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Methodenartikel

Ein praktischer Workflow zur Analyse von räumlichen Transkriptomik-Daten: Von der Datenerfassung bis zu fortgeschrittenen Analysen

195 Aufrufe

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DOI:

10.3791/70188

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21. August 2026

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1Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Rehabilitation Medicine, Nanjing Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Analyse von räumlichen Transkriptomik-Daten vor und führt die Nutzer von der öffentlichen Datenerfassung und der Seurat-basierten Qualitätskontrolle über Integration, Detektion räumlicher Merkmale, Dekonvolution von Zelltypen, Annotation von Regionen von Interesse bis hin zur Analyse der Zell-Zell-Kommunikation, mit praktischen Kontrollpunkten, die eine transparente Durchführung unterstützen.

Zusammenfassung

Die räumliche Transkriptomik (ST) erfasst den genomweiten Genexpressionsstatus unter Erhaltung des zweidimensionalen räumlichen Kontexts von mRNA-Molekülen in Gewebeschnitten und ermöglicht somit Untersuchungen zur Gewebearchitektur und der biologischen Mikroumgebung. Die Analyse von ST-Daten bleibt jedoch herausfordernd, da der Dateneinlesen, die Qualitätskontrolle, Integration, Deconvolution, räumliche Statistik und Visualisierung oft mehrere Softwareumgebungen sowie reproduzierbare Parameterentscheidungen erfordern. Dieses Protokoll stellt einen praktischen rechnergestützten Arbeitsablauf für öffentliche ST-Datensätze in R vor, beginnend mit der Datenerfassung und Software-Installation und fortlaufend über das datenbasierte Laden mittels Seurat, Qualitätskontrolle, Normalisierung, Integration mehrerer Proben, Clusterung und Analyse räumlich variabler Gene. Anschließend werden ergänzende Deconvolution-Strategien angewandt, einschließlich der referenzgeführten SPOTlight-Analyse und des unüberwachten Topic-Modeling mittels STdeconvolve, gefolgt von der Analyse räumlicher Zell-Zell-Kommunikation basierend auf Giotto sowie der interaktiven Auswahl von Interessenbereichen (ROI) mithilfe einer benutzerdefinierten Python-Dash-Anwendung. Durch Betonung der skriptbasierten Ausführung, expliziter Begründungen der Parameter, erwarteter Ergebnisse und Fehlersuche-Punkte bietet das Protokoll einen anpassbaren Rahmen für Standard-Array-basierte ST-Datensätze und verwandte Plattformen nach Evaluierung datensatz- und plattformspezifischer Parameter.

Einleitung

Die räumliche Transkriptomik (ST) ist eine bahnbrechende Technologiefamilie, die die genomweite Genexpression misst und dabei die räumlichen Koordinaten von Boten-RNA-(mRNA-)Molekülen in Gewebeschnitten erhält. Zu den ST-Methoden zählen sequenzbasierte Ansätze, die positionskodierte Arrays nutzen, sowie in situ-Abbildungsverfahren, die transkriptionelle Signale in intakten Gewebemikroumgebungen kartieren1,2. Durch die Erhaltung des räumlichen Kontexts ermöglicht die ST die Analyse der Gewebearchitektur, der Organisation zellulärer Nachbarschaften, der Zell-Zell-Kommunikation sowie mikroumgebungsbedingter biologischer Prozesse, die nach einer Gewebedissoziation nicht vollständig aufgeklärt werden können3.

Das schnelle Wachstum öffentlicher ST-Datenrepositorys hat beispiellose Möglichkeiten für sekundäre Analysen und die Entwicklung neuer Methoden eröffnet3. Ressourcen wie die CROST-Datenbank stellen Hunderte räumlich aufgelöster transkriptomischer Datensätze aus mehreren Arten und Technologieplattformen zusammen, während spezialisierte Sammlungen wie STOmicsDB sich auf bestimmte Methoden wie Stereo-seq konzentrieren4,5. Trotz des reichhaltigen Datenangebots bleibt die computergestützte Analyse aufgrund der Komplexität räumlicher Datenstrukturen, der Vielfalt analytischer Werkzeuge und der technischen Hürden bei der Implementierung reproduzierbarer Workflows eine Herausforderung6,7,8,9,10,11.

Um die Einschränkungen der Abhängigkeit von einer einzelnen Softwareumgebung zu überwinden, wird hier ein integrierter rechnergestützter Workflow vorgestellt, der komplementäre Analysewerkzeuge nutzt. Zu den bestehenden umfassenden ST-Analyse-Ökosystemen gehören hauptsächlich Seurat, Giotto und auf Python basierende Frameworks wie Squidpy6,7,12. Obwohl Python-basierte Tools wie Squidpy umfangreiche Funktionen für die Analyse räumlicher Graphen bieten, minimiert die Zusammenfassung der primären rechnergestützten Pipeline in einer einzigen Programmierumgebung technische Hürden zwischen verschiedenen Sprachen. Daher wird die Kern-Pipeline hauptsächlich in R implementiert, um solche sprachübergreifenden technischen Schwierigkeiten zu verringern. In diesem auf R basierenden Workflow wird Seurat für das Dateneinlesen, die Qualitätskontrolle, die Normalisierung, die Dimensionsreduktion, die Visualisierung und die Integration mehrerer Proben verwendet, was dessen verbreitete Anwendung in Einzelzell- und räumlichen Transkriptomik-Analysen widerspiegelt. Anschließend wird Giotto für den Aufbau räumlicher Netzwerke und die Analyse der zell-zu-Zelle-Kommunikation auf Basis von Ligand-Rezeptor-Interaktionen eingesetzt. Dadurch verbindet dieser Workflow die auf Seurat basierende Vorverarbeitung und Integration mit der auf Giotto basierenden räumlichen Analyse, wobei der Datenaustausch zwischen den beiden Werkzeugsets explizit und reproduzierbar bleibt.

Innerhalb dieses Rahmens werden zwei komplementäre Dekonvolutionsstrategien angewendet: SPOTlight, eine referenzgeführte Methode, die scRNA-seq-Daten verwendet, um die Anteile der Zelltypen zu schätzen, und STdeconvolve, eine unüberwachte Topic-Modellierungsmethode, die latente transkriptionelle Muster identifiziert8,11. Die Ergebnisse liefern komplementäre Einblicke in die räumliche zelluläre Heterogenität, werden jedoch nicht als quantitative Kreuzvalidierung betrachtet, es sei denn, der Nutzer führt die optionale in diesem Protokoll beschriebene Konkordanzanalyse durch. Eine benutzerdefinierte Python-Dash-Anwendung, Select Spatial Spots, ist zur interaktiven Annotation von Regionen von Interesse (ROI) integriert und erzeugt standardmäßige, koordinatenbasierte Annotationsdateien, die in nachfolgenden downstream-Analysen verwendet werden können.

Hinsichtlich der praktischen Anwendbarkeit richtet sich dieser Arbeitsablauf hauptsächlich an Standard-Array-basierte ST-Daten (z. B. Visium mit 55 µm Auflösung) und kann nach Bewertung der Parameter auf andere Gewebetypen übertragen werden. Vor der Analyse sind wichtige Einschränkungen zu berücksichtigen. Erstens hängt das referenzgeführte Deconvolution-Modul von einem hochwertigen, gewebematchenden scRNA-seq-Referenzdatensatz ab. Zweitens erfordern subzelluläre oder nahezu einzellbasierte Plattformen möglicherweise eine angepasste Vorverarbeitung, räumliche Bündelung der Bin oder bildbasierte Zellsegmentierung vor der Integration2. Der repräsentative Datensatz der Mauskolon dient als Demonstrationsbeispiel, um zu zeigen, wie der Arbeitsablauf räumliche Domänen und markerdefinierte Gewebestrukturierung bewerten kann, und nicht als Nachweis allgemeiner Plattformkompatibilität.

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Protokoll

Alle in diesem Protokoll analysierten biologischen Datensätze sind öffentlich verfügbar und ausschließlich zu Demonstrationszwecken verwendet worden. Spezifische Datenzugriffsnummern und Quellarchive werden in den entsprechenden Schritten angegeben. Die ursprünglichen Datensätze wurden von den jeweiligen Forschern unter Einhaltung der institutionellen ethischen Richtlinien, die für jede Quellstudie galten, erstellt. Siehe die Tabelle der Materialien, um alle erforderlichen Software- und R-Paketversionen zu überprüfen.

Hardware-Anforderungen: Der erforderliche Rechenspeicher für diesen Arbeitsablauf skaliert mit der Anzahl der analysierten Proben und Spot-Positionen. Für einen typischen Datensatz der räumlichen Transkriptomik (z. B. etwa 3.000 Spots pro Probe über bis zu drei Proben hinweg) ist eine Standard-Workstation mit mindestens 16 GB RAM ausreichend, um die Analyse-Pipeline auszuführen. Es wird jedoch dringend empfohlen, über 32 GB RAM oder mehr zu verfügen, um eine optimale Leistung und Stabilität sicherzustellen, insbesondere bei rechenintensiven Schritten wie der SCTransform-Normalisierung und der Matrixfaktorisierung während der Dekonvolution.

1. Datenerfassung und Vorbereitung der Verzeichnisstruktur

  1. Öffentliche räumliche Transkriptomik-Datensätze beschaffen (z. B. GEO-Zugangsnummer GSE169749, Einreichungsdatum 26. März 2021, letzte Aktualisierung 6. März 2022) sowie Referenzdaten aus der Einzelzell-RNA-Seq (z. B. GEO-Zugangsnummer GSE264408, Einreichungsdatum 19. April 2024, letzte Aktualisierung 10. Dezember 2024).
  2. Laden Sie das Archiv mit den Rohdaten (z. B. GSE169749_RAW.tar) aus dem Repository herunter und entpacken Sie es.
    HINWEIS: Für den repräsentativen Datensatz, der in diesem Protokoll verwendet wird, enthält das extrahierte Verzeichnis mehrere Dateien pro Probe, wobei die Dateinamen in der Regel die GEO-Probennummer (z. B. GSM5213483) enthalten.
  3. Ordnen Sie die Dateien in einer standardisierten Verzeichnisstruktur an, die mit Seurat kompatibel ist. Load10X_Spatial Funktion.
    1. Erstellen Sie ein Hauptdatenverzeichnis (z. B. ./data/).
    2. Erstellen Sie ein dediziertes Unterverzeichnis für jede Probe (z. B. ./data/sample_A1/).
    3. Übertragen (kopieren oder verschieben) Sie die folgenden wesentlichen Dateien für jede Probe in das jeweilige Unterverzeichnis.
      1. Platzieren Sie das filtered_feature_bc_matrix.h5 in das Hauptunterverzeichnis der Probe übertragen
      2. Erstellen Sie eine räumlich/ Unterordner innerhalb jedes Probendverzeichnisses.
      3. Platzieren Sie die folgenden Dateien in die räumlich/ Unterordner: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz und tissue_hires_image.png.gz.
    4. Entpacken Sie die .gz Dateien in der räumlich/ Ordner. Stellen Sie sicher, dass die ursprünglichen Dateinamen genau so bleiben, wie sie von der Load10X_Spatial Funktion (z. B., tissue_positions_list.csv).
      HINWEIS: Die endgültige, geordnete Struktur für eine reibungslose Beladung muss diesem Muster folgen, am Beispiel der Probe A1:
      ./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. Einrichtung der Softwareumgebung

  1. R (Version 4.4.3 oder höher) installieren.
  2. Die Analyse-Skripte (1_ReadSpatialData.R bis 8_Giotto_Communication.R) aus dem GitHub-Repository (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow, Commit-Hash 2d85e18 zur Reproduzierbarkeit) beschaffen.
  3. Die erforderlichen R-Pakete von CRAN und Bioconductor installieren, indem das Skript setup.R ausgeführt wird.
    ANMERKUNG: Eine umfassende Liste der spezifischen Paketversionen, die in diesem Workflow verwendet wurden, ist in der Tabelle der Materialien enthalten und ebenfalls in der Datei session_info.txt im zugehörigen GitHub-Repository verfügbar (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow).
  4. Die Giotto Suite installieren, indem die Installationsbefehle aus der offiziellen Dokumentation ausgeführt werden.
    1. Zur offiziellen Installations-URL navigieren, um die Setup-Skripte abzurufen: https://giottosuite.com/articles/installation.html
    2. Die erforderliche Python-Umgebung und Systemabhängigkeiten gemäß der schrittweisen Anleitung initialisieren.
  5. Zusätzliche Pakete für verbesserte Visualisierung installieren.
    1. Ausführen: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
  6. Das benutzerdefinierte Werkzeug Select Spatial Spots installieren. Sicherstellen, dass das Betriebssystem Windows, macOS oder Linux ist und Python-Version 3.8 oder höher installiert ist. Dieser Schritt ist optional.
    1. Das Werkzeug beschaffen, indem zum GitHub-Repository navigiert wird (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots, Commit-Hash d20946e zur Reproduzierbarkeit) und der Quellcode heruntergeladen wird.
    2. Ins Verzeichnis des Werkzeugs wechseln und die Python-Abhängigkeiten installieren: pip install -r requirements.txt
  7. Das Paket glmGamPoi installieren, indem BiocManager::install("glmGamPoi") ausgeführt wird, um die SCTransform-Normalisierung zu beschleunigen.
    ANMERKUNG: Der Kern-Workflow erfordert nur die in den Schritten 2.1–2.3 und 2.6 aufgeführten Pakete. Das Paket Rfast2 wird verwendet, um die Berechnung der Moran's-I-Statistik zu beschleunigen. Die optionalen Pakete in Schritt 2.5 dienen der Erstellung publikationsreifer Diagramme mit einem Prism-Stil (ggprism) und dem Zugriff auf eine farbenblindenfreundliche Farbpalette (colorBlindness). Das Werkzeug in Schritt 2.6 ermöglicht die interaktive Auswahl von Spots. Den Befehl sessionInfo() ausführen und die vollständige Konsolenausgabe in einer Textdatei speichern. Dadurch werden die exakten Softwareversionen und Paketabhängigkeiten dokumentiert, was für die langfristige Reproduzierbarkeit entscheidend ist.

3. Laden räumlicher Daten und Qualitätskontrolle (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

  1. Laden Sie die räumlichen Daten in Seurat-Objekte ein.
    1. Verwenden Sie Read10X_Bild um das hochauflösende Gewebebild manuell zu laden und dabei das image.dir und image.name
    2. Verwenden Load10X_Spatial mit dem Bild Parameter auf das in Schritt 3.1.1 erstellte Bildobjekt gesetzt, um das Seurat-Objekt zu erstellen.
  2. Berechnen Sie die Qualitätskontrollkennzahlen.
    1. Berechnen Sie den Prozentsatz der mitochondrialen Reads mithilfe von ProzentanteilMerkmalsmenge mit dem Muster ^mt-.
  3. Visualisieren und interpretieren Sie die Daten basierend auf QC-Metriken.
    1. Erzeugen Sie Violin-Plots von nCount_Spatial, nFeature_Spatial, und Prozent.mt unter Verwendung von VlnPlot.
    2. Erstellen Sie räumliche Merkmalsplots dieser Metriken unter Verwendung von SpatialFeaturePlot um Spots außerhalb des Gewebebereichs zu identifizieren.
      HINWEIS: Visueller Kontrollpunkt: Außerhalb des Gewebebereichs liegende Flecken weisen typischerweise niedrige UMI-Zahlen auf (nCount_Spatial < 500) und geringe Gen-Detektion (nFeature_Spatial < 200)
    3. Zur Demonstration werden Filter angewendet, um Spots von geringer Qualität zu entfernen (z. B. subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). Dies ist ein optionaler Schritt.
      HINWEIS: Das primäre Ziel der Qualitätskontrolle (QC) in der räumlichen Transkriptomik besteht darin, technische Artefakte zu identifizieren und zu annotieren, beispielsweise Spots außerhalb des Gewebes. Für die Demonstrationsdaten des Visium-Darmgewebes gilt nFeature_Spatial > 200 und nCount_Spatial > 500 entfernen von Spots mit geringer Komplexität/Hintergrund. Bei Geweben mit niedrigem RNA-Gehalt oder degradierten Schnitten die Violin- und räumlichen Merkmalsplots überprüfen, bevor Schwellenwerte erhöht werden; bei dichten oder hoch-UMI-Geweben können strengere Schwellenwerte angemessen sein. Eine Filterung allein basierend auf hohen Expressionswerten sollte vermieden werden, es sei denn, Doppelzellen, Gewebefalten oder eindeutige Artefakte sind sichtbar. Eine Filterung wird häufig nicht empfohlen, da sie räumliche Positionen physisch entfernt, was die Kontinuität der Gewebestruktur für nachfolgende räumliche Analysen stören könnte.

4. Daten-Vorverarbeitung, Integration und Clustering (3_IntegrationAndClustering.R)

  1. Normalisieren und vorverarbeiten Sie einzelne Proben.
    1. Wenden Sie die SCTransform-Normalisierung separat auf jede Probe mit Assay = Spatial an.
  2. Integrieren Sie mehrere Proben.
    1. Bereiten Sie die Liste der SCT-normalisierten Objekte zur Integration vor. Stellen Sie sicher, dass jedes Objekt über einen „RNA“-Assay verfügt, indem Sie den „Spatial“-Assay kopieren: spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Spatial"]]
      ​HINWEIS: Das Kopieren des „Spatial“-Assays in einen standardmäßigen „RNA“-Assay-Platz dient als notwendiger Workaround, um die Kompatibilität mit nachgelagerten Integrationsfunktionen sicherzustellen, die ursprünglich für Einzelzell-Seurat-Objekte entwickelt wurden.
    2. Verwenden Sie SelectIntegrationFeatures und PrepSCTIntegration, um gemeinsam variable Merkmale zu identifizieren.
    3. Finden Sie Integrationsanker mithilfe von FindIntegrationAnchors mit normalization.method = "SCT".
    4. Integrieren Sie die Daten mithilfe von IntegrateData mit normalization.method = "SCT".
  3. Führen Sie eine Dimensionsreduktion und Clusterung des integrierten Assays durch.
    1. Führen Sie eine PCA auf den integrierten Daten mit RunPCA durch.
    2. Bestimmen Sie die optimale Anzahl an Hauptkomponenten (PCs) für die nachfolgende Analyse, indem Sie die kumulierte erklärte Varianz berechnen. Identifizieren Sie den Ellenbogenpunkt programmatisch (z. B. der Punkt, an dem die kumulierte Varianz 90 % überschreitet und der marginale Zuwachs unter 0,1 % fällt), mithilfe des Codes in 3_IntegrationAndClustering.R, Zeilen 36–38. Die resultierende Anzahl an PCs wird im Folgenden als pc.use bezeichnet.
    3. Führen Sie RunUMAP mit dims = 1:pc.use durch.
    4. Clustern Sie die Zellen mithilfe von FindNeighbors mit dims = 1:pc.use und FindClusters mit resolution = 0,5. Passen Sie die Auflösung nur an, nachdem Sie die Stabilität der Cluster und die Kohärenz der Marker-Gene überprüft haben.
    5. Führen Sie eine differentielle Expressionsanalyse zwischen Zielgruppen (z. B. „B1_colon_d14“ im Vergleich zu „A1_colon_d0“) mithilfe der Funktion FindMarkers durch.
      ​HINWEIS: Visueller Kontrollpunkt: Bei einer erfolgreichen Integration zeigt das UMAP-Diagramm eine geeignete Durchmischung der Proben, während biologisch unterschiedliche Cluster erhalten bleiben.
  4. Identifizieren Sie räumlich variable Gene.
    1. Führen Sie für jede ursprüngliche Probe FindSpatiallyVariableFeatures mit der Methode „moransi“ auf dem „SCT“-Assay durch, um die räumliche Autokorrelation zu berechnen.

5. Vorverarbeitung von Einzelzell-Referenzdaten (4_scDataPreProcessing.R)

  1. Lesen Sie die Single-Cell-RNA-seq-Zählmatrix mithilfe von Read10X ein und erstellen Sie ein Seurat-Objekt.
  2. Führen Sie die standardmäßige Qualitätskontrolle, Normalisierung und Clusterung durch.
    1. Berechnen Sie den Anteil der mitochondrialen Reads (percent.mt) und filtern Sie Zellen (z. B. nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
    2. Normalisieren Sie die Daten mithilfe von SCTransform, wobei vars.to.regress = "percent.mt" festgelegt wird.
    3. Führen Sie PCA, UMAP und die Clusterung der Zellen unter Verwendung der in Schritt 4.3.2 beschriebenen dynamischen PC-Auswahlmethode durch.
  3. Bezeichnen Sie die Zelltypen.
    1. Berechnen Sie die Modulwerte für kanonische Marker-Gene der Zelltypen mithilfe von AddModuleScore.
    2. Bezeichnen Sie die Cluster basierend auf den Modulwerten und dem bekannten biologischen Hintergrund. Alternativ importieren Sie vorab berechnete Annotationen aus den Metadaten.

6. Referenzgeführte Dekonvolution mit SPOTlight (5_SPOTlight_Deconv.R)

  1. Bereiten Sie die Daten für SPOTlight vor.
    1. Konvertieren Sie das annotierte Einzelzell-Seurat-Objekt und das räumliche Seurat-Objekt in SingleCellExperiment-Objekte.
    2. Log-normalisieren Sie die Einzelzelldaten mithilfe von logNormCounts.
  2. Führen Sie die SPOTlight-Dekonvolution durch.
    1. Identifizieren Sie hypervariable Gene (HVGs) in den Einzelzell-Daten mithilfe von modelGeneVar und getTopHVGs.
    2. Berechnen Sie die markergene für Zelltypen mithilfe von scoreMarkers und filtern Sie nach hochwertigen Markern (z. B. mean.AUC > 0,8).
    3. Reduzieren Sie die Anzahl der Zellen im Einzelzell-Referenzdatensatz für jeden Zelltyp auf eine überschaubare Größe (z. B. 50 Zellen), um die Rechenzeit zu verkürzen.
    4. Führen Sie die Dekonvolution mit der SPOTlight-Funktion aus, wobei weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster" und gene_id = "gene".
  3. Visualisieren und exportieren Sie die Ergebnisse.
    1. Extrahieren Sie die Dekonvolutionsresultat-Matrix (Anteile der Zelltypen pro Spot).
    2. Verwenden Sie plotSpatialScatterpie, um die zelluläre Zusammensetzung anhand der räumlichen Koordinaten darzustellen.
    3. Fügen Sie die Dekonvolutionsergebnisse der Metadaten des räumlichen Seurat-Objekts mithilfe von AddMetaData hinzu. Erwartetes Ergebnis: eine Dekonvolutionsmatrix mit Spalten für die Anteile der Zelltypen pro räumlichem Spot, räumliche Scatterpie-Diagramme, die die lokale zelluläre Zusammensetzung zeigen, sowie ein Seurat-Objekt, das die Dekonvolutionsanteile als Metadaten enthält.

7. Referenzfreie Dekonvolution mit STdeconvolve (7_STdeconvolve.R)

  1. Bereiten Sie die räumlichen Daten vor.
    1. Extrahieren Sie die rohe Zählmatrix aus dem räumlichen Seurat-Objekt mithilfe von GetAssayData mit slot = "counts".
    2. Entfernen Sie Spots und Gene von geringer Qualität mithilfe von cleanCounts aus STdeconvolve (z. B. min.lib.size = 100).
  2. Identifizieren Sie die latenten Zelltypen.
    1. Filtern Sie den Korpus weiter nach Genen, die in einem minimalen Anteil der Spots exprimiert werden, mithilfe von restrictCorpus (z. B. removeAbove=1.0, removeBelow = 0.05).
    2. Passen Sie ein Latent Dirichlet Allocation (LDA)-Modell über einen Bereich möglicher Themenanzahlen (K) an (z. B. Ks = seq(2, 9, by = 1)) mithilfe von fitLDA.
    3. Wählen Sie das optimale Modell basierend auf der minimalen Perplexität mithilfe von optimalModel mit opt = "min".
  3. Analysieren und visualisieren Sie die Ergebnisse.
    1. Extrahieren Sie die Anteile der Zelltypen (Themen) (theta) und die Genprofile (beta) aus dem optimalen Modell mithilfe von getBetaTheta.
    2. Um die biologische Interpretation der entfalteten Themen zu unterstützen, importieren Sie Region-of-interest-(ROI-)Annotationen, die mit dem Werkzeug „Select Spatial Spots“ erstellt wurden (siehe Schritt 9.3.3). Verwenden Sie diese Annotationen als Parameter „groups“ in der Funktion vizAllTopics, um die entfalteten Anteile der Zelltypen zurück auf die räumlichen Koordinaten abzubilden und die Spots entsprechend ihrer ROI einzufärben. Dieser Schritt ist optional.
      HINWEIS: Erwartete Ausgabe: STdeconvolve sollte theta-Werte zurückgeben, die die Themenanteile pro Spot darstellen, sowie beta-Werte, die die Genprofile für jedes Thema repräsentieren. Falls Nutzer die unüberwachten STdeconvolve-Ergebnisse quantitativ mit den referenzgeführten SPOTlight-Ausgaben (aus Schritt 6) vergleichen möchten, können sie beide Anteile-Matrizen (theta aus STdeconvolve und die SPOTlight-Matrix) exportieren und pro Spot Korrelations- oder Konkordanzmaße (z. B. Pearson- oder Spearman-Korrelation) mithilfe gängiger R-Funktionen berechnen. Ein quantitativer Vergleich zwischen SPOTlight und STdeconvolve ist optional und nicht erforderlich, um den Kernablauf auszuführen; die entsprechenden Ausgabematrizen sind jedoch aus den Schritten 6.3.1 und 7.3.1 verfügbar, falls Nutzer eine solche Analyse durchführen möchten.

8. Räumliche Zell-Zell-Kommunikation mithilfe von Giotto (8_Giotto_Communication.R)

  1. Konvertieren Sie das Seurat-Objekt in ein Giotto-Objekt.
    1. Verwenden Sie die Funktion createGiottoObject, und geben Sie die Matrix der rohen Zählungen und die räumlichen Koordinaten an.
  2. Verarbeiten Sie das Giotto-Objekt vor und fügen Sie die Ergebnisse der Deconvolution hinzu.
    1. Normalisieren Sie die Daten mithilfe von normalizeGiotto.
    2. Fügen Sie die Zelltyp-Annotationen (z. B. den Hauptzelltyp aus der SPOTlight-Deconvolution) den Zell-Metadaten mithilfe von addCellMetadata hinzu.
  3. Schließen Sie auf räumlich informierte Zell-Zell-Kommunikation.
    1. Erstellen Sie ein räumliches Netzwerk mithilfe von createSpatialNetwork mit method = "Delaunay" und name = "Delaunay_network".
    2. Laden Sie eine Ligand-Rezeptor-Datenbank in die R-Umgebung. Stellen Sie sicher, dass das geladene Objekt als Datenrahmen mit zwei separaten Spalten formatiert ist, die die Gen-Symbole für Ligand und Rezeptor repräsentieren (z. B. ein vorab zusammengestelltes Maus-Netzwerk von Zenodo: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, Version v6, veröffentlicht am 7. April 2025).
    3. Führen Sie exprCellCellcom mit cluster_column = "celltype_major" aus, um signifikante Ligand-Rezeptor-Interaktionen zwischen Zelltypen, die räumlich benachbart sind, zu identifizieren. Erwartete Ausgabe: eine Ergebnistabelle mit Ligand-Rezeptor-Paaren, Kombinationen von Quell- und Zielzelltypen, log2-Fold-Change-Werten und adjustierten p-Werten; behalten Sie signifikante Interaktionen (z. B. p.adj < 0,05) zur Visualisierung bei.

9. Interaktive Spot-Auswahl mit selektiven räumlichen Spots (6_SelectSpatialSpots.R)

  1. Bereiten Sie die Daten für das interaktive Tool vor.
    1. Extrahieren Sie die räumlichen Koordinaten aus dem Seurat-Objekt mithilfe von GetTissueCoordinates.
  2. Formatieren und exportieren Sie die Daten.
    1. Formatieren Sie den Koordinaten-Datenrahmen so, dass er genau die Spaltenüberschriften CELL_ID, X und Y enthält.
    2. Exportieren Sie den formatierten Datenrahmen in eine CSV-Datei.
  3. Führen Sie die Analyse des Interessenbereichs (ROI) durch.
    1. Starten Sie die benutzerdefinierte Dash-Anwendung Select Spatial Spots und laden Sie die CSV-Datei.
    2. Wählen Sie interaktiv Stellen basierend auf ihrem räumlichen Standort aus.
    3. Exportieren Sie die Liste der ausgewählten Stellen und ihrer zugeordneten Gruppen-/ROI-Bezeichnungen als neue CSV-Datei. Erwartetes Ergebnis: eine CSV-Datei mit Spot-Identifikatoren, X/Y-Koordinaten und zugeordneten Gruppen-/ROI-Bezeichnungen, die über CELL_ID wieder dem Seurat-Objekt zugeordnet werden können.

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Ergebnisse

Implementierung des Arbeitsablaufs und Datenintegration veranschaulichen wichtige Gewebemerkmale

Der rechnergestützte Arbeitsablauf wurde an räumlichen Transkriptomikdaten der Mauskolon angewandt, um die erwarteten Ergebnisse in den einzelnen analytischen Phasen zu veranschaulichen. Wie im schematischen Arbeitsablauf dargestellt (Abbildung 1) begann die Analysepipeline mit der Datenerfassung und Qualitätskontrolle, wobei räumliche Merkmalsdarstell...

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Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen umfassenden rechnergestützten Arbeitsablauf für die Analyse von Daten der räumlichen Transkriptomik, der analytische Tiefe mit praktischer Zugänglichkeit in Einklang bringt. Der schrittweise Ansatz führt Forschende durch die gesamte analytische Pipeline, von der anfänglichen Datenerfassung bis hin zu fortgeschrittenen räumlichen Analysen, und betont dabei kritische Entscheidungspunkte und mögliche Fallstricke.

Mehrere Schritte im Protokoll erfordern besondere Aufm...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Die Autoren danken den Entwicklern und Betreuern der Pakete Seurat, Giotto und SPOTlight für deren Unterstützung und Dokumentation. Die Beiträge öffentlicher Datenarchivdienste und der Forschenden, die großzügig ihre Datensätze geteilt haben, werden ebenfalls dankbar anerkannt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ggplot2Posit Software, PBCv4.0.0(CRAN)Erweiterte Datenvisualisierung
GiottoDries Labv4.2.2 (GitHub)Analysen räumlicher Netzwerke und zellulärer Kommunikation
patchwork Thomas Lin Pedersenv1.3.2 (CRAN)Erstellung und Anordnung von Diagrammen
R software R Foundation for Statistical Computingv4.4.3Kern-Ausführungsumgebung (macOS aarch64)
scaterDavis McCarthy et al.v1.34.1 (Bioconductor)Qualitätskontrolle und Visualisierung von Einzelzell-Daten
scranAaron Lun et al.v1.34.0 (Bioconductor)Modellierung der Einzelzell-Varianz und Markererkennung
Select Spatial Spots (Benutzerdefiniertes Python-Tool)LeafLightv1.0.0 (GitHub)Interaktive Auswahl räumlicher Regionen von Interesse (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat Satija Labv5.3.0 (CRAN)Vorverarbeitung, Integration und Clustering räumlicher Daten
SeuratObject Satija Labv5.2.0 (CRAN)Datenstrukturen für Einzelzell- und räumliche Daten
SingleCellExperimentBioconductor Core Teamv1.28.1 (Bioconductor)Standardisierter Datencontainer für scRNA-seq
SPOTlightMarc Elosua-Bayes et al.v1.10.0 (Bioconductor)Referenzgeführte räumliche Dekonvolution
StdeconvolveJean Fan Labv1.3.2 (Bioconductor)Unüberwachtes latentes Thema-Modellieren
tidyversePosit Software, PBCv2.0.0 (CRAN)Grundlegende Werkzeuge zur Datenmanipulation und -formatierung

Referenzen

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  2. Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.
  3. Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.
  4. Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933
  5. Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.
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