2 Minuten bei RT. Fügen Sie entkreuzte Produkte (500 μL) in das hochdichte Phasen-Lock-Rohr ein.
2. Fügen Sie 500 μL Phenol:Chloroform:IAA (mit einer 5-ml-Pipettenspitze) in das hochdichte Phasenlock-Rohr ein. Mischen Sie vorsichtig von Hand.
   VORSICHT: Treten Sie in einer Abzugshaube auf.
3. Zentrifugiere mit 13.500 x g für 6 Minuten bei RT. Während des Zentrifugierens bereiten Sie ein 1,5-mL-Rohr vor, indem Sie 52 μL 3 M Natriumacetat (pH 5,5) auf den Boden geben. Geben Sie 1 μL Glykogen mit blauem Farbstoff auf die Kappe. Mischen oder schließen Sie das Rohr an dieser Stelle nicht.
4. Übertragen Sie das Überstandsmittel schnell aus dem hochdichten Phasensperrrohr in das vorbereitete 1,5-mL-Rohr.
5. Fügen Sie 520 μL eiskaltes Isopropanol in das 1,5-mL-Rohr hinzu. Sanft rühren und dann über Nacht bei -80 °C einsetzen.
6. Entferne das Rohr bei -80 °C und taue es bei RT (~10 Min) auf. Zentrifugiere bei 13.500 x g für ~1 Stunde bei 4 °C, um DNA auszufällen. Eine blaue Kugel befindet sich am Boden des Rohrs.
7. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 75 % Ethanol und entfernen Sie vorsichtig das Supernatant. Fügen Sie 800 μL 75 % eiskaltes Ethanol hinzu, zentrifugieren Sie bei 13.500 x g für 5 Minuten bei 4 °C und entfernen Sie den Überstandsmittel. Wiederhole die Ethanol-Waschung einmal.
   VORSICHT: Entfernen Sie das Überdachungsmittel unmittelbar nach der Zentrifugierung: zuerst mit einer 1-mL-Spitze, dann mit einer 100-μL-Spitze. Warme Schläuche können die blaue Kugel lösen.
8. Nach der letzten Ethanolwaschung zentrifugieren Sie bei 13.500 x g für 10 Minuten bei 4 °C, um eventuelle Reste von Ethanol am Boden aufzusammeln, und entfernen Sie dann vorsichtig das restliche Ethanol.
9. Trockne das DNA-Pellet im Vakuum (typischerweise 1 Minute, 30 Sekunden bis 2 Minuten). Das DNA-Pellet in 10 μL Elutionspuffer wieder suspendieren und etwa 2 Stunden bei RT inkubieren. Quantifizieren Sie die DNA mit einem Nukleinsäurequantifizor und bewerten Sie die Qualität mit einem automatischen Kapillarelektrophoresesystem (Abbildung 3B-C).

13. Proximitätsligierte DNA-Tn5-Tagmentation

1. Tn5-Tagmentationstest: Bereiten Sie ein Gesamtreaktionsvolumen von 50 μL gemäß Tabelle 1 vor. In einem PCR-Röhrchen auf Eis werden sequentiell 50 ng QC1-DNA, ddH₂O, und 12,5 μL 4x Tagmentation-Puffer hinzugefügt. Zum Schluss fügen Sie die erforderliche Menge des Tn5-Enzyms hinzu. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie nach jeder Zugabe 10 bis 20 Mal auf und ab spritzen und dabei Blasen vermeiden. Drehen Sie das Rohr bei Bedarf kurz durch.
   HINWEIS: Sanftes Mischen und das Vermeiden von Blasen sind für die Tagmentation entscheidend. Zusätzlich sollte die Tn5-Menge empirisch optimiert werden, um die gewünschte Fragmentverteilung (überwiegend 200 bp-1 kb) zu erreichen, und Benutzer können den Größenbereich durch Einstellung des Tn5-Eingangs anpassen.
2. Tagmentationsreaktion: Die Reaktion wird 10 Minuten bei 55 °C in einem PCR-Gerät mit Deckel auf 70 °C inkubiert und dann bei 4 °C gehalten.
3. Tn5-Freisetzung und DNA-Reinigung: Fügen Sie 50 μL ChIP-Elutionspuffer und 1 μL Proteinase K zur tagmentierten DNA hinzu (für eine endgültige SDS-Konzentration von 0,5 %). Mischen und inkubieren Sie auf dem Thermomixer bei 65 °C und 900 U/min für 30 Minuten. Reinigen Sie die DNA mit einem DNA-Reinigungskit und quantifizieren Sie die DNA mit einem automatischen Kapillarelektrophoresesystem (Abbildung 3D).
   HINWEIS: In diesem Stadium sollten DNA-Fragmente überwiegend zwischen 200 bp und 1 kb liegen. Das Verhältnis von Tn5-Enzym zu DNA sollte empirisch optimiert werden.
4. Tn5-Tagmentations-Skalierung: Basierend auf den Tn5-Testergebnissen skalieren Sie die Reaktion für proximitätsligierte DNA unter denselben Bedingungen hoch. Nach der Tagmentation entnehmen Sie die Probe aus dem PCR-Instrument und legen sie auf Eis. Kurz nach unten schleudern, 2 Minuten bei RT inkubieren und dann 5,5 μL mit 10 % SDS (mit /v; endgültige SDS-Konzentration: 1 %) hinzufügen. Mischen Sie, indem Sie 10 bis 20 Mal nach oben und unten pipetteren, dabei Blasen vermeiden, und kurz nach unten drehen. Proben bei 37 °C in einem PCR-Gerät mindestens 15 Minuten inkubieren. Markierte DNA kann mehrere Tage bei -20 °C gelagert werden.

14. Blockieren von M280-Perlen

1. Nimm 20 μL M280-Perlen und wasche zweimal mit 200 μL 1x B&W-Puffer. Zum Waschen fügen Sie Puffer hinzu, suspendieren Sie die Perlen durch Pipette wieder, drehen Sie kurz um, legen Sie den Magneten für 30 Sekunden auf und entfernen Sie das Supernatant.
2. Perlenblockierung mit Blockpuffer: Die M280-Perlen in 100 μL Blockpuffer wieder suspendieren; Rotiere 45 Minuten auf dem Mixer (F8) bei RT.
3. Perlenwäsche: Kurz abdrehen, 10 Minuten auf den Magneten legen und den Blockierpuffer entsorgen. Wasche Perlen zweimal mit 200 μL 2x Schwarz-Weiß-Puffer.
4. Perlenblockierung mit genomischer DNA: Perlen in 100 μL 2x B&W-Puffer wieder suspendieren, 100 μL gescherte genomische DNA (~500 ng, 300-500 bp) hinzufügen, gut mischen und 30 Minuten am Mischer (F8) bei RT rotieren.
5. Entsorgen Sie die genomische DNA-Mischung und waschen Sie die Perlen zweimal mit 200 μL 1x B&W-Puffer.

15. Immobilisierung von ligierter DNA auf M280-Perlen

1. Binden von ligierter DNA an M280-Perlen: 1x B&W-Puffer entsorgen. Fügen Sie alle fragmentierten ligierten DNA zu den M280-Perlen hinzu, mischen Sie sie und drehen Sie sie 45 Minuten auf dem Mixer (F8) bei RT.
2. Kurz nach unten drehen, auf den Magneten legen und Supernatant entsorgen. Fünfmal Wash Beads mit 500 μL vorgewärmtem Waschpuffer bei 37 °C; einmal mit 500 μL 1x B&W; und einmal mit 200 μL 1x B&W. 1 Minute auf den Magneten legen, vorsichtig am Röhrenboden vermischen und Supernatant entsorgen. Fügen Sie den Perlen 30 μL Elutionspuffer hinzu (nicht mischen).
   1. Zum Waschen fülle ich einen Puffer hinzu, inkubiere 5 Minuten auf dem Mixer (F8), lege 30 Sekunden auf den Magneten und entsorge dann den Supernatant. Perlen mit gebundener ligierter DNA können bei -20 °C gelagert werden.

16. Amplifikation von ligierter DNA auf M280-Perlen

1. PCR-Reaktion vorbereiten (laut dem DNA-Bibliotheks-Vorbereitungskit). Übertragen Sie die PCR-Röhrchen auf die PCR-Maschine und richten Sie das Programm ein.
   HINWEIS: PCR-Amplifikationszyklen sind entscheidend für die endgültige Bibliotheksqualität; Eine steigende Zykluszahl verringert die Bibliothekskomplexität. Optimiere die Anzahl der Zyklen empirisch und überschreite im Allgemeinen nicht 15 Zyklen.
2. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit magnetischen Perlen (Abbildung 3E). Größenauswahl: Verwenden Sie (0,8–0,61) magnetische Perlen, um die RDD-Bibliothek doppelt auszuwählen.
   1. Die endgültige DNA-Bibliothek sollte überwiegend zwischen 250 und 600 bp liegen (Abbildung 3F). Stellen Sie sicher, dass 10–30 ng Bibliotheks-DNA mit einem Nukleinsäurequantor für die Sequenzierung gemessen werden.
3. Sequenzierung: Subjekt für Illumina-Sequenzierung mit 2x 150 bp. Die Sequenzierungstiefe hängt von RNA-Expression, Bindungsstellendichte und genomweiten Mustern ab. Hier sättigt roX2 bei ~23 Millionen Lesungen und 7 SK bei ~8 Mio. Lesungen, sodass letzteres weniger Tiefe benötigt. Beginne nach Art, dann beurteile Redundanz für jede zusätzliche Tiefe: ~5 m für Drosophila, ~20 m für Mensch/Maus, angepasst nach QC-Metriken.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die RDD-Methode zur Erkennung von RNA-assoziierten Chromatin-DNA-Interaktionen. Der Arbeitsablauf beginnt mit der biochemischen Anreicherung von RNA-Chromatin-Komplexen mittels biotinylierter Sonden, gefolgt von einer Proximity-Ligation, um räumlich benachbarte DNA-Fragmente zu verknüpfen. Nach dem Aufbau von Sequenzbibliotheken wird eine Hochdurchsatz-Sequenzierung durchgeführt.

Die bioinformatische Analyse von RDD-Daten wird durch die ChIA-PIPE-Plattform¹³ optimiert. Wichtige Schritte in dieser analytischen Pipeline umfassen: das Trimmen von Sequenzierungslinkern aus Rohlesungen, das Abbilden von gepaarten End-Lesungen auf das Referenzgenom, das Filtern für eindeutig abgebildete Lesepaare, das Entfernen von PCR-Duplikaten und die Zuweisung von Interaktionen an gezielte RNA-Stellen basierend auf Probekoordinaten. Typischerweise werden etwa 50 % der sequenzierten Reads nach Linker- und Qualitätsfilterung erfolgreich erhalten. Gültige Interaktionsereignisse wurden dann aggregiert, um lokusspezifische Kontaktkarten zu erzeugen, die detaillierte Profile der RNA-geführten Chromatinarchitektur lieferten. Für RDD-Daten implementierten wir drei ChIA-PIPE-Anpassungen: Die RDD-Linkersequenz ("ACGCGATATCTTATCTCTGACT") wurde anstelle des Standard-ChIA-PET-Linkers ("ACGCGATGGCTACTCTGACT") verwendet; Loop-Clustering wurde mit einer verkürzten PET-Erweiterung von 50 bp zusätzlich zum Standard-Wert von 500 bp durchgeführt, um die Positionsgenauigkeit der RNA-Interaktionsstellen zu erhöhen; und die RNA-Anreicherungsabdeckung wurde mit deepTools (bamCoverage v3.5.1) unter Verwendung einer Bin-Größe von 1 bp berechnet. Diese Modifikationen – Linker-Konfiguration, reduzierte PET-Erweiterung für feinere Clusterbildung und hochauflösende, abdeckungsangepasste ChIA-PIPE für die RDD-Bibliotheken.

Abbildung 4 zeigt repräsentative RDD-Ergebnisse für zwei nicht-kodierende RNAs: roX2¹⁴ (Abbildung 4A,C; grün), eine Dosierungskompensationskomplex-RNA, die an der Regulation der X-Chromosomenstruktur und Genexpression bei Drosophila beteiligt ist, und 7SK¹⁵ (Abbildung 4B,D; violett), einer hochkonservierten kleinen Kern-RNA, die die Transkriptionsverlängerung durch Regulation der P-TEFb-Aktivität in Metazoen moduliert. RNA-Bindung und durch RDD detektierte Chromatin-Interaktionen werden zusammen mit RNAPII ChIA-PET-Daten (blaue Bögen) visualisiert, was die strukturelle Beziehung zwischen RNA-assoziierten Schleifen und wichtigen regulatorischen Elementen wie Promotoren (P), Enhancern (E) und Transkriptionsstart- oder -endstellen (TSS/TES) hervorhebt. Deutliche Interaktionsspitzen in den aggregierten Daten unterstützen ein Modell, in dem sowohl roX2 als auch 7SK kritische Enhancer-Promotor- oder Langstreckenchromatinkontakte vermitteln.

Eine multidimensionale Analyse wird durch die Integration von RDD-verankerten Interaktionen mit Hi-C-genomweiten Chromatin-Konformationskarten (rote Heatmaps im unteren Panel) und epigenomischen Markierungen (H3K27ac, H3K27me3), der entstehenden Transkription (RNA-seq) und RNAPII ChIA-PET-Daten (Abbildung 4C,D) erreicht. In diesen Regionen sind topologisch assoziierende Domänen (TADs) deutlich sichtbar, wobei RNA-geführte Chromatinschleifen oft an TAD-Grenzen oder über mehrere TADs liegen. Zusätzliche Annotation mit Histonmodifikations- und Transkriptionsdaten ermöglicht die Unterscheidung zwischen aktiven und inaktiven Chromatinregionen. Wichtige RNA-zentrierte regulatorische Hubs sind in der Abbildung eingekreist.

Für verschiedene ncRNAs treten unterschiedliche Muster auf. roX2 zeichnet sich durch Bindung an TES-Regionen und Schleifen an TSSs aus, wobei häufig an TAD-Grenzen lokalisiert und Langstreckenkontakte entstehen, die mehrere TADs überqueren können. Im Gegensatz dazu bindet 7SK überwiegend an Enhancer und bildet kurzreichweitige Schleifen mit benachbarten Promotoren, meist ohne die TAD-Grenzen zu durchqueren.

Zusammenfassend bestätigen diese Ergebnisse, dass RDD eine zuverlässige und hochauflösende Methode zur Analyse RNA-spezifischer 3D-Chromatinorganisation ist. Dieser Ansatz ermöglicht eine direkte Untersuchung der räumlichen Rolle regulatorischer RNAs in der Genomarchitektur und Genexpression in unterschiedlichen biologischen Kontexten.

Abbildung 1: Schaltplan des RDD-Bibliotheksgenerierungsworkflows. Die zentralen Workflow-Schritte zur RDD-Bibliotheksgenerierung werden in der Reihenfolge dargestellt und von entsprechenden schematischen Illustrationen begleitet. Das Verfahren beginnt mit Dual-Crosslinking und Chromatin-Tagmentation, gefolgt von der Hybridisierung mit einer biotinmodifizierten RNA-Sonde und der Immobilisierung mittels Streptavidin. Weitere Schritte umfassen A-Tailing, Proximitätsligation mit biotinmodifizierten Linkern und Bibliotheksaufbau. Nach der DNA-Ligation werden Reinigung, Tn5-vermittelte Fragmentierung, Biotinanreicherung und Bibliotheksamplifikation durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Repräsentative Mikroskopiebilder von Drosophila S2-Zellen , die visuelle Qualitätskontrollkriterien für Zelllyse und Kernpermeabilisierung demonstrieren. (A) Eine erfolgreiche Zelllyse ist durch die Permeabilisierung der Plasmamembran und zytoplasmatische Freisetzung gekennzeichnet, wodurch die Kerne gut sichtbar werden. (B) Eine erfolgreiche Permeabilisierung der Kerne zeigt sich durch Zellschwellung, partielle Ablösung der Plasmamembran und intakte, deutlich sichtbare Kerne. Skala = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Elektropherogrammanalyse von Chromatinpräparaten. Screenshot eines Kapillarelektrophorese-Systems, das verschiedene Chromatinproben profiliert. (A) Zeigt fragmentiertes Chromatin (Sonikation) mit einer Größe von etwa 1000 bis 3000 bp, was auf eine erfolgreiche Fragmentierung hinweist. (B) Zeigt Chromatin, das mit RNA assoziiert ist (RNA-assoziiert + ungebundene Sonden), mit einem kleineren Peak, der ungebundene Sonden darstellt, wie durch den Pfeil angezeigt. (C) Zeigt RNA-assoziiertes Chromatin, das ebenfalls einen Konzentrationsbereich von 1000 bis 3000 bp aufweist, was RNA-Protein-Komplexe widerspiegelt. (D) Zeigt Chromatin mit Tn5 markiert, was einen Bereich zeigt, der auf die Tagmentationseffizienz hinweist. (E) Zeigt die Fragmentgrößenverteilung der Sequenzierungsbibliothek nach der Amplifikation, die etwa 180–1000 bp umfasst. (F) Zeigt die Fragmentgrößenverteilung der Sequenzierungsbibliothek nach der Größenauswahl, wobei Fragmente überwiegend im Bereich von ~250–600 bp angereichert sind. Die RFU-Werte (relative Fluoreszenzeinheiten) werden für jede Probe angegeben und zeigen eine effektive Quantifizierung der Chromatinintegrität und -größe. Die violetten Gipfel stehen für den Marker. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von RDD für ncRNA-assoziierte Chromatin-Interaktionen. (A-B) Zeigt die genomischen Positionen der ncRNA roX2 (grün) und 7SK (violett) Bindung sowie die entsprechenden entfernten Chromatin-Interaktionsschleifen an. Daten von RNAPII ChIA-PET (blau) zeigen eine klare regulatorische Beziehung zwischen diesen ncRNAs und Genexpression, wobei Spitzen auf die Interaktionsstärke hinweisen. Abkürzungen: TSS = Transkriptionsstartstelle; TES = Transkriptions-Endstelle; P = Promotor; E = Verstärker. (C-D) Bietet einen höherdimensionalen Überblick über die Beziehung zwischen ncRNA roX2- und 7SK-bezogenen Chromatinschleifen und TADs (rot) sowie die unterschiedlichen aktiven und inaktiven Chromatinzustände und Genexpressionsniveaus. Kreise markieren Bereiche mit bedeutenden Wechselwirkungen zwischen TADs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: RDD-Reaktionsreagenzien. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: RDD-Pufferzusammensetzungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Kritische Schritte in der Methode
Die Schätzung der Menge der RNA-Sonden und der entsprechenden RNA-Konzentrationen im Chromatin ist entscheidend. Überschüssige Sonden können dazu führen, dass ungebundene Sonden während des Immobilisierungsschritts Streptavidinstellen besetzen, was die beabsichtigte Einfangung der Ziel-RNA-Interaktionen behindern kann. Außerdem verbraucht zu viel Streptavidin Material und erfordert mehr denaturiertes IBP für eine effektive Blockierung leerstehender Flächen. Unzureichende Blockierung kann die Effizienz der nachfolgenden Proximity-Ligation negativ beeinflussen, insbesondere da der Proximity-Ligationslinker auch Biotin-Modifikationen aufweist. Wenn das Blockieren nicht ausreichend durchgeführt wird, können Teile des Linkers direkt an die Streptavidinperlen binden, was die Ergebnisse erschwert. Außerdem muss das Verhältnis von Linker zu Chromatin sorgfältig abgeschätzt werden – zu viel Linker kann dazu führen, dass beide Enden der Chromatin-DNA markiert werden, was die effektive Proximity-Ligation hemmt.

Modifikationen der Methode
In dieser Studie illustrieren wir die RDD-Methode mit Drosophila S2-Zellen und roX2 ncRNA als Beispiel. Die Reagenzienvolumina müssen basierend auf Zelltyp und ncRNA-Expressionsniveaus angepasst werden; ist die ncRNA-Expression hoch, kann die Zellmenge reduziert oder die Konzentration der RNA-Sonde erhöht werden, und umgekehrt. Obwohl dieses Protokoll Chromatin auf Perlen immobilisiert, besteht ein alternativer Ansatz darin, eine In-situ-Proximitätsligierung gefolgt von einer Anreicherung mit RNA-Sonden durchzuführen.

Spezifität, Kontrollen und Qualitätskontrolle
Wir beschrieben und validierten zuvor RDD und führten parallele RDDs auf mehreren RNAs durch, wobei wir eine starke Spezifität zeigten; Leser können sich auf das vorherige Werk ^4,16 beziehen. RDD erfordert probeabhängige, locusspezifische Anreicherung, die reproduzierbar und, wo möglich, orthogonal validiert ist. Echte Interaktionen erfüllen drei Kriterien: Anreicherung an probezielten Loci gegenüber nahegelegenen nicht-bindenden Regionen; Probeabhängigkeit (bei negativen Kontrollen abwesend oder deutlich reduziert); und Reproduzierbarkeit über biologische Replikate hinweg sowie unabhängige Validierung (z. B. RT-qPCR). Antisense-Sonden wurden mit Stellaris entworfen, von BLAST/BLAT getestet, um Off-Targets zu entfernen, mit 3'-Biotin bestellt und durch RT und qPCR validiert (einschließlich DNA-Kontaminationstests und Site- vs. Nicht-Site-Anreicherung). Wir empfehlen drei Kontrolluntersuchungen – No-Probe, Scramble/Non-Targeting und Non-Relationed-RNA- oder Non-Binding-Region Sonden – und bewerten die Spezifität durch Vergleich der qPCR- oder Sequenzierungsabdeckung über Ziel- und Kontrollproben, wobei Faltenanreicherung und Hintergrund gemeldet werden. Bei RNAs mit geringer Häufigkeit erhöhen Sie die Sondendichte (innerhalb von Off-Target-Bedingungen), erhöhen Sie die Sequenzierungstiefe und führen orthogonale Validierungen durch.

Fehlerbehebung der Methode
Wenn die erfassten RNA-Chromatin-Interaktionen bemerkenswert gering sind, muss die Effizienz der Proximitätsligation möglicherweise durch Anpassungen von Linker- und Chromatinmengen optimiert werden. Zusätzlich wurden hohe Spitzen ungebundener Sonden durch automatische Kapillarelektropherogramme beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass zu viele Sonden hinzugefügt wurden, was durch Reduzierung der verwendeten Menge behoben werden kann.

Einschränkungen der Methode
Ein wesentlicher Vorteil der RDD-Methode ist ihre Effizienz bei der Erfassung spezifischer RNA-assoziierter Chromatinwechselwirkungen, was bedeutet, dass jedes Experiment jeweils nur auf eine bestimmte RNA konzentrieren kann. Außerdem ist die Proximitätsligation darauf ausgelegt, paarweise Interaktionen zu erkennen, sodass Interaktionen an mehreren Stellen nicht gleichzeitig bewertet werden können.

Bedeutung der Methode
Die RDD-Methode enthüllt nicht nur RNA-Bindungsstellen, sondern erläutert auch die Interaktionsbeziehungen zwischen diesen Stellen, was unser Verständnis der Chromatinarchitektur verbessert.

Praktische Anwendungen und zukünftiges Potenzial von RDD
RDD eignet sich für verschiedene chromatinassoziierte RNAs, darunter endogene Wirts-RNAs und exogene RNAs von Viren oder anderen Mikroorganismen, was ihre breite Anwendbarkeit in verschiedenen Forschungsfeldern unterstreicht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G
1 M Magnesiumacetat	Sigma-Aldrich	63052-100ML
1 M Tris-HCl pH 7,0	Invitrogen	AM9851
1 M Tris-HCl pH 8,0	Invitrogen	AM9856
1,5-mL-Röhren	Eppendorf	30108051
10 mM dATP	Invitrogen	18252015
10 % SDS (Wt/vol)	Invitrogen	AM9822
10&Times; A-Tailing-Puffer	NEB	B7002S
10&Times; End-Reparaturpuffer	NEB	B6002S
10&Times; T4-DNA-Ligasepuffer	NEB	B0202S
10&Times; TBE-Puffer	Invitrogen	AM9863
14-mL Rundboden-Reagenzgläser	Corning	352057
2& Male; PCR-Mastermix	NEB	M0541
20& Mal; SSC-Puffer	Invitrogen	AM9770
200-μ L-PCR-Röhren	Sangon Biotech	F611541-0010
250-mL quadratische PET-Aufbewahrungsflaschen	Corning	431531
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250-100mL	! VORSICHT β-ME ist toxisch; Benutze es immer in einer Abzugsgube.
2-mL-Röhren	Eppendorf	22431048
3 M Natriumacetat pH 5,5	Invitrogen	AM9740
5 M NaCl	Invitrogen	AM9759
5 M Kaliumacetat	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
500-mL quadratische PET-Aufbewahrungsflaschen	Corning	431532
Analytisches Gleichgewicht	Sartorius	BP211D
Automatisierter Zellzähler	Gegenstern	IC1000
Automatisches Kapillarelektrophoresesystem	Bioptik	C100100
Biotinylierte Sonden	GENEWIZ		Siehe Tabelle 1
Blockpulver	Invitrogen	T2015
Brückenlink-Oligos	GENEWIZ		Siehe Tabelle 1
CO2 Inkubator	Thermowissenschaftlich	51033549
Dimethylsulfoxidid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100mL
DNA-Bibliotheksvorbereitungskit V2 für Illumina	Vazyme	TD501
DNA-Reinigungskit	Zymo	D4013
Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (1& mal;)	Gibco	14190250
EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail	Roche	11836170001
EGS (Ethylenglykol bis[succiniMidylsuccinat])	Thermowissenschaftlich	21565
Elutionspuffer	Qiagen	19086
Reiner Ethylalkohol	Sigma-Aldrich	E7023-500mL
Formaldehydlösung	Sigma-Aldrich	47608-250mL-F	! VORSICHT: Formaldehyd ist giftig; Benutze es immer in einer Abzugsgube.
Formamid	Invitrogen	AM9342
Gelbildgebungssystem	Tanon	3500R
Glycin	Invitrogen	50046-1kg
Glykogen mit blauem Farbstoff	Invitrogen	AM9516
Hochempfindliche Patrone	Bioptik	C105105
Hochdichte Phasensperrrohre (1,5 mL)	Qiagen	129046
Hochempfindliches dsDNA-fluorometrisches Testkit	Invitrogen	Q32851
Index-Kit V2 für Illumina	Vazyme	TD202
Iodoacetyl-PEG2-Biotin (IPB)	Thermowissenschaftlich	21334
Isopropylalkohol	Sigma-Aldrich	I9030	! VORSICHT: Isopropylalkohol ist giftig; Benutze es immer in einer Abzugsgube.
Kilo-Basispatrone	Bioptik	C105106
Klenow-Fragment (3' → 5' exo-)	NEB	M0212L
Magnetische Perlen	Beckman	A63881
Magnetisches Trennrack  für 15-mL-Röhre	Invitrogen	12301D
Magnetisches Trennrack  für 2-mL-Röhre	Invitrogen	12321D
Magnetisches Trenngitter für PCR-Röhre	NEB	S1515S
Mikrobiologischer Inkubator	Thermowissenschaftlich	IMH180
Mikroskop	Nikon	Eclipse TS2
Mixer	ELMI	RM-2L
N,N-Dimethylformamid (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	! VORSICHT: DMF ist toxisch; Benutze es immer in einer Abzugsgube.
Nicht-gekühlte Mikrozentrifuge	Eppendorf	5405000204
Nukleasefreies Wasser (nicht DEPC-behandelt, 1000 ml)	Invitrogen	AM9932
Nukleasefreies Wasser (nicht DEPC-behandelt, 50 ml)	Invitrogen	AM9937
Nukleinsäurequantor	Invitrogen	Q33226
Orbitalshaker	Kristall	SYC-2102
Phenol: Chloroform: IAA	Solarbio	P1012-100mL
Proteinase-K-Lösung	Invitrogen	AM2548
Gekühlte Zentrifuge	Eppendorf	22628180
Gekühlter Brutkasten	Thermowissenschaftlich	IMP180
Gekühlte Mikrozentrifuge	Eppendorf	5404F1621754
Kühlschrank	Haier	DW-25L262
RNase-Inhibitor	Ambion	AM2696
RNase-freie 15-mL-Röhren	Invitrogen	AM12500
RNase-freie 50-mL-Röhren	Invitrogen	AM12502
Sonicator	Sonics & Materialien	VCX130
Streptavidin-beschichtete Magnetperlen C1	Invitrogen	65001
Streptavidin-beschichtete magnetische Perlen M-280	Invitrogen	11205D
T4-DNA-Ligase	NEB	M0202S
T4-DNA-Polymerase	NEB	M0203S
TE-Puffer pH 8,0	Invitrogen	AM9849
Thermischer Zykler	Bio-Rad	1851148
Thermomixer	Eppendorf	5382000023
Triton X-100	Acros Organics	327371000-100mL
Ultra-Niedrigtemperatur-Gefrierschrank	Thermowissenschaftlich	995
Vakuumkonzentrator	TOMY	MV-100