Fortgeschrittene Anwendung der Kapillarelektrophorese bei der hochauflösenden monoklonalen Proteindetektion im Serum

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die hochauflösende Serumproteinanalyse mittels Kapillarelektrophorese. Unter einem Hochspannungs-elektrischen Feld wandern Serumproteine durch eine Kapillare, die auf Ladung und elektrophoretischer Mobilität basiert. Das resultierende Elektropherogramm ermöglicht die Detektion, Lokalisierung und Quantifizierung monoklonaler Proteinspitzen.

Zusammenfassung

Monoklonales Immunglobulin, auch bekannt als M-Protein oder Paraprotein, wird durch klonale Proliferation von Plasmazellen oder B-Lymphozyten produziert und dient als wichtiger Biomarker für monoklonale Gammopathien. Eine genaue Detektion und Quantifizierung des Serum-M-Proteins ist für die frühzeitige Krankheitsdiagnose, klinische Klassifikation und therapeutische Überwachung unerlässlich. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode mit Kapillarelektrophorese (CE) zur hochauflösenden Trennung von Serumproteinen. Proteine werden in einem alkalischen Puffer unter Hochspannungselektrophorese getrennt und durch ultraviolette Absorption detektiert, wodurch Elektropherogramme erzeugt werden, die eine klare Visualisierung und Quantifizierung abnormer monoklonaler Proteinspitzen ermöglichen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden bietet CE eine verbesserte Auflösung des Beta-Bereichs und ermöglicht automatisierte, schnelle Analysen mit minimalen Probenhandhabungsanforderungen. Fünf repräsentative Elektropherogramme zeigten die Migration von M-Proteinen in den Regionen β1, β2 und γ, mit M-Proteinwerten von 0, 44,1 % (45,8 g/L), 10,5 % (8,6 g/L), 35,5 % (28,4 g/L) und dualen Spitzen von 41,3 % (46,0 g/L) und 12,4 % (13,8 g/L). In einer retrospektiven Studie von 700 klinischen Serumproben erzielte CE eine positive Nachweisrate von 51,86 %, verglichen mit 52,86 % bei der Immunfixierungselektrophorese (IFE). Mit IFE als Referenzmethode zeigte CE eine Sensitivität von 92,70 % und eine Spezifität von 93,94 %. Diese Ergebnisse bestätigten CE als schnellen, automatisierten Ansatz zur Screening und Quantifizierung von Serum-M-Protein in routinemäßigen klinischen Laboren.

Einleitung

M-Protein-bezogene Erkrankungen zeichnen sich durch das Vorhandensein eines monoklonalen Immunglobulins (M-Protein) im Serum und/oder Urin aus. Diese Proteine werden typischerweise von klonalen Plasmazellen oder B-Lymphozyten ausgeschieden und sind hauptsächlich mit bösartigen Plasmazelldyskrasien oder gutartigen monoklonalen Gammopathien ^1,2 assoziiert. Das klinische Spektrum dieser Erkrankungen umfasst monoklonale Gammopathie von unbestimmter Bedeutung (MGUS), solitäres Plasmazytom (SPC), schwelendes multiples Myelom (SMM), multiples Myelom (MM), Plasmazellleukämie (PCL), Waldenström-Makroglobulinemie (WM), systemische leichtkettige Amyloidose (AL), B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom (B-NHL) und andere B-Zell-lymphoproliferative Erkrankungen (LPD)³. Eine retrospektive Studie in Spanien berichtete, dass MGUS unter diesen Erkrankungen am häufigsten vorkommt und 54,1 % der Fälle ausmacht, gefolgt von MM (31,3 %) und anderen malignen Gammopathien (14,6 %)⁴. Es ist auch wichtig zu beachten, dass das M-Protein auch als Reaktion auf bestimmte nicht-neoplastische Erkrankungen wie das nephrotische Syndrom⁵ produziert werden kann.

Die M-Protein-Tests spielen eine entscheidende Rolle bei der Diagnose und Überwachung von M-protein-bezogenen Störungen⁶. Die frühe Diagnose bleibt jedoch eine klinische Herausforderung, da Patienten mit MM oft in den Anfangsstadien asymptomatisch sind, was zu einer verzögerten Diagnose in einer relativ fortgeschrittenen Krankheitsphase führt. Etwa 1 % der Patienten mit MGUS entwickeln jährlich eine bösartige Erkrankung – meist bis MM, WM oder SPC⁷. Obwohl fast alle MM-Fälle angenommen werden, dass sie sich aus MGUS entwickeln, haben weniger als 10 % der MM-Patienten eine dokumentierte Vorgeschichte einer MGUS-Diagnose. Daher kann die rechtzeitige Identifizierung des M-Proteins im Serum und/oder Urin wertvolle Hinweise für eine frühzeitige Diagnose dieser Erkrankungen liefern, was entscheidend für die Verbesserung des Überlebens und der Prognose des Patienten ist. Forschungen zeigen, dass Patienten mit MGUS, die durch aktives Screening identifiziert wurden, weniger Komplikationen aufweisen als zufällig diagnostizierte^{Patienten 8}. Während der therapeutischen Überwachung sind Informationen über den Isotyp und das elektrophoretische Migrationsmuster des M-Proteins unerlässlich, um zwischen dem Rückfall des ursprünglichen monoklonalen Proteins und dem Entstehen oligoklonaler Bänder oder eines sekundären reaktiven M-Proteins⁹ zu unterscheiden. Das Auftreten eines neuen M-Proteins, das oft nach einer autologen Stammzelltransplantation beobachtet wird, gilt für die meisten Patienten allgemein als günstiger prognostischer Indikator¹⁰. Im Einklang mit dieser Beobachtung zeigen vergleichende Überlebensdaten, dass Patienten, die ein sekundäres M-Protein entwickeln, eine mittlere Gesamtüberlebensrate von 115,3 Monaten aufweisen, im Gegensatz zu 31,0 Monaten bei denen, die nicht¹¹ haben.

Die Proteinelektrophorese ist eine hochentwickelte analytische Technik. Es stehen verschiedene Methoden zur Detektion des Serum-M-Proteins zur Verfügung, darunter Serumproteinelektrophorese (SPE), IFE, Kapillarelektrophorese-Immuntypisierung (IT), Free Light Chain (FLC) Assay, schwere und leichte Ketten (HLC) Detektion sowie Massenspektrometrie (MS). Jeder Ansatz bietet unterschiedliche Vorteile und hat zugleich inhärente Einschränkungen. SPE lässt sich weiter in Agarose-Gelelektrophorese (AGE) und CE unterteilen. AGE, das ein agarosebasiertes Medium verwendet, ist eine einfache und kosteneffiziente Methode, die sich für eine schnelle Trennung und Analyse eignet. Allerdings ist sie durch eine relativ geringe Empfindlichkeit begrenzt, mit einer typischen Nachweisgrenze von 0,3–0,5 g/L¹², was dazu führen kann, dass M-Proteine mit geringem Volumen oder niedriger Konzentration nicht erkannt werden. Darüber hinaus ist die Technik anfällig für Bandverbiegung und Verformung, was die Reproduzierbarkeit beeinträchtigt.

IFE gilt weithin als Goldstandard für die M-Proteintypisierung. Nach der anfänglichen Elektrophorese werden spezifische Antikörper (Anti-IgG, Anti-IgA, Anti-IgM, κ, λ) angewendet, um immunpräzipitierte Bänder zu bilden, was die Identifizierung des Immunglobulintyps und des Leichtketten-Subtyps ermöglicht. IFE kann M-Protein in Konzentrationen von nur 0,05–0,15 g/L nachweisen, was eine Sensitivität von mehr als 10-mal der von SPE ermöglicht. Trotz dieses Vorteils ist für bestimmte Proben, wie solche mit M-Protein-Polymeren, eine spezialisierte Vorbehandlung erforderlich, um die Dissoziation mit β-Mercaptoethanol sicherzustellen. Unzureichende Behandlung kann zu irreführenden Ergebnissen führen. Zusätzlich können Patienten, die neuartige Kombinationstherapien erhalten (z. B. Behandlungen mit Daratumumab, Bortezomib, Dexamethason und Thalidomid/Lenalidomid), zu falsch-positiven IFE-Befunden¹³ führen. Eine wesentliche Einschränkung von IFE ist, dass sie nur qualitative Ergebnisse liefert, da sie M-Proteinwerte nicht quantifizieren kann und daher für die Überwachung der therapeutischen Wirksamkeit^ungeeignet ist. Bei behandelten Patienten können die IFE-Ergebnisse auch dann positiv bleiben, wenn die M-Proteinkonzentration bei erfolgreicher Behandlung abnimmt.

Im Gegensatz dazu verwendet die IT Kapillarpuffer als Trennmedium, was eine höhere Auflösung als herkömmliche IFE bietet. Dennoch erfordert der Prozess aufwendige Vorbehandlungsschritte der Proben, wie das Mischen von Antiserum, was den gesamten Detektionsablauf verlängert. FLCs, das sind Immunglobulin-leichte Ketten (κ und λ), die nicht an schwere Ketten gebunden sind, werden im Serum direkt mit Antikörpern quantifiziert, die auf ihre "verborgenen Zonen"-Epitope abzielen, was eine hohe Sensitivität für die Erkennung leichtkettenbezogener Erkrankungen mit einer Nachweisgrenze von nur 10–30 mg/L ermöglicht. Im MM korrelieren erhöhte Serum-FLC-Spiegel mit der Tumorlast und ermöglichen eine frühere Einschätzung der Behandlungsansprache, da ihre Halbwertszeit im Vergleich zu intakten Immunglobulinen¹⁵ kürzer ist. Seine klinische Anwendung sollte jedoch mit anderen diagnostischen Methoden, wie der Elektrophorese, kombiniert werden, um andere Erkrankungen auszuschließen und eine umfassende Untersuchung sicherzustellen. Beispielsweise kann eine beeinträchtigte Nierenfunktion zu falsch erhöhten Lichtkettenwerten führen. HLC-Assays stellen einen weiteren quantitativen Ansatz dar, der Antikörper verwendet, die Epitope sowohl auf die konstante als auch auf die leichte Kette von Immunglobulin anvisieren. Dieses Design ermöglicht die separate Quantifizierung isotypspezifischer Immunglobulinpaarungen (z. B. IgGκ und IgGλ), und das abgeleitete HLC-Verhältnis dient als sensibler Indikator für Klonalität. Die Ergebnisse können jedoch von den Hintergrund-polyklonalen Immunglobulinspiegeln beeinflusst werden, und die Methode ist bei der Analyse komplexer M-Protein-Varianten möglicherweise weniger zuverlässig. MS bietet eine außergewöhnliche Sensitivität und ermöglicht eine tiefgehende proteomische Charakterisierung von M-Proteinen. Seine Anwendung wird jedoch durch hohe Gerätekosten, langwierige Analyseverfahren und spezialisierte Fachkenntnisse für die Dateninterpretation eingeschränkt.

CE ist eine leistungsstarke analytische Trenntechnik, die elastische Kapillaren aus Siliziumdioxid als Trennkanäle und ein hochvoltiges direktes elektrisches Feld als Antriebskraft verwendet. Sie ermöglicht eine hochauflösende Trennung, indem sie Unterschiede in der elektrophoretischen Mobilität und/oder im Partitionierungsverhalten der Zielanalyte ausnutzt. Seit ihrer Einführung hat sich die Technologie von Einkapillarkonfigurationen zu Hochdurchsatz-Kapillararrays und miniaturisierten mikrofluidischen Geräten weiterentwickelt. Seine Anwendungen decken nun verschiedene Bereiche ab, darunter pharmazeutische Analyse, biomedizinische und klinische Diagnostik, Lebensmittelsicherheitstests und biotherapeutische Charakterisierung^16,17. CE wird zunehmend als wichtiges Werkzeug für das Screening und die quantitative Analyse von M-Proteinen anerkannt. Es bestimmt den Prozentsatz von M-Protein im Verhältnis zum Gesamtprotein, was dann mit der Gesamtproteinkonzentration multipliziert werden kann, um absolute M-Proteinwerte zu berechnen. Am auffälligsten ist der geringe Probenbedarf besonders geeignet für die Analyse von wertvollen oder volumenbegrenzten Proben.

CE bietet drei wichtige technische Vorteile. Erstens ermöglicht seine hohe analytische Sensitivität (0,1–0,5 g/L) den effektiven Nachweis von M-Proteinen mit niedriger Konzentration, wodurch das Risiko von Fehldiagnosen bei Bedingungen wie MGUS und leichtkettenartigen Erkrankungen reduziert wird. Zweitens eliminiert der vollautomatisierte Workflow die subjektiven Interpretationsfehler, die traditionellen gelbasierten Färbungsmethoden innewohnen. Schließlich wird die Prüfzeit deutlich auf 15–20 Minuten reduziert, deutlich kürzer als die 60–90 Minuten, die für konventionelle Elektrophorese erforderlich sind. Als zentrale analytische Technik zwischen Zonenelektrophorese und Flüssigkeitschromatographie führt CE eine elektrophoretische Trennung in einer freien Lösung durch. Unter einem angelegten elektrischen Feld werden Proteinmoleküle hauptsächlich durch elektroosmotischen Fluss innerhalb eines alkalischen Puffers bei einem spezifischen pH-Wert getrennt. Nach der Verdünnung mit einem dedizierten Puffer werden Proben unter hoher Spannung an die Kapillaranode injiziert, um eine schnelle, effiziente Proteintrennung einzuleiten, und dann an der Kathode bei 200 nm detektiert. Nach jedem analytischen Zyklus werden die Kapillaren automatisiert gereinigt und die Pufferauffüllung durchgeführt, um nachfolgende Proben zu verarbeiten. Die Proteintrennung erfolgt in folgender Reihenfolge: Gamma-Globulin, Beta-2-Globulin, Beta-1-Globulin, Alpha-2-Globulin, Alpha-1-Globulin und Albumin, was die Identifikation von Auffälligkeiten in einem oder mehreren Serumproteinfraktionen ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass CE eine verbesserte Auflösung innerhalb der Beta-Region bietet, indem sie sie deutlich in Beta-1- und Beta-2-Globulinkomponenten unterteilt und so detailliertere^{klinische Informationen} liefert. Angetrieben von der Integration künstlicher Intelligenz und fortlaufenden Fortschritten in der Multi-Parameter-Erkennung steht CE kurz davor, sich zu einer Erstlinien-Screening-Methode für die Erkennung von M-Proteinen zu entwickeln. Daher beschreibt dieses Protokoll die Verwendung der kapillaren Elektrophorese für den schnellen Nachweis, die Lokalisierung und quantitative Analyse monoklonaler serumhaltiger Proteine in klinischen Proben.

Protokoll

Das Studienprotokoll wurde vom Ethikausschuss des Guangdong Provincial People's Hospital überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer: KY2025-176-01). Alle Teilnehmer gaben vor der Probenentnahme eine schriftliche informierte Einwilligung ein.

1. Materialvorbereitung

HINWEIS: Das Reagenzset sollte bei 2–30 °C gelagert werden und eine Haltbarkeit von bis zu 3 Jahren haben.

1. Lagern Sie den laufenden Puffer bei 2–8 °C und lassen Sie ihn vor der Nutzung auf Raumtemperatur erreichen. Nach dem Öffnen bleibt die Lösung bis zu 3 Monate stabil. Verwenden Sie diese Lösung als laufenden Puffer für die Trennung von Serumproteinen in der Kapillarelektrophorese.
   HINWEIS: Der laufende Puffer ist einsatzbereit mit einem pH-Wert von 9,9 ± 0,5. Das Reagenz-Set enthält drei 700-ml-Flaschen alkalinen Puffers, die als laufender Puffer für die Trennung von Serumproteinen dienen.
2. Verdünnen Sie 75 ml konzentriertes Spüllösungsmaterial vor der Anwendung auf 750 ml mit deionisiertem Wasser. Die verdünnte Spüllösung bei Zimmertemperatur aufbewahren. Nach dem Öffnen bleibt die Lösung bis zu 3 Monate stabil. Verwenden Sie diese Lösung, um Kapillarröhrchen nach der Elektrophorese zu reinigen.
   HINWEIS: Die Spüllösung enthält Natriumhydroxid und wird zur Kapillarreinigung verwendet.
   VORSICHT: Die Spüllösung enthält Natriumhydroxid, eine korrosive Substanz, die schwere Verbrennungen verursachen kann. Bei Blickkontakt spülen Sie sofort mit ausreichend Wasser ab und suchen Sie medizinische Hilfe auf. Wenn Haut oder Kleidung kontaminiert wird, entfernen Sie die kontaminierten Kleidungsstücke sofort. Tragen Sie immer geeignete Schutzkleidung und verwenden Sie Augen- und Gesichtsschutz.
3. Bewahren Sie die Reagenzbecher in der originalen versiegelten Verpackung bei 2–30 °C an einem sauberen und trockenen Ort auf. Verwenden Sie die Reagenzienbecher zur Probenverdünnung an vollautomatischen Instrumenten.
4. Lagern Sie den versiegelten Filter an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur (15–30 °C). Verwenden Sie Einwegfilter, um Pufferlösungen und deionisiertes Wasser zu filtern.
5. Die Kapillarreinigungslösung (siehe Materialtabelle) bei 2–8 °C aufbewahren und Niederschlag vermeiden.
   HINWEIS: Jede Flasche Kapillarreinigungslösungskonzentrat (25 ml/Flasche) enthält proteolytische Enzyme, Tensiden und andere Zusatzstoffe. Zusätze sind bei der Anwendungskonzentration ungefährlich und für optimale Leistung notwendig. Die Lösung verhindert Kapillarblockade und erhält eine optimale Leistung.
6. Verwenden Sie gefiltertes deionisiertes Wasser mit einer Porengröße ≤ 0,45 μm, einer Leitfähigkeit unter 3 μS/cm und einem Widerstand von über 0,33 MΩ·cm. Täglich das Wasser wechseln, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie dieses Wasser, um die Kapillarröhren des Elektrophorese-Analysators zu reinigen.
7. Bereiten Sie eine Natriumhypochloritlösung mit 2–3 % verfügbarem Chlor vor. Verwenden Sie diese Lösung zur Reinigung der Probeproben, um adsorbierte Proteine zu entfernen. Lagern Sie die funktionierende chlorierte Lösung bei Raumtemperatur in einem geschlossenen Behälter. Die Lösung bleibt bis zu 3 Monate stabil. Lagern Sie nicht in der Nähe von Sonnenlicht, Hitze, Zündquellen, Säuren oder Ammoniak.

2. Probenentnahme

1. Stellen Sie sicher, dass Patienten mindestens 8–12 Stunden vor der Blutentnahme fasten.
2. Bitten Sie die Patienten, sich 10–15 Minuten im Sitzen oder Rückenliegen auszuruhen, um die Hämodynamik zu stabilisieren.
3. Bereiten Sie folgende Materialien vor: Einweg-Venenblutnadeln, Vakuumblutabnahmeröhrchen (Serumröhrchen), Tourniquet, sterile Wattestäbchen, 75 % Alkohol- oder Iodophor-Desinfektionsmittel, medizinischer Klebeverband und Biohazard-Abfallbehälter.
   HINWEIS: Die mediane Kubitalvene in der Ellbogengrube ist die bevorzugte Einstichstelle.
4. Legen Sie ein Tourniquet 3–5 cm oberhalb der Einstichstelle an, um die Vene ausreichend zu füllen.
5. Desinfizieren Sie die Haut mit 75 % Alkohol oder Iodophor in einem zentrifugalen Spiralmuster von der Mitte nach außen, das einen Bereich von ≥5 cm Durchmesser abdeckt, und lassen Sie das Desinfektionsmittel natürlich an der Luft trocknen, ohne die Stelle erneut zu berühren.
6. Halten Sie die Nadel mit der Schräglage nach oben in einem Winkel von 15–30° zur Haut und durchstoßen Sie die Haut und die Venenwand sanft.
7. Nach Beobachtung des Blutrücklaufs befestigen Sie die Nadel und schließen Sie das Vakuumrohr an. Lassen Sie das Blut das Rohr passiv unter Unterdruck füllen, ohne manuelle Kompression, um eine Hämolyse zu verhindern.
8. Nach der Entnahme wird zunächst das Tourniquet gelöst, dann die Nadel vorsichtig herausgezogen und sofort mit einem sterilen Wattestäbchen für 3–5 Minuten Druck auf die Einstichstelle ausgeübt, um die Hämostase sicherzustellen.
9. Stellen Sie die entnommene Probe bei Raumtemperatur aufrecht und lassen Sie das Blut natürlich gerinnen.

3. Stichprobenqualitätsbewertung

1. Zentrifugiere Serumproben mit 2.095 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Serumproben der Probanden werden streng unter ausreichendem natürlichem Licht vor einem schlichten weißen Hintergrund geprüft.
3. Bewerten Sie die Hämolyse, indem Sie Farbe und Klarheit des Supernatants untersuchen. Bewerten Sie die Proben als nicht hämolysiert, wenn der Supernatant klar und gelb erscheint, während jede rosa oder rote Verfärbung auf eine leichte bis schwere Hämolyse hinweist.
   HINWEIS: Hämolyse kann eine doppelte Alpha-2-Zone erzeugen. Die Beta-2-Fraktion kann bei gealterten oder falsch gelagerten Serumproben abnehmen.
4. Untersuchen Sie auf Fibrinogen-Interferenz, indem Sie auf sichtbare Fibrinstränge, Gerinnsel oder gelatinöse Netzwerke innerhalb des Supernatanten sowie auf unvollständige Phasentrennung, Trübung oder inkonsistente analytische Signale achten.
   HINWEIS: Fibrinogen wandert in der Beta-2-Position (Schulter auf Beta-2 oder überlagert mit der Beta-2-Zone, möglicherweise mit einer Erhöhung dieses Anteils). In einigen Proben (Plasma, nicht vollständig defibriniertes Serum oder Patienten, die eine Antikoagulanzien-Behandlung erhalten) kann Fibrinogen die Analyse beeinträchtigen und zu ungenauen Interpretationen führen, wie etwa dem Verdacht auf ein monoklonales Band oder einem Anstieg der Beta-2-Fraktion.
5. Proben mit Hämolyse, Fibrinogen-Interferenz oder anderen präanalytischen Anomalien ausschließen, sobald sie durch die Analyse festgestellt wurden.
6. Entnehmen Sie eine neue Blutprobe nach standardisierten Phlebotomie- und Verarbeitungsprotokollen, wobei eine angemessene Gerinnungszeit und standardisierte Zentrifugationsparameter sichergestellt werden. Verwenden Sie nur Proben mit zufriedenstellendem Aussehen – klar, frei von Hämolyse, Fibrin, Lipämie oder Kontamination für spätere Tests.
7. Testen Sie die getrennten Serumproben so schnell wie möglich bei Raumtemperatur. Wenn sofortige Tests nicht möglich sind, werden die Proben bis zu 10 Tage bei 2–8 °C und bis zu 30 Tagen bei -20 °C gelagert. Froren und tauen Sie Proben nicht wiederholt ein.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Plasmaproben. Bei der Analyse gealterter Plasmaproben (was nicht empfohlen wird) degradieren labile Komponenten wie das C3-Komplement im Laufe der Zeit, sodass die Beta-2-Zone im Wesentlichen dem Fibrinogen entspricht.
8. Vor dem Test werden die Proben auf Zimmertemperatur restauriert und gründlich vermischt. Stellen Sie sicher, dass die gefrorenen Proben vor der Verwendung vollständig aufgetaut sind.
   HINWEIS: Verwenden Sie unverdünnte Serumproteinproben. Einige gekühlte Seren können viskos oder trüb werden, insbesondere solche, die Cryoglobuline oder Cryogel enthalten. Verwenden Sie Proben, die Polyimmunglobuline enthalten, direkt ohne zusätzliche Vorbehandlung.

4. Betriebsverfahren

1. Schalten Sie den automatischen Kapillarelektrophorese-Analysator (siehe Materialtabelle) und das angeschlossene Computersystem ein. Warte, bis das Instrument vollständig initialisiert ist.
   HINWEIS: Die Kapillarlänge und der Innendurchmesser betragen jeweils 17,5 cm bzw. 25 μm. Die Trennspannung liegt zwischen 8.000 und 10.000 V. Elektrokinetische Injektion wird verwendet, und die Trenntemperatur wird bei etwa 25 °C gehalten. Die gesamte Laufzeit beträgt etwa 10 Minuten pro Probe.
2. Starten Sie die auf dem Computer installierte PHORESIS-Software (siehe Materialtabelle) zur Datenverarbeitung.
3. Über die Softwareoberfläche wählen Sie das Programm PROTEIN (E) 6 aus und setzen Sie dann die laufende Pufferflasche in das Instrument ein.
   HINWEIS: Dieses Programm ist ein werkseitig kalibriertes, voreingestelltes Protokoll, das speziell für die Fraktionierung von Serumproteinen entwickelt wurde. Alle Parameter sind in der PHORESE-Software des Instruments vorkonfiguriert, ohne dass manuelle Änderungen erforderlich sind.
4. Falls nötig, platzieren Sie die Reagensenflasche mit resolubilisierter Reinigungslösung in das Gerät.
5. Einen neuen Reagenzbecher auf die automatische Ladeplattform des Kapillarelektrophorese-Analysators montieren.
6. Installieren Sie eine neue Abfallbox an der Standard-Abfallentsorgungsstelle des Kapillarelektrophorese-Analysators für gebrauchte Reagenzienbecher.
7. Laden Sie die Probenregale durch die Öffnung auf der rechten Seite in den Analysator (maximale Kapazität: 15 Racks).
   HINWEIS: Jedes Rack kann bis zu 8 Probenröhrchen aufnehmen. Der Barcode auf jedem Reagenzglas muss durch die Racköffnung sichtbar sein.
8. Verwenden Sie das Mustergestell Nr. 0 für das Kontrollserum. Verwenden Sie eine Qualitätskontrolle von Drittanbietern, die auf dem kumulativen Mittelwert und dem Variationskoeffizienten basieren, berechnet aus 20 Testdatenpunkten.
9. Nehmen Sie das fertige Probengestell aus dem Entladefach auf der linken Seite. Entferne und entsorge bei Bedarf die Abfallbox mit den benutzten Reagenzbechern.
   VORSICHT: Behandeln Sie gebrauchte Reagenzienbecher mit Vorsicht, da sie biologische Proben enthalten können.
10. Lege die Kapillarreinigungslösung an Position S2 in der Sekundärreagenzkammer. Klicken Sie auf dem Instrumentenbildschirm auf Wartung und Reinigung und wählen Sie dann Capiclean starten.
11. Geben Sie 2–3 % Natriumhypochloritlösung in die Sekundärreagenzkammer (T1-Position). Klicken Sie auf dem Instrumentenbildschirm auf Wartung und Reinigung und wählen Sie Dekontamination beginnen.
    HINWEIS: Der gesamte Kapillarreinigungsprozess läuft automatisch über 45 Minuten.
12. Starte die Reinigungssequenz mindestens einmal pro Woche.

5. Ergebnisanalyse

1. Nach Abschluss jeder Analyse werden Rohdaten vom Instrument zur Verarbeitung an die Software übertragen. Die Software erzeugt ein Elektropherogramm, das auf dem Computerbildschirm angezeigt wird.
2. Analysieren Sie das Elektropherogramm und quantifizieren Sie die relativen Absorptionsintensitäten jedes Proteinbandes bei einer Wellenlänge von 200 nm mithilfe der Software.
   HINWEIS: Basierend auf den Gesamtproteinkonzentrationen, die vom vollautomatischen biochemischen Analysator gemessen werden, berechnet die Software die Konzentration jedes Proteinbands.
3. Verwenden Sie die generierten Elektropherogramme zur visuellen Beurteilung und zur Identifizierung abnormer Bänder.
   HINWEIS: Standardmäßig zeigt das System Elektropherogramme im Wiederziehmodus an.
4. Verwenden Sie einen Standardmodus, um bei Bedarf anfangs-Elektropherogramme aus Rohdaten zu präsentieren.
   HINWEIS: Die Referenzbereiche des Kapillarelektrophoretischen Analyzers wurden durch statistische Analyse von 246 gesunden erwachsenen Teilnehmern (sowohl Männer als auch Frauen) mit normalen Triglyzeridwerten (Tabelle 1) festgelegt. Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen Standards festlegt.

6. Instrumentenabschaltung

1. Am Ende jeder Analysesequenz wird das Abschaltverfahren des Kapillarelektrophorese-Analysators eingeleitet, um die Kapillare unter idealen Bedingungen zu speichern.
   1. Um das Abschaltverfahren zu starten, wählen Sie im Hauptmenü "Abschalten" oder verwenden Sie das mit dem Analysator bereitgestellte Abschaltrack.
   2. Drücke im Hauptmenü "Shutdown". Drücken Sie im angezeigten Fenster auf dem Bildschirm, um das Verfahren zu starten. Der Abschaltungsprozess beginnt automatisch nach Abschluss des laufenden Analyseprogramms.
   3. Das Shutdown-Rack ist mit "EXTINCTION/SHUTDOWN CAPILLARYS 3 & MC" beschriftet. Setzen Sie dieses Rack am Ende der Sample-Rack-Warteschlange ein, und das Instrument startet automatisch das Abschaltverfahren.
      HINWEIS: Wenn das Abschaltverfahren abgeschlossen ist, wird das Gerät ausgeschaltet und der Bildschirm schaltet sich aus.
2. Verwenden Sie den physischen Netzschalter auf der Rückseite des Geräts, um den Analysator vom Netzstrom zu trennen.
3. Entferne alle Reagenzflaschen aus den beiden Reagenzkammern und lagere sie unter empfohlenen Lagerbedingungen. Häufige Fehler, mögliche Ursachen und Lösungen des vollautomatischen Elektrophorese-Analysators sind in ergänzender Tabelle 1 aufgeführt.

7. Leistungsparameter

1. Um die analytische Empfindlichkeit des Kapillarelektrophoreseverfahrens zu bestimmen, bereitet und analysiert man serielle Verdünnungen einer Serumprobe mit einem abnormen Protein in der Gammazone bei 1,198 g/dL. Die höchste Verdünnung mit einer erkennbaren Anomalie entspricht einer Konzentration von 19 mg/dL des abnormen Proteins.
   HINWEIS: Je nach Position des abnormen Proteins und des polyklonalen Hintergrunds in der Gammazone kann die Nachweisgrenze variieren.
2. Genauigkeitsbewertung – Interne Korrelation
   1. Um die Probenintegrität zu gewährleisten, werden alle Serumproben (einschließlich 18 normaler und 100 pathologischer Proben) identisch verarbeitet und nach denselben Richtlinien behandelt.
   2. Messen Sie die Werte jeder Proteinfraktion sowohl durch elektrophoretische Trennungen, die mit dem kapillarelektrophoretischen Verfahren am Analysator erhalten wurden, als auch durch eine andere kommerziell erhältliche Kapillarelektrophorese-Technik zur Proteinanalyse.
   3. Analysieren Sie die gemessenen Werte beider Verfahren mittels eines linearen Regressions-Statistischen Verfahrens. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten eine perfekte Korrelation zwischen beiden Verfahren.

Ergebnisse

Die Migrationspositionen, Peak-Eigenschaften und relative Prozentsätze jedes Proteinbands wurden quantitativ analysiert, indem die Absorption des Serumproteins nachgewiesen wurde. Die klinische Interpretation erfolgte anschließend basierend auf dem Vorhandensein und Muster abnormer Bänder, die im Elektropherogramm beobachtet wurden. Ein repräsentatives Kapillarelektropherogramm, das das normale Migrationsmuster der Serumproteinfraktionen zeigt, ist in Abbildung 1 dargestellt. Variationen in ...

Diskussion

SPE ist eine grundlegende diagnostische Technik in klinischen Laboren, bei der Serumproteine anhand von Unterschieden in ihren isoelektrischen Punkten, Molekulargewichten und^{Konformationen getrennt} werden. Diese Studie skizziert systematisch ein Protokoll zur schnellen Erkennung und Quantifizierung des Serum-M-Proteins mittels CE. Das Protokoll hebt die ausgezeichnete analytische Leistung der Methode hervor, wobei die Hauptvorteile hohe Empfindlichkeit, hoher Durc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CAPI 3 PROTEIN (E) 6 Puffer	SEBIA	2503	Laufender Puffer, der für die Trennung von Serumproteinen in der Kapillarelektrophorese verwendet wird (im Manuskript als laufender Puffer bezeichnet).
De lavage wash solution	SEBIA	2062	Verdünnte Spüllösung, die zur Reinigung von Kapillarröhrchen nach der Elektrophorese verwendet wird.
Reagensbecher	SEBIA	2582	Für die Probenverdünnung auf vollautomatischen Instrumenten.
FILTERKAPILLAREN	SEBIA		Einwegfilter, der zur Filterung von Pufferlösungen und deionisiertem Wasser während der Kapillarreinigung verwendet wird.
KAPICLEANEN	SEBIA	2060	Zur Reinigung der Kapillarröhren von CAPILLARYS 3 OCTA-Instrumenten (im Manuskript als Kapillarreinigungslösung bezeichnet)
Natriumhypochlorit-Lösung	Guangzhou Chemische Reagenzienfabrik	1703079	Zur Reinigung der Probesonne.
Deionisiertes Wasser	Watsons	/	Verwendet zur Kapillarspülung im automatisierten Kapillarelektrophorese-Analysator.
Randox Qualitätskontrolle	Randox	HN1530	Zur Qualitätskontrolle.
Vollautomatischer Kapillarelektrophorese-Analysator	SEBIA	CAPILLARYS 3 OCTA	Instrument für die Analyse von hochauflösenden und hochdurchsatzfähigen Serumproteinen.
PHORESIS 9.30 Software	SEBIA	/	Software zur automatisierten Erfassung und Analyse von Elektrophoresemustern.