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Methodenartikel

DNA-Viralgrößenfraktion-Metagenomik für menschliche Stuhlproben

383 Ansichten

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DOI:

10.3791/70187

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24. März 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein flexibles Protokoll zur Erzeugung hochwertiger Metagenome (Virome) (Virome) aus menschlichen Stuhlproben. Ursprünglich für die Bodenviromik entwickelt, wurde dieses Protokoll hier erfolgreich auf Stuhlproben angewandt, was eine robuste Charakterisierung der menschlichen Darmvirosphäre ermöglichte.

Zusammenfassung

Das Verständnis der gesunden menschlichen Virosphäre (der viralen Komponente des Mikrobioms) erfordert genaue Messungen der Zusammensetzung der viralen Gemeinschaft über eine Vielzahl von Virustypen hinweg. Aufbauend auf bisherigen Erfahrungen mit Methoden der Boden-viralen Gemeinschaftsökologie demonstrieren wir hier eine Reihe von Laboransätzen zur Anreicherung und Extraktion von DNA aus extrazellulären DNA-Viren in menschlichen Stuhlproben. Ein funktionierendes primäres Protokoll wird präsentiert, zusammen mit Optionen für Abweichungen in verschiedenen Schritten. Der allgemeine Ansatz beinhaltet das Hinzufügen eines flüssigen Puffers (Standard: proteinverstärkte phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PPBS), um die Entfernung freier viraler Partikel aus der Stuhlmatrix zu erleichtern, Zentrifugation zur Trennung der flüssigen Fraktion mit Viruspartikeln, Filtration (Standard: 0,2 μm Porengröße) zur Entfernung der meisten Zellen, die Konzentration der viralen Partikel (Standard: Ultrazentrifugation), die Entfernung freier Nukleinsäuren mit Nukleasen vor der Virionenlyse, und dann DNA-Extraktion zur Sequenzierung. Alternative Techniken, darunter verschiedene Puffer, Filtergrößen und Konzentrationsmethoden, werden ebenfalls erwähnt. Insgesamt werden mehrere Möglichkeiten zur Erzeugung hochwertiger viromischer DNA für die Sequenzierung angeboten. Anstatt den Ansatz auf spezifische Geräte und Ressourcen anzupassen, sollte die Flexibilität des Protokolls es breit in Laboren mit unterschiedlichen Standardausstattungen für molekularbiologische Technik anwendbar machen.

Einleitung

Viromics, also die untargeted metagenomische Sequenzierung des viralen Größenanteils gemischter Gemeinschaften, kann Einblicke in die Vielfalt, Evolution und Ökologie unkultivierter Viren liefern. Seit den frühen Bemühungen, Darmviralgemeinschaften vor über 20 Jahren zu katalogisieren, die insbesondere Methoden für Umweltproben wie Meerwasser1 verwendeten, haben viromische Ansätze weiterhin Entdeckungen in der viralen Ökologie im menschlichen Mikrobiom2 ermöglicht. Es gibt jedoch kein einheitliches universelles Viromik-Protokoll, und Variationen in den Techniken können die Sequenzierungsergebnissebeeinflussen 3,4, was letztlich die Interpretation der Dynamik der viralen Gemeinschaften beeinflusst und Vergleiche zwischen Studien erschwert. Optimierte Protokolle, kombiniert mit einem gründlichen Verständnis darüber, wie methodologische Entscheidungen Viromprofile prägen, sind erforderlich, um die menschliche Virosphäre robust zu charakterisieren.

Obwohl es kein universelles Viromik-Protokoll gibt, besteht die allgemeine Grundlage der Viromik-Methoden darin, extrazelluläre virenähnliche Partikel (Virionen) physisch zu trennen und zu konzentrieren, vor der Virionenlyse freie Nukleinsäuren (teilweise aus zellulären Ablagerungen oder kompromittierten viralen Kapsiden) zu entfernen und DNA und/oder RNA für die Sequenzierung zu extrahieren. Einige viromische Techniken wählen für oder gegen bestimmte Viraltypen, sei es als bewusste Entscheidung von Forschern oder als unbeabsichtigte methodische Einschränkung. Spritzen- oder Vakuumfiltration wird häufig verwendet, um mikrobielle Zellen und andere Ablagerungen zu entfernen, und die Filtergröße beeinflusst von Natur aus die Qualität und Zusammensetzung des gewinnbaren Viroms. Zum Beispiel kann die Filtration die Viromreinheit5 erhöhen, aber größere Viruspartikel 6,7 ausschließen. Virionenkonzentrationsmethoden wie Ultrazentrifugation, Polyethylenglykol (PEG)-Ausfällung, Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Ultrafiltration haben ebenfalls Kompromisse zwischen Reinheit, Durchsatz undAusrüstungskosten 3,8. Mehrfachpufferchemikalien sind für die Viromik als wirksam. Sie haben möglicherweise keine übermäßigen Auswirkungen auf die Virom-Charakterisierung9, aber Speicher- und Resuspensionspuffer können dennoch die Viruswiederherstellung und die durch bioinformatische Analyse erzeugten Viromprofilebeeinflussen 10,11. Schließlich entscheiden sich viele Studien, da die Konzentrationen der viralen Nukleinsäuren in natürlichen Proben niedrig sein können, die virale DNA vor der Bibliothekskonstruktion zu amplifizieren (z. B. durch multiple Displacement amplification (MDA) oder sequence independent single-primer amplification (SISPA)). Dennoch führen einige dieser Techniken zu einer erheblichen Verzerrung12,13. Insgesamt können zwar viele viromische Methoden erfolgreich Virome erzeugen, aber optimierte Protokolle, die Verzerrungen anerkennen und teilweise standardisiert sind, ermöglichen eine genaue und reproduzierbare Viromforschung.

Dieser Artikel stellt einen flexiblen Workflow zur Erzeugung von Viromen aus menschlichen Stuhlproben vor. Angepasst an bewährte Bodenviromik-Techniken 14,15,16, umfasst dieses Protokoll mehrere Schritte, die die Modifikation erleichtern und es Forschern ermöglichen, es an ihre eigene Ausrüstung und Forschungsbedürfnisse anzupassen. Die unten beschriebene Standardmethode der Bodenviromik, die erfolgreich sowohl auf Boden- als auch auf gefrorene Stuhlproben angewendet wird, erzeugt hochwertige Virome ohne einen viralen DNA-Amplifikationsschritt vor dem Bau der Bibliothek. Die Vorschläge für Protokollmodifikationen wurden in unterschiedlichem Maße in anderen Studien getestet, aber ihre spezifischen nachgelagerten Effekte auf die menschlichen Stuhlviromsequenzen wurden hier nicht untersucht.

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Protokoll

Alle für die Stuhlprobenentnahme rekrutierten Probanden gaben eine informierte Einwilligung. Die Protokolle zur Probenentnahme wurden vom Institutional Review Board der University of California, Davis, genehmigt, und die Studien entsprechen der Erklärung von Helsinki. Dieses Protokoll basiert auf Emerson et al. (2022)17.

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Stellen Sie proteinreiche, phosphatgepufferte Kochsalzlösung vor (PPBS, 10x PBS, 1 % K-Citrat, 150 mM MgSO4, 2 % Rinderserumalbumin (BSA))18.
    HINWEIS: Weitere häufig verwendete Puffer in Viromik-Protokollen sind Kochsalzmagnesium (SM)19 und der modifizierte Kalium-Citrat-Prime (AKC') Puffer11.
    1. Fügen Sie 10 ml 10x PBS, 10 g K-Citrat, 18,05 g wasserfreies MgSO4 in eine 1-Liter-Autoklavenflasche und Glasflasche auf 1 L mit ultrareinem Laborwasser gefüllt. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 ein (benötigt typischerweise etwa 50 μL 6 M HCl oder etwa 100 μL 2 M HCl). Lassen Sie eine Rührstange in der Flasche für die Verwendung in Schritt 1.1.2.
    2. Autoklaviere die Flasche mit Puffer und eine leere 1-Liter-Autoklavenglasflasche. Nach dem Autoklavieren, sobald der Puffer auf Zimmertemperatur abgekühlt ist, auf eine magnetische Rührplatte legen und langsam 20 g BSA direkt in die Flasche geben, wobei jeweils etwa 5 g BSA hinzugefügt werden (um Schäumbildung zu vermeiden, das übermäßige Rühren der Lösung minimieren, z. B. mit langsamem Rühren beginnen und allmählich erhöhen).
    3. Filtern Sie das gesamte Puffervolumen durch einen sterilen 0,22 μm Vakuumfilter in die leere, autoklavierte 1-Liter-Flasche aus Schritt 1.1.2. Lagern Sie den Puffer bis zur Nutzung bei 4 °C.
      HINWEIS: Der PPBS-Puffer kann etwa 3 Monate bei 4 °C gelagert werden, ist aber langfristig nicht stabil, wenn er über dem Gefrierpunkt gelagert wird.
  2. Bereitet die Ultrazentrifugenröhren vor.
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet Ultrazentrifugation, um Virionen zu konzentrieren. Weitere gängige Ansätze sind Polyethylenglykol (PEG)-Niederschlagung, Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (z. B. Cäsiumchloridgradienten) und Ultrafiltration.
    1. Um die Ultrazentrifugenröhren zu reinigen, reinigen Sie die Röhren zunächst mit ultrareinem Laborwasser. Dann spülen Sie die Tuben mit ultrareinem Laborwasser ab.
    2. Fülle die Schläuche mit 1 M NaOH und lasse sie mindestens 1 Stunde einweichen (kann auch über Nacht einweichen). Reinigen Sie die Kunststoff-/Gummi-Ultrazentrifugenkappen und ihre O-Ringe, indem Sie sie in 1 M NaOH eintauchen.
      HINWEIS: Tauchen Sie die Metallkappen nicht in NaOH ein.
    3. Nach dem Einweichen wird dreimal mit ultrareinem Laborwasser gespült, gefolgt von einer Spülung mit nukleasefreiem, molekularbiologischem Wasser. Trocknen Sie die Schläuche durch Umdrehen und sanftes Klopfen oder lassen Sie sie über Nacht vollständig trocknen. Beschriften Sie jedes Ultrazentrifugenröhrchen mit einer Probenkennung.
  3. Vorkühlen Sie den Ultrazentrifugenrotor bei 4 °C, indem Sie ihn über Nacht im Kühlschrank oder Kühlraum lassen.

2. Virionreinigung und -konzentration

  1. Wiegen Sie den Stuhl in ein steriles, DNase-, RNase- und DNA-freies 50-mL-konisches Rohr.
    HINWEIS: Die Menge des verwendeten Stuhls kann von der verfügbaren Menge an Probenmaterial abhängen. Hier wurden 2 g Stuhl verwendet. Wenn ungenutztes Probenmaterial eingefroren gelagert werden muss, sollte man erwägen, die gesamte Probe vor dem Einfrieren zu aliquotieren, um zukünftige Frost-Tau-Zyklen zu minimieren.
  2. Fügen Sie 8 ml PPBS-Puffer direkt in die konischen Röhren mit dem Stuhl (konisch #1) hinzu. Vollständig durch Vortex wieder suspendieren.
  3. Schütteln Sie die Röhren bei 300 U/min bei 4 °C für 10 Minuten.
    HINWEIS: Falls nötig, kann das Schütteln bei Raumtemperatur erfolgen, aber 4 °C werden empfohlen.
  4. Zentrifugiere Proben in konischer Form #1 bei 4.000 x g bei 4 °C für 10 Minuten.
    HINWEIS: Verwenden Sie möglichst einen Schwing-Bucket-Rotor, um die vertikale Dichtetrennung zu erleichtern und die nächsten Schritte zu erleichtern.
  5. Überfüllen Sie das Supernatant vorsichtig in ein neues, steriles 50-mL-konisches (konisches #2) und lagern Sie es bei 4 °C (das Supernatant enthält hier die Virionen). Entsorgen Sie nicht das konische Rohr, das das Pellet enthält (konisch #1), da es in Schritt 2.6 erneut verwendet wird.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.5 noch zweimal (sodass die Probe in konischer #1 insgesamt 3x Resuspension mit Puffer, 3x Schütteln und 3x Zentrifugation durchlaufen hat) und setzen Sie fort, den Supernatant in konisch #2 zu sammeln.
    HINWEIS: Drei Patronen sollten insgesamt ~24 mL Supernatant ansammeln.
  7. Zentrifugiere das 50 ml konische Rohr mit angesammeltem Überstand (konisch #2) für 8 Minuten bei 10.000 x g bei 4 °C.
  8. Führen Sie eine zweite Zentrifugationsrunde durch. Zuerst wird das Supernatant von konisch #2 in ein neues 50-mL konisches Rohr (konisch #3) übergepumpt. Zentrifugiere konisch #3 für 8 Minuten bei 10.000 x g bei 4 °C.
  9. Mit Spritzenfiltration filtern Sie das Supernatant sequentiell von konisch #3 und vermeiden Sie das Pellet am Boden des Rohrs. Vorfilter mit einem sterilen 5,0 μm Polyethersulfon (PES) Spritzenfilter, gefolgt von einem sterilen 0,20 μm PES-Spritzenfilter, direkt in ein Ultrazentrifugenrohr.
    HINWEIS: Der Zweck der Vorfilterung mit 5,0-μm-Filtern ist es, Verstopfungen der 0,20-μm-Filter zu reduzieren. Es kann dennoch notwendig sein, die Spritzenfilter zu entsorgen und zu ersetzen, falls sie verstopft sind. Die Filtration kann in einem einzigen Schritt durchgeführt werden, indem der 5-μm-Filter auf den 0,20-μm-Filter gestapelt, an eine einzelne Spritze angeschlossen und direkt in ein Ultrazentrifugenrohr eingefügt wird. PES-Membranen werden bevorzugt, da andere Membranmaterialien Virionen (z. B. Glasfaser) speichern oder schneller verstopfen können (z. B. Polyvinylidenfluorid, PVDF). 0,45 μm ist eine weitere gängige Filtergröße.
  10. Überprüfen Sie die Masse aller Ultrazentrifugenröhren mit ihrem Probeninhalt und koppeln Sie die Röhren in der Ultrazentrifuge basierend auf der Masse. Falls nötig, fügen Sie PPBS an die leichtere Röhre jedes Paares hinzu, um das Gewicht auszugleichen (innerhalb einer Fehlermarge von 0,05 g für gepaarte Röhren).
  11. Ultrazentrifuge mit 112.000 x g bei 4 °C unter Vakuum für 2 Stunden und 25 Minuten.
    HINWEIS: Je nach verwendetem Rotor variiert die Rotationsdauer (je nach Sedimentkoeffizient (s) = 58). Siehe die Materialtabelle für den hier verwendeten Rotor. Bevor Sie die Röhren aus der Ultrazentrifuge entfernen, beachten Sie die Ausrichtung jedes Rohrs im Rotor, um die Lokalisierung des viralen Pellets zu erleichtern. Manchmal ist nach der Ultrazentrifugation das virale Pellet nicht sichtbar, und beim Entfernen des Supernatants im folgenden Schritt sollte besondere Vorsicht geboten werden.

3. Resuspension von viralen Pellets und Behandlung von DNase

  1. Entfernen Sie das Überlagermittel entweder durch Dekantieren oder mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, da es empfindlich sein kann (das Pellet enthält die konzentrierten Virionen).
    HINWEIS: Wie in Schritt 2.11 erwähnt, kann das Pellet sichtbar sein oder auch nicht, aber oft ist ein braunes oder gelbes Pellet in 'loch-Lochgröße' zu sehen.
  2. Behandle die Proben mit DNase.
    HINWEIS: Wenn Sie sich gegen DNase-Proben entscheiden, fahren Sie mit Schritt 4 fort und folgen Sie "Wenn DNase-Behandlung nicht durchgeführt wurde". Siehe die Diskussion für Überlegungen zur Durchführung der DNase-Behandlung.
    1. Suspendieren Sie das Pellet in 100 μL nukleasefreiem, molekularbiologischem Wasser erneut in ein etikettiertes 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr.
    2. Stellen Sie die DNase-Behandlungs-Mastermischung her, indem Sie für jede zu behandelnde Probe 10 μL DNase-Reaktionspuffer und 10 μL DNase hinzufügen. Pipette gründlich mischen.
      HINWEIS: Bereiten Sie in Schritt 3.2.3 genügend DNase-Behandlungs-Mastermix für zusätzliche Reaktionen vor, um möglichen Volumenverlust während des Pipettierens zu berücksichtigen.
    3. Fügen Sie den resuspendierten Virionen 20 μL des DNase-Behandlungs-Mastergemisch hinzu. Gut mischen durch sanftes Pipetteren. Inkubiere bei 37 °C für 30 Minuten.
    4. Fügen Sie 10 μL DNase-Stopplösung hinzu, um die Nukleasen zu inaktivieren. Kurzzeitig Vortex.

4. Extraktion viraler Nukleinsäuren

  1. Führen Sie die DNA-Extraktion mit dem in der Materialtabelle aufgeführten DNA-Extraktionskit durch.
    HINWEIS: Nehmen Sie zwei Änderungen an den Anweisungen des Herstellers vor. 1) Nach Schritt 1 im Kit-Verfahren wird das Perlenrohr mit den Virionen in Puffer-CD1 bei 65 °C für 10 Minuten erhitzt und anschließend gemäß den Anweisungen des Herstellers mit der Extraktion fortgeführt. 2) Während des DNA-Elutionsschritts (Schritt 16 im Kit-Verfahren) werden die Säulen nach der Zugabe von C6 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
    1. Wenn eine DNase-Behandlung durchgeführt wurde: Nachdem die Nukleasen inaktiviert wurden (in Schritt 3.2.4), wird das gesamte Volumen als Input für die DNA-Extraktion verwendet (d. h. in Schritt 1 des DNA-Extraktionskit-Verfahrens wird dieses Volumen dem Perlenrohr mit 800 μL CD1 hinzugefügt). Achte darauf, keine Lösung zurückzulassen (diese Lösung enthält die Virionen).
    2. Falls keine DNase-Behandlung durchgeführt wurde: 100 μL nukleasefreies, molekulares Wasser in das Ultrazentrifugenrohr mit dem Pellet aus Schritt 3.1 geben. Kratze die Kugel vorsichtig ab und schaffe sie wieder auf. Verwenden Sie das resuspendierte Pellet als Input für die DNA-Extraktion.

5. DNA-Quantifizierung

  1. Quantifizieren Sie die extrahierte DNA mit der bevorzugten fluoreszenzbasierten Methode.
    HINWEIS: Die Virom-DNA-Erträge sind selten hoch genug für eine absorptionsbasierte Quantifizierung; Dies kann jedoch dennoch hilfreich sein, um chemische Schadstoffe zu identifizieren.
  2. Zur kurzfristigen Speicherung wird DNA nach der Quantifizierung bei -20 °C gelagert. Für längere Lagerung bei -80 °C lagern. Die DNA ist nun bereit für die Vorbereitung und Sequenzierung in der Bibliothek. Siehe die Materialtabelle für das hier verwendete Vorbereitungsset und die Sequenzierungsplattform der Bibliothek.

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Ergebnisse

Eine explorative Methode, bei der dieses Protokoll auf eine einzelne gefrorene Stuhlprobe (in technischem Dreifach für Virome verarbeitet) zusammen mit zwei Bodenproben angewendet wurde, zeigte seine Wirksamkeit bei der Herstellung hochwertiger Virome aus verschiedenen Probentypen. Mit qualitätsgefilterten Sequenzierungsdaten und de-novo-zusammengestellten Contigs, die von diesem Protokoll erzeugt wurden, wurden mutmaßliche virale Sequenzen mit einem Open-Source-Virenidentifikationstool<...

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Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine relativ einfache und anpassungsfähige Methode zur Erzeugung von Viromen. In den Böden14, 15, 16, 21 nachgewiesen, wird es hier erfolgreich auf menschliche Stuhlproben angewendet. Dieses Protokoll rekonstruiert am besten extrazelluläre, intakte DNA-Viren und ist nicht dafür ausgelegt, absichtlich intrazelluläre Viren oder Prophagen (...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Wir danken Dr. Sean Adams, Dr. Trina Knotts und Mohamed R. Ali (University of California, Davis School of Medicine) für die Sammlung und Bereitstellung der Stuhlprobe gemäß den IRB-Protokollen und ethischen Standards. Wir danken Dr. Matthew R. Olm (University of Colorado, Boulder) für die Zusammenarbeit bei der Analyse der Stuhlprobe. Diese Forschung wurde vom NIH Common Fund (Human Virome Program), Auszeichnung # U01DE034198. LSH wurde außerdem teilweise vom US-Energieministerium (DOE), dem Office of Science, dem Office of Biological and Environmental Research (BER), dem Genomic Science Program, Auszeichnungsnummer DE-SC0023127 (Zuschuss an JBE, Förderleiter Sydney Glassman) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- und Protease-freies PuderFisher-BioReagenzienBP9706100Zum PPBS-Rezept (Schritt 1.1)
DNeasy PowerSoil Pro KitQIAGEN47016DNA-Extraktionskit (Schritt 4.1)
KAPA DNA HyperPrep BibliothekssetRochen/aDie von diesem Kit generierten Bibliotheken wurden mit der Illumina NovaSeq 6000-Plattform (2 x 150 bp) sequenziert.
Magnesiumsulfat (MgSO4), wasserfrei, ≥ 99.5%Sigma-AldrichM7506Zum PPBS-Rezept (Schritt 1.1)
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x, pH 7,4, RNase-freiInvitrogenAM9624Zum PPBS-Rezept (Schritt 1.1)
Polyethersulfon (PES) Membranspritzenfilter, steril, 28 mm, 0,2 μ mCorning431229Für die Spritzenfiltration (Schritt 2.9)
Polypropylen-Kegelzentrifugenröhren, steril, 50 mLOlympus Plastics28-108
Kaliumcitratmonohydrat (kristallin/zertifiziert)Fisher ChemicalP222Zum PPBS-Rezept (Schritt 1.1)
Qubit  PrüfröhrenInvitrogenQ32856Zur DNA-Quantifizierung (Schritt 5.1)
Qubit 4 FluorometerInvitrogenQ33238Zur DNA-Quantifizierung (Schritt 5.1)
Qubit dsDNA-Quantifizierungs-Assay-KitsInvitrogenQ32850Zur DNA-Quantifizierung (Schritt 5.1)
RQ1 RNase-freie DNasePromegaPR-M6101Enthält den Reaktionspuffer, DNase und Stopplösung
Supor hydrophile Polyethersulfon (PES) Membran-Spritzenfilter, steril, 32 mm, 5,00 & mikro; m Cytiva (früher Pall Lab)28150-956Für die Spritzenfiltration (Schritt 2.9)
Ultrazentrifugenrotor: Typ 50,2 Ti Festwinkelrotor, 50,000 U/min, 302,000 x g, 12 x 39 mBeckman Coulter337901Wir verwenden außerdem den Beckman Coulter Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor (Cat. 337922). Zentrifugiere 3 Stunden, wenn du die 70 Ti verwendest.
Ultrazentrifugenröhren: 26,3 mL Polycarbonatflasche mit Deckelbaugruppe, 25 x 89 mmBeckman Coulter355618Kompatibel mit Beckman Coulter-Rotoren des Typs 50.2 Ti (Kat. 337901) und Typs 70 Ti (Kat. 337922)
Ultrazentrifuge: Beckman Instruments Optima LE-80K Boden-UltrazentrifugeBeckman Coulter365668Wir verwenden außerdem die Beckman Coulter L8-70M Refrigerated Ultracentrifuge (Cat. 344196).

Referenzen

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Schlagwörter

Virale Metagenomikmenschliches ViromStuhlviromDNA ExtraktionUltrazentrifugationZusammensetzung der viralen GemeinschaftFiltrationsmethodeShotgun MetagenomikVirom Sequenzierung
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