Entwicklung und Validierung einer schnellen LC-MS/MS-Methode zur Carfilzomib-Quantifizierung im Plasma von Patienten mit multiplem Myelom

Summary

Diese Studie zielte darauf ab, eine schnelle, empfindliche Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Methode (LC-MS/MS) zur Quantifizierung von Carfilzomib im menschlichen Plasma zu entwickeln und zu validieren. Die vollständig validierte Methode unterstützt die therapeutische Arzneimittelüberwachung bei Patienten mit multiplem Myelom und ermöglicht so eine personalisierte Dosisoptimierung.

Abstract

Carfilzomib, ein Proteasomenhemmer der zweiten Generation, erfordert therapeutische Arzneimittelüberwachung (TDM). Diese Studie hatte zum Ziel, eine empfindliche und robuste Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Methode (LC-MS/MS) zur Quantifizierung von Carfilzomib im menschlichen Plasma zu entwickeln und zu validieren. Plasmaproben wurden mittels Proteinausfällung mit Acetonitril (ACN) verarbeitet. Die chromatographische Trennung erfolgte auf einer_C-18-Säule (2,1 mm × 100 mm, 3,5 μm), die bei 40 °C gehalten wurde, wobei eine mobile Phase aus ACN und 10 mmol/L Ammoniumacetat in Wasser (80:20, v/v) mit einer Durchflussrate von 0,35 mL/min geliefert wurde. Die Methode zeigte eine ausgezeichnete Linearität über einen Konzentrationsbereich von 2,00–1000,00 ng/mL. Zusätzlich wurden eine hohe intraday- und inter-day-Präzision und -genauigkeit beobachtet, wobei die Erholungsraten für Carfilzomib zwischen 84,1 % und 93,0 % lagen. Diese validierte LC-MS/MS-Methode ermöglicht eine genaue, effiziente und sensible Bestimmung der Carfilzomib-Konzentrationen im Plasma bei Patienten mit multiplem Myelom und unterstützt so die Optimierung der carfilzomibbasierten Therapie.

Introduction

Multiples Myelom (MM) ist eine hämatologische Malignität, die durch die klonale Proliferation von Plasma-Zellen im Knochenmark¹ gekennzeichnet ist. Sie stellt die zweithäufigste hämatologische Malignität weltweit^{dar und} macht etwa 10 % aller hämatologischen Krebsarten^aus. Im Laufe der Jahre haben Fortschritte in der Arzneimitteltherapie, darunter die Einführung von Proteasomenhemmern, immunmodulatorischen Medikamenten und monoklonalen Antikörpern, zu verbesserten therapeutischen Ergebnissen geführt. Ein signifikanter Anteil (20 %–30 %) der MM-Patienten erlebt jedoch weiterhin Herausforderungen wie kurze, progressionsfreie Überlebensreaktionen (PFS^), Arzneimittelresistenz und Rückfall⁶.

^{Bortezomib, der erste Proteasomeninhibitor7} der Klasse, hat die therapeutische Landschaft der MM grundlegend verändert. Trotz ihrer Wirksamkeit entwickelt die Mehrheit der Patienten letztlich eine rezidive- oder refraktäre Erkrankung, häufig begleitet von Bortezomib-Resistenz ^8,9 und reduzierten Behandlungs- und Überlebensraten^{von 10,11}. Diese Herausforderungen unterstreichen den dringenden Bedarf an innovativen Behandlungsansätzen zur Verbesserung der Ergebnisse bei MM. Carfilzomib, ein von der FDA zugelassener Proteasominhibitor der zweiten Generation, bietet ein stabileres pharmakokinetisches Profil, ermöglicht eine nachhaltige Unterdrückung der chymotrypsinähnlichen Aktivität und liefert starke antimyelomartige Wirkungen. Es ist im Allgemeinen für MM-Patienten empfohlen, die mindestens zwei vorherige Therapielinien durchlaufen haben, darunter eine Behandlung mit Bortezomib und einem immunmodulatorischen^{Medikament 1,11}. Forschungen haben gezeigt, dass Carfilzomib eine robustere Proteasomhemmung in Myelomzellen erreicht als Bortezomib und die Fähigkeit besitzt, die Bortezomib-Resistenz zu überwinden^12,13.

Die am weitesten verbreiteten Methoden zur Quantifizierung von Arzneimittelkonzentrationen in biologischen Matrizen umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Ultraviolett-Detektion (HPLC-UV), enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)¹⁴. Obwohl HPLC-UV eine betriebliche Einfachheit und niedrige Kosten bietet, wird sein Nutzen durch relativ geringe Empfindlichkeit und Selektivität eingeschränkt. Daher bleibt eine genaue Quantifizierung von Zielanalyten, insbesondere bei niedrigen Konzentrationen oder innerhalb komplexer biologischer Matrizen, eine Herausforderung¹⁵. ELISA zeigt eine hohe Empfindlichkeit. Seine Anwendung stößt jedoch auf mehrere Einschränkungen, darunter einen langwierigen Entwicklungsprozess, die Abhängigkeit von hochwertigen Antikörpern und die Anfälligkeit für Kreuzreaktivität mit strukturell ähnlichen Verbindungen in der Probe. Diese Faktoren beeinträchtigen zusammen die Spezifität des Assays¹⁶. Im Gegensatz dazu bietet LC-MS/MS außergewöhnliche Selektivität, überlegene Empfindlichkeit und schnellen analytischen Durchsatz. Diese Vorteile machen sie zur Goldstandard-Methodik für therapeutische Arzneimittelüberwachung (TDM) und pharmakokinetische Untersuchungen¹⁷. Carfilzomib weist die Eigenschaften einer umfangreichen Plasmaproteinbindung auf, einer schlechten in-vivo-Stabilität und einem engen therapeutischen Index. Die LC-MS/MS-Technologie kann eine schnelle quantitative Analyse der Zielverbindung durchführen, den Matrixeffekt effektiv reduzieren und eine wissenschaftliche Grundlage für eine präzise klinische Arzneimittelverabreichung bieten.

Der Medikamentenexpositionsgrad von Carfilzomib steht in engem Zusammenhang mit seiner therapeutischen Wirkung und den ADRs^18,19. Carfilzomib besitzt die dosisabhängige Eigenschaft²⁰, und sein Expositionsniveau steigt mit der Dosis im Körper positiv an, was seine therapeutische Wirkung direkt beeinflussen kann. Eine Studie zeigte, dass die vollständige Antwortrate (CR) von Carfilzomib bei der Behandlung von MM 28 %, die sehr gute partielle Antwortrate (VGPR) 73 % und die Gesamtansprechrate (ORR) 93 ^{% betrug}. Außerdem war im Vergleich zur Kontrollgruppe die Inzidenz von Kardiotoxizität bei Patienten, die mit Carfilzomib behandelt wurden, signifikant erhöht, während keine signifikante Veränderung der peripheren Neuropathie vorlag. Eine weitere Studie erwähnte ebenfalls die Wirksamkeit und Sicherheit von Carfilzomib bei der Behandlung von MM und bestätigte, dass Carfilzomib das Risiko von Kardiotoxizität erhöhen und gleichzeitig die therapeutische Wirkung verbessern^{kann 22}. Daher stehen die Wirksamkeit und ADRs von Carfilzomib im Zusammenhang mit dem Expositionsniveau. Bis heute wurden nur wenige validierte LC-MS/MS-Methoden zur Quantifizierung von Carfilzomib im menschlichen Plasma berichtet, insbesondere solche, die strenge bioanalytische Validierungskriterien erfüllen (z. B. FDA-Richtlinien). Bestehende Studien konzentrieren sich hauptsächlich auf Tiermodelle oder andere biologische Matrizen ^23,24, was eine Lücke in klinisch anwendbaren TDM-Tests bei MM-Patienten hervorhebt.

Daher besteht ein dringender Bedarf, einen schnellen, präzisen und sensiblen Test zur Überwachung der Carfilzomib-Konzentrationen bei MM-Patienten zu etablieren, um deren therapeutischen Nutzen und Sicherheitsprofil zu optimieren. In dieser Arbeit entwickelten und validierten wir eine zuverlässige LC-MS/MS-Methode, die Carfilzomib im menschlichen Plasma innerhalb von 3 Minuten quantifizieren kann, was eine ausgezeichnete Sensitivität und Reproduzierbarkeit nachweist. Entwickelt für das TDM von Carfilzomib in MM, unterstützt diese Methode die Dosisoptimierung und die Bewertung der Exposition und Antwort. Die Nutzer müssen sich der Instabilität des Medikaments im Plasma bewusst sein; Eine genaue Quantifizierung erfordert die Probenverarbeitung innerhalb von 4 Stunden nach der Blutentnahme.

Protocol

Dieses Forschungsprotokoll wurde vom Ethikkomitee des Zweiten Krankenhauses der Marinemedizinischen Universität (Shanghai Changzheng Hospital) genehmigt. Alle an der Studie teilnehmenden Patienten unterschrieben die informierte Einwilligung.

1. LC-MS/MS-Instrumentierung

1. Verwenden Sie ein Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesystem (UHPLC), das mit einem dreifachen Quadrupol-Massenspektrometer mit einer Elektrosprüh-Ionisationsquelle (ESI) ausgestattet ist, um Methodenentwicklung und Probenanalyse durchzuführen.
2. Konfigurieren Sie das UHPLC-System so, dass es einen Online-Entgaser, eine Binärpumpe, einen Autosampler und einen Säulenofen umfasst.
3. Führen Sie Datenerfassung und -verarbeitung mit der Datenerfassungssoftware des Instrumentenherstellers durch.

2. Flüssigkeitschromatographische Bedingungen

1. Erreichen Sie chromatographische Trennung mit einer ZORBAX-SB C_18-Säule (2,1 mm × 100 mm, 3,5 μm).
2. Halten Sie die Säulentemperatur bei 40 °C.
3. Isokratische Eluation mit einer mobilen Phase aus 20 % 10 mmol/L Ammoniumacetat in Wasser und 80 % ACN durchführen.
4. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,35 mL/min ein.
5. Gewährleisten Sie unter diesen Bedingungen symmetrische Spitzenformen und geeignete Retentionszeiten sowohl für den Analyten als auch für den internen Standard (IS).
   HINWEIS: Carfilzomib-d8 wurde als IS gewählt, da er strukturell mit Carfilzomib ähnlich ist, was eine vergleichbare Extraktionsrückgewinnung, chromatografisches Verhalten und Ionisationseffizienz gewährleistet.
6. Stelle die Gesamtlaufzeit auf 3,0 Minuten ein.

3. Massenspektrometriebedingungen

1. Betreiben Sie das Massenspektrometer im negativen ESI-Modus.
2. Stellen Sie die Kapillarspannung auf -6000 V ein.
3. Verwenden Sie Stickstoff sowohl als Verneblungs- als auch als Trocknungsgas.
4. Verwenden Sie hochreinen Stickstoff als Kollisionsgas bei einem Druck von 0,2 MPa.
5. Halte den Verneblerdruck bei 20 psi.
6. Erhitze das Trocknungsgas auf 400 °C und liefere es mit einer Durchflussrate von 10 L/min.
7. Stellen Sie die Temperatur des Mantelgases auf 350 °C ein, mit einer Durchflussrate von 12 L/min.
8. Daten werden im Mehrfachreaktionsüberwachungsmodus (MRM) erfasst.
9. Erfassen Sie Produktionenspektren von Carfilzomib (Abbildung 1A) und des IS (Abbildung 1B), um ihre Fragmentierungsmuster zu veranschaulichen.
10. Verwenden Sie den MS2-Scan-Modus, um das Eltern-Ion zu identifizieren.
11. Verwenden Sie den MS2-SIM-Modus, um die Fragmentor-Spannung zu optimieren.
12. Verwenden Sie den Produktionenmodus, um die optimale Kollisionsenergie (CE) zu bestimmen.
13. Details der optimierten Massenspektrometrieparameter für Carfilzomib und das IS (Tabelle 1).

4. Kalibrierungs- und Qualitätskontrollproben

1. Bereiten Sie eine Standardlösung aus Carfilzomib (1,0 mg/mL) vor, indem Sie 2,0 mg Carfilzomib genau in einen 2 ml Volumenkolben wiegen und in 2 mL Methanol (MeOH) auflösen.
   VORSICHT: MeOH ist entflammbar und giftig. Bei der Operation sollte dies in einer Abzugshaube geschehen, um das Einatmen von Dämpfen oder Hautkontakt zu verhindern. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe sowie Augen-/Gesichtsschutz.
2. Lagern Sie die Grundlösung bei -80 °C.
3. Erzeugen Sie Arbeitslösungen durch serielle Verdünnung der Grundlösung mit 10 % MeOH, um Konzentrationen von 100,0 μg/mL, 10,0 μg/mL und 1,0 μg/mL zu erreichen.
4. Kalibrierungsstandards etablieren, indem man das Blankplasma mit den Arbeitslösungen versetzt.
5. Verdünnen Sie das gespitzte Plasma mit Blankplasma im Verhältnis 1:9 (v/v), um Endkonzentrationen von 2,0, 5,0, 50,0, 200,0, 500,0, 750,0 und 1000,0 ng/ml zu erhalten.
6. Unabhängig werden Qualitätskontrollproben (QC) mit derselben Methode bei Konzentrationen von 5,0 ng/mL (niedrig), 200,0 ng/mL (mittel) und 750,0 ng/mL (hoch) hergestellt.

5. Probenvorbereitung

1. Vorbehandle Plasmaproben (100 μL) durch Zugabe von 20 μL einer 4%igen Phosphorsäurelösung.
   VORSICHT: Phosphorsäure ist korrosiv. Tragen Sie Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel, um Haut- und Augenkontakt zu vermeiden. Im Falle eines Kontakts spülen Sie sofort mit großzügigen Mengen Wasser ab.
2. Vortex-Mixing der Probe für 2 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit mit einem Standard-Labor-Wirbelmixer.
3. Fügen Sie 200 μL ACN hinzu und stellen Sie sicher, dass es eine IS-Lösung mit einer Konzentration von 200,0 ng/mL enthält, zum^{Gemisch 25}.
   VORSICHT: ACN ist entflammbar, flüchtig und giftig. Alle Operationen müssen in einer Dampfhaube durchgeführt und von Wärmequellen und Flammen ferngehalten werden. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe sowie Augen-/Gesichtsschutz.
4. Wirbel die kombinierte Mischung erneut.
5. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 12.500 ×g für 10 Minuten bei 4 °C²⁵.
6. Sammeln Sie 100 μL des Supernatans.
7. Kombinieren Sie den 100 μL Supernatanten mit 100 μL Wasser.
8. Übertragen Sie die resultierende Lösung in ein HPLC-Fläschchen, das mit einem Glaseinsatz ausgestattet ist.
9. Injizieren Sie 10 μL der in das LC-MS/MS-System zur Analyse.

6. Spezifitätsbewertung

1. Beurteile die Spezifität durch Vergleich der Reaktionen von Carfilzomib und IS in sechs verschiedenen Chargen von Blankplasma, IS-spiked Plasma, der unteren Quantifizierungsprobe (LLOQ) und authentischen Plasmaproben.
2. Betrachten Sie Interferenz als akzeptabel, wenn die Antwort weniger als 15 % des LLOQ für den Analyten und weniger als 5 % der IS-Antwort beträgt.

7. Linearitätsbewertung

1. Bewerten Sie die Linearität, indem Sie drei Sets von Kalibrierungsstandards an verschiedenen Tagen (mindestens zwei Tagen) analysieren.
2. Verwenden Sie ein gewichtetes, lineares Kleinste-Quadrat-Regressionsmodell, um Kalibrierungskurven basierend auf mindestens sechs Kalibrierungsstandards zu erstellen.
3. Definieren Sie den niedrigsten Konzentrationsstandard als LLOQ.
4. Es wird verlangt, dass für jeden Standard rückberechnete Konzentrationen innerhalb ± 15 % ihres Nennwerts liegen, mit einer Toleranz von ± 20 % für den LLOQ.

8. Bestimmung von Präzision und Genauigkeit

1. Bestimmen Sie die intraday- und inter-day-Genauigkeit und -genauigkeit, indem Sie fünf Replikaten von QC-Proben auf drei Konzentrationsniveaus und die LLOQ-Probe an mindestens zwei verschiedenen Tagen analysieren.
2. Geben Sie die Genauigkeit als relative Standardabweichung (RSD%) aus, die für QC-Proben ≤ 15 % und für die LLOQ 20 % ≤.
3. Druck die Genauigkeit als relativer Fehler (RE%) aus, wobei sie bei QC-Proben innerhalb ± 15 % und bei ± 20 % für die LLOQ liegen muss.

9. Wiederherstellung und Bestimmung des Matrixeffekts

1. Bestimmen Sie die Rückgewinnung, indem Sie die Spitzenfläche von Carfilzomib, das vor der Extraktion in das Plasma gespitzt wurde, mit der Spitzenfläche des Carfilzomibs verglichen wird, die in die extrahierte Matrix bei derselben Konzentration gespitzt wurde.
2. Bewerten Sie den Matrixeffekt, indem Sie die Spitzenfläche von Carfilzomib, die in die extrahierte Matrix gespitzt werden, mit der Spitzenfläche von Carfilzomib in einer sauberen Lösung bei derselben Konzentration vergleichen.
3. Zeigen Sie einen konsistenten Einfluss der blanken Plasmamatrix auf das Analytsignal an, wenn der RSD% für den Matrixeffektfaktor weniger als 15 % beträgt.

10. Übernahmebewertung

1. Beurteilen Sie die Übertragung, indem Sie unmittelbar nach dem höchsten Kalibrierungsstandard eine Leerprobe injizieren, um eventuelle Rest-Analytensignale der vorherigen Injektion zu erkennen.
2. Betrachten Sie die Übertragung als akzeptabel, wenn die Antwort von Carfilzomib in der Leerprobe weniger als 20 % des LLOQ und weniger als 5 % der IS-Antwort beträgt.

11. Bewertung des Verdünnungseffekts

1. Bewerten Sie den Verdünnungseffekt, indem Sie mit Blankplasma mit Konzentrationen verdünnen, die die obere Quantifizierungsgrenze (ULOQ) überschreiten, um die Konzentration in den Kalibrierungsbereich zu bringen.
2. Vergleichen Sie die gemessene Konzentration mit der nominalen Konzentration.

12. Stabilitätsbewertung

1. Bewertung der Stabilität durch Analyse von QC-Proben auf drei Konzentrationsniveaus unter unterschiedlichen Lagerbedingungen.
2. QC-Proben bei Raumtemperatur aufbewahren und nach 6 Stunden analysieren.
3. Lagere verarbeitete Proben im Autosampler auf und analysiere bei 0, 2, 4 und 6 Stunden.
4. Das Subjekt nimmt die QC-Proben in drei Gefrier-Tau-Zyklen durch abwechselnde Lagerung bei −20 °C und Raumtemperatur und analysiert dann.
5. Lagere die QC-Proben bei −80 °C für zwei Monate und analysiere dann.
6. Vergleichen Sie die gemessenen Konzentrationen mit den Nennwerten und bestätigen Sie, dass die Abweichungen innerhalb von ±15 % (RE%). liegen.

13. Patientenaufnahme und Probenentnahme

1. Holen Sie eine schriftliche informierte Einwilligung von allen Patienten ein.
2. Nehmen Sie Patienten mit MM auf und behandeln Sie sie mit Carfilzomib.
3. Entnehmen Sie Blutproben unmittelbar nach der Medikamentengabe (intravenöse Infusion über 30 Minuten).
4. Plasmaproben werden durch Zentrifugation von Blutproben in EDTA-3K-Röhren bei 4500 ×g für 10 Minuten bei 4 °C entnommen.

Results

LC-MS/MS-Optimierung

Zur Optimierung der Detektion von Carfilzomib wurden die Antwortwerte des Analyten sowohl im positiven als auch im negativen Ionisationsmodus verglichen. Der negative Ionisationsmodus ergab für Carfilzomib eine höhere Reaktion als der positive Ionisationsmodus und wurde daher für die spätere Analyse ausgewählt. Wir verglichen die Leistung der Spalten C₈, C₁₈ und T3-C₁₈ , um die optimale aus...

Discussion

Im Gegensatz zu traditionellen HPLC-UV- und ELISA-Methoden bietet LC-MS/MS außergewöhnliche Selektivität, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit und adressiert damit effektiv die Einschränkungen seiner Vorgänger. Diese Vorteile festigen seine Rolle als Goldstandard-Technik für die Arzneimittelanalyse in komplexen Biomatrizen, insbesondere für TDM- und pharmakokinetische Untersuchungen¹⁷. Wir haben eine LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von Carfilzomib im menschlic...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitril (ACN)	Merck-Kompanie (Darmstadt, Deutschland)	34888	LC-MS-Abschluss
Ammoniumacetat	Merck-Kompanie (Darmstadt, Deutschland)	9689	Analysereinheit: ≥ 99.0%
Analysebilanz	Sartorius (Deutschland)		Präzision: 0,01 mg
Analytische Spalte	Agilent Technologies (USA)		Agilent ZORBAX SB-C18, 2.1 & Times; 100 mm, 3,5 & Mikro; m
Carfilzomib	Shanghai Yuanye Biotechnologie (Shanghai, China)	868540-17-4	Analyse der Standardprobe, Reinheit > 99 %.
Carfilzomib-d8	Shanghai Yuanye Biotechnologie (Shanghai, China)		Analysieren Sie die Standardprobe, Reinheit > 98 %
Datenerfassungssoftware	Agilent Technologies (USA)		Agilent Masshunter Datenverarbeitungssoftware (Version 6.0)
Datenanalyse-Software	Agilent Technologies (USA)		Agilent MassHunter quantitative Analyse-Software (Version 10.1)
Destilliertes Wasser	Shenzhen Watsons Distilled Water Co., Ltd (Shenzhen, China)	LC-MS-Abschluss
HPLC-Fläschchen & Einsätze	Shanghai Titan Technology Co., Ltd. ((Shanghai, China))		-
Flüssigkeitschromatographie-System	Agilent Technologies (USA)		Die Agilent 1200-Serie umfasst Binärpumpen, einen Online-Entgaser, einen automatischen Probeprüfer und eine Säulentemperaturbox.
Methanol (MeOH)	Merck-Kompanie (Darmstadt, Deutschland)	1.06035	LC-MS-Abschluss
Mikropipetten	Eppendorf (Deutschland)		Mehrere Messbereiche (z. B. 10 & Mikro; L, 100 & Mikro; L, 200 & Mikro; L, 1000 & Mikro; L)
Büro & Statistiksoftware	-		Microsoft Office 365; GraphPad Prism 9.5
Phosphorsäure	Merck-Kompanie (Darmstadt, Deutschland)	49685	Analysereinheit, 85 Gewicht
Gekühlte Zentrifuge	Eppendorf (Deutschland)		Für Proben, die bei 4 °C zentrifugiert wurden; C
Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer	Agilent Technologies (USA)	G6475AA	Agilent 1200-Serie, ausgestattet mit Elektrosprüh-Ionisationsquelle (ESI)
Vortex-Mixer	Labnet  (USA)	S0200	Verstellbare Drehzahl