Ein praktischer Workflow zur Analyse von räumlichen Transkriptomik-Daten: Von der Datenerfassung bis zu fortgeschrittenen Analysen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Analyse von räumlichen Transkriptomik-Daten vor und führt die Nutzer von der öffentlichen Datenerfassung und der Seurat-basierten Qualitätskontrolle über Integration, Detektion räumlicher Merkmale, Dekonvolution von Zelltypen, Annotation von Regionen von Interesse bis hin zur Analyse der Zell-Zell-Kommunikation, mit praktischen Kontrollpunkten, die eine transparente Durchführung unterstützen.

Zusammenfassung

Die räumliche Transkriptomik (ST) erfasst den genomweiten Genexpressionsstatus unter Erhaltung des zweidimensionalen räumlichen Kontexts von mRNA-Molekülen in Gewebeschnitten und ermöglicht somit Untersuchungen zur Gewebearchitektur und der biologischen Mikroumgebung. Die Analyse von ST-Daten bleibt jedoch herausfordernd, da der Dateneinlesen, die Qualitätskontrolle, Integration, Deconvolution, räumliche Statistik und Visualisierung oft mehrere Softwareumgebungen sowie reproduzierbare Parameterentscheidungen erfordern. Dieses Protokoll stellt einen praktischen rechnergestützten Arbeitsablauf für öffentliche ST-Datensätze in R vor, beginnend mit der Datenerfassung und Software-Installation und fortlaufend über das datenbasierte Laden mittels Seurat, Qualitätskontrolle, Normalisierung, Integration mehrerer Proben, Clusterung und Analyse räumlich variabler Gene. Anschließend werden ergänzende Deconvolution-Strategien angewandt, einschließlich der referenzgeführten SPOTlight-Analyse und des unüberwachten Topic-Modeling mittels STdeconvolve, gefolgt von der Analyse räumlicher Zell-Zell-Kommunikation basierend auf Giotto sowie der interaktiven Auswahl von Interessenbereichen (ROI) mithilfe einer benutzerdefinierten Python-Dash-Anwendung. Durch Betonung der skriptbasierten Ausführung, expliziter Begründungen der Parameter, erwarteter Ergebnisse und Fehlersuche-Punkte bietet das Protokoll einen anpassbaren Rahmen für Standard-Array-basierte ST-Datensätze und verwandte Plattformen nach Evaluierung datensatz- und plattformspezifischer Parameter.

Einleitung

Die räumliche Transkriptomik (ST) ist eine bahnbrechende Technologiefamilie, die die genomweite Genexpression misst und dabei die räumlichen Koordinaten von Boten-RNA-(mRNA-)Molekülen in Gewebeschnitten erhält. Zu den ST-Methoden zählen sequenzbasierte Ansätze, die positionskodierte Arrays nutzen, sowie in situ-Abbildungsverfahren, die transkriptionelle Signale in intakten Gewebemikroumgebungen kartieren^1,2. Durch die Erhaltung des räumlichen Kontexts ermöglicht die ST die Analyse der Gewebearchitektur, der Organisation zellulärer Nachbarschaften, der Zell-Zell-Kommunikation sowie mikroumgebungsbedingter biologischer Prozesse, die nach einer Gewebedissoziation nicht vollständig aufgeklärt werden können³.

Das schnelle Wachstum öffentlicher ST-Datenrepositorys hat beispiellose Möglichkeiten für sekundäre Analysen und die Entwicklung neuer Methoden eröffnet³. Ressourcen wie die CROST-Datenbank stellen Hunderte räumlich aufgelöster transkriptomischer Datensätze aus mehreren Arten und Technologieplattformen zusammen, während spezialisierte Sammlungen wie STOmicsDB sich auf bestimmte Methoden wie Stereo-seq konzentrieren^4,5. Trotz des reichhaltigen Datenangebots bleibt die computergestützte Analyse aufgrund der Komplexität räumlicher Datenstrukturen, der Vielfalt analytischer Werkzeuge und der technischen Hürden bei der Implementierung reproduzierbarer Workflows eine Herausforderung^{6,7,8,9,10,11}.

Um die Einschränkungen der Abhängigkeit von einer einzelnen Softwareumgebung zu überwinden, wird hier ein integrierter rechnergestützter Workflow vorgestellt, der komplementäre Analysewerkzeuge nutzt. Zu den bestehenden umfassenden ST-Analyse-Ökosystemen gehören hauptsächlich Seurat, Giotto und auf Python basierende Frameworks wie Squidpy^6,7,12. Obwohl Python-basierte Tools wie Squidpy umfangreiche Funktionen für die Analyse räumlicher Graphen bieten, minimiert die Zusammenfassung der primären rechnergestützten Pipeline in einer einzigen Programmierumgebung technische Hürden zwischen verschiedenen Sprachen. Daher wird die Kern-Pipeline hauptsächlich in R implementiert, um solche sprachübergreifenden technischen Schwierigkeiten zu verringern. In diesem auf R basierenden Workflow wird Seurat für das Dateneinlesen, die Qualitätskontrolle, die Normalisierung, die Dimensionsreduktion, die Visualisierung und die Integration mehrerer Proben verwendet, was dessen verbreitete Anwendung in Einzelzell- und räumlichen Transkriptomik-Analysen widerspiegelt. Anschließend wird Giotto für den Aufbau räumlicher Netzwerke und die Analyse der zell-zu-Zelle-Kommunikation auf Basis von Ligand-Rezeptor-Interaktionen eingesetzt. Dadurch verbindet dieser Workflow die auf Seurat basierende Vorverarbeitung und Integration mit der auf Giotto basierenden räumlichen Analyse, wobei der Datenaustausch zwischen den beiden Werkzeugsets explizit und reproduzierbar bleibt.

Innerhalb dieses Rahmens werden zwei komplementäre Dekonvolutionsstrategien angewendet: SPOTlight, eine referenzgeführte Methode, die scRNA-seq-Daten verwendet, um die Anteile der Zelltypen zu schätzen, und STdeconvolve, eine unüberwachte Topic-Modellierungsmethode, die latente transkriptionelle Muster identifiziert^8,11. Die Ergebnisse liefern komplementäre Einblicke in die räumliche zelluläre Heterogenität, werden jedoch nicht als quantitative Kreuzvalidierung betrachtet, es sei denn, der Nutzer führt die optionale in diesem Protokoll beschriebene Konkordanzanalyse durch. Eine benutzerdefinierte Python-Dash-Anwendung, Select Spatial Spots, ist zur interaktiven Annotation von Regionen von Interesse (ROI) integriert und erzeugt standardmäßige, koordinatenbasierte Annotationsdateien, die in nachfolgenden downstream-Analysen verwendet werden können.

Hinsichtlich der praktischen Anwendbarkeit richtet sich dieser Arbeitsablauf hauptsächlich an Standard-Array-basierte ST-Daten (z. B. Visium mit 55 µm Auflösung) und kann nach Bewertung der Parameter auf andere Gewebetypen übertragen werden. Vor der Analyse sind wichtige Einschränkungen zu berücksichtigen. Erstens hängt das referenzgeführte Deconvolution-Modul von einem hochwertigen, gewebematchenden scRNA-seq-Referenzdatensatz ab. Zweitens erfordern subzelluläre oder nahezu einzellbasierte Plattformen möglicherweise eine angepasste Vorverarbeitung, räumliche Bündelung der Bin oder bildbasierte Zellsegmentierung vor der Integration². Der repräsentative Datensatz der Mauskolon dient als Demonstrationsbeispiel, um zu zeigen, wie der Arbeitsablauf räumliche Domänen und markerdefinierte Gewebestrukturierung bewerten kann, und nicht als Nachweis allgemeiner Plattformkompatibilität.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll analysierten biologischen Datensätze sind öffentlich verfügbar und ausschließlich zu Demonstrationszwecken verwendet worden. Spezifische Datenzugriffsnummern und Quellarchive werden in den entsprechenden Schritten angegeben. Die ursprünglichen Datensätze wurden von den jeweiligen Forschern unter Einhaltung der institutionellen ethischen Richtlinien, die für jede Quellstudie galten, erstellt. Siehe die Tabelle der Materialien, um alle erforderlichen Software- und R-Paketversionen zu überprüfen.

Hardware-Anforderungen: Der erforderliche Rechenspeicher für diesen Arbeitsablauf skaliert mit der Anzahl der analysierten Proben und Spot-Positionen. Für einen typischen Datensatz der räumlichen Transkriptomik (z. B. etwa 3.000 Spots pro Probe über bis zu drei Proben hinweg) ist eine Standard-Workstation mit mindestens 16 GB RAM ausreichend, um die Analyse-Pipeline auszuführen. Es wird jedoch dringend empfohlen, über 32 GB RAM oder mehr zu verfügen, um eine optimale Leistung und Stabilität sicherzustellen, insbesondere bei rechenintensiven Schritten wie der SCTransform-Normalisierung und der Matrixfaktorisierung während der Dekonvolution.

1. Datenerfassung und Vorbereitung der Verzeichnisstruktur

1. Öffentliche räumliche Transkriptomik-Datensätze beschaffen (z. B. GEO-Zugangsnummer GSE169749, Einreichungsdatum 26. März 2021, letzte Aktualisierung 6. März 2022) sowie Referenzdaten aus der Einzelzell-RNA-Seq (z. B. GEO-Zugangsnummer GSE264408, Einreichungsdatum 19. April 2024, letzte Aktualisierung 10. Dezember 2024).
2. Laden Sie das Archiv mit den Rohdaten (z. B. GSE169749_RAW.tar) aus dem Repository herunter und entpacken Sie es.
   HINWEIS: Für den repräsentativen Datensatz, der in diesem Protokoll verwendet wird, enthält das extrahierte Verzeichnis mehrere Dateien pro Probe, wobei die Dateinamen in der Regel die GEO-Probennummer (z. B. GSM5213483) enthalten.
3. Ordnen Sie die Dateien in einer standardisierten Verzeichnisstruktur an, die mit Seurat kompatibel ist. Load10X_Spatial Funktion.
   1. Erstellen Sie ein Hauptdatenverzeichnis (z. B. ./data/).
   2. Erstellen Sie ein dediziertes Unterverzeichnis für jede Probe (z. B. ./data/sample_A1/).
   3. Übertragen (kopieren oder verschieben) Sie die folgenden wesentlichen Dateien für jede Probe in das jeweilige Unterverzeichnis.
      1. Platzieren Sie das filtered_feature_bc_matrix.h5 in das Hauptunterverzeichnis der Probe übertragen
      2. Erstellen Sie eine räumlich/ Unterordner innerhalb jedes Probendverzeichnisses.
      3. Platzieren Sie die folgenden Dateien in die räumlich/ Unterordner: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz und tissue_hires_image.png.gz.
   4. Entpacken Sie die .gz Dateien in der räumlich/ Ordner. Stellen Sie sicher, dass die ursprünglichen Dateinamen genau so bleiben, wie sie von der Load10X_Spatial Funktion (z. B., tissue_positions_list.csv).
      HINWEIS: Die endgültige, geordnete Struktur für eine reibungslose Beladung muss diesem Muster folgen, am Beispiel der Probe A1:
      ./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. Einrichtung der Softwareumgebung

1. R (Version 4.4.3 oder höher) installieren.
2. Die Analyse-Skripte (1_ReadSpatialData.R bis 8_Giotto_Communication.R) aus dem GitHub-Repository (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow, Commit-Hash 2d85e18 zur Reproduzierbarkeit) beschaffen.
3. Die erforderlichen R-Pakete von CRAN und Bioconductor installieren, indem das Skript setup.R ausgeführt wird.
   ANMERKUNG: Eine umfassende Liste der spezifischen Paketversionen, die in diesem Workflow verwendet wurden, ist in der Tabelle der Materialien enthalten und ebenfalls in der Datei session_info.txt im zugehörigen GitHub-Repository verfügbar (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow).
4. Die Giotto Suite installieren, indem die Installationsbefehle aus der offiziellen Dokumentation ausgeführt werden.
   1. Zur offiziellen Installations-URL navigieren, um die Setup-Skripte abzurufen: https://giottosuite.com/articles/installation.html
   2. Die erforderliche Python-Umgebung und Systemabhängigkeiten gemäß der schrittweisen Anleitung initialisieren.
5. Zusätzliche Pakete für verbesserte Visualisierung installieren.
   1. Ausführen: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
6. Das benutzerdefinierte Werkzeug Select Spatial Spots installieren. Sicherstellen, dass das Betriebssystem Windows, macOS oder Linux ist und Python-Version 3.8 oder höher installiert ist. Dieser Schritt ist optional.
   1. Das Werkzeug beschaffen, indem zum GitHub-Repository navigiert wird (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots, Commit-Hash d20946e zur Reproduzierbarkeit) und der Quellcode heruntergeladen wird.
   2. Ins Verzeichnis des Werkzeugs wechseln und die Python-Abhängigkeiten installieren: pip install -r requirements.txt
7. Das Paket glmGamPoi installieren, indem BiocManager::install("glmGamPoi") ausgeführt wird, um die SCTransform-Normalisierung zu beschleunigen.
   ANMERKUNG: Der Kern-Workflow erfordert nur die in den Schritten 2.1–2.3 und 2.6 aufgeführten Pakete. Das Paket Rfast2 wird verwendet, um die Berechnung der Moran's-I-Statistik zu beschleunigen. Die optionalen Pakete in Schritt 2.5 dienen der Erstellung publikationsreifer Diagramme mit einem Prism-Stil (ggprism) und dem Zugriff auf eine farbenblindenfreundliche Farbpalette (colorBlindness). Das Werkzeug in Schritt 2.6 ermöglicht die interaktive Auswahl von Spots. Den Befehl sessionInfo() ausführen und die vollständige Konsolenausgabe in einer Textdatei speichern. Dadurch werden die exakten Softwareversionen und Paketabhängigkeiten dokumentiert, was für die langfristige Reproduzierbarkeit entscheidend ist.

3. Laden räumlicher Daten und Qualitätskontrolle (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

1. Laden Sie die räumlichen Daten in Seurat-Objekte ein.
   1. Verwenden Sie Read10X_Bild um das hochauflösende Gewebebild manuell zu laden und dabei das image.dir und image.name
   2. Verwenden Load10X_Spatial mit dem Bild Parameter auf das in Schritt 3.1.1 erstellte Bildobjekt gesetzt, um das Seurat-Objekt zu erstellen.
2. Berechnen Sie die Qualitätskontrollkennzahlen.
   1. Berechnen Sie den Prozentsatz der mitochondrialen Reads mithilfe von ProzentanteilMerkmalsmenge mit dem Muster ^mt-.
3. Visualisieren und interpretieren Sie die Daten basierend auf QC-Metriken.
   1. Erzeugen Sie Violin-Plots von nCount_Spatial, nFeature_Spatial, und Prozent.mt unter Verwendung von VlnPlot.
   2. Erstellen Sie räumliche Merkmalsplots dieser Metriken unter Verwendung von SpatialFeaturePlot um Spots außerhalb des Gewebebereichs zu identifizieren.
      HINWEIS: Visueller Kontrollpunkt: Außerhalb des Gewebebereichs liegende Flecken weisen typischerweise niedrige UMI-Zahlen auf (nCount_Spatial < 500) und geringe Gen-Detektion (nFeature_Spatial < 200)
   3. Zur Demonstration werden Filter angewendet, um Spots von geringer Qualität zu entfernen (z. B. subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). Dies ist ein optionaler Schritt.
      HINWEIS: Das primäre Ziel der Qualitätskontrolle (QC) in der räumlichen Transkriptomik besteht darin, technische Artefakte zu identifizieren und zu annotieren, beispielsweise Spots außerhalb des Gewebes. Für die Demonstrationsdaten des Visium-Darmgewebes gilt nFeature_Spatial > 200 und nCount_Spatial > 500 entfernen von Spots mit geringer Komplexität/Hintergrund. Bei Geweben mit niedrigem RNA-Gehalt oder degradierten Schnitten die Violin- und räumlichen Merkmalsplots überprüfen, bevor Schwellenwerte erhöht werden; bei dichten oder hoch-UMI-Geweben können strengere Schwellenwerte angemessen sein. Eine Filterung allein basierend auf hohen Expressionswerten sollte vermieden werden, es sei denn, Doppelzellen, Gewebefalten oder eindeutige Artefakte sind sichtbar. Eine Filterung wird häufig nicht empfohlen, da sie räumliche Positionen physisch entfernt, was die Kontinuität der Gewebestruktur für nachfolgende räumliche Analysen stören könnte.

4. Daten-Vorverarbeitung, Integration und Clustering (3_IntegrationAndClustering.R)

1. Normalisieren und vorverarbeiten Sie einzelne Proben.
   1. Wenden Sie die SCTransform-Normalisierung separat auf jede Probe mit Assay = Spatial an.
2. Integrieren Sie mehrere Proben.
   1. Bereiten Sie die Liste der SCT-normalisierten Objekte zur Integration vor. Stellen Sie sicher, dass jedes Objekt über einen „RNA“-Assay verfügt, indem Sie den „Spatial“-Assay kopieren: spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Spatial"]]
      ​HINWEIS: Das Kopieren des „Spatial“-Assays in einen standardmäßigen „RNA“-Assay-Platz dient als notwendiger Workaround, um die Kompatibilität mit nachgelagerten Integrationsfunktionen sicherzustellen, die ursprünglich für Einzelzell-Seurat-Objekte entwickelt wurden.
   2. Verwenden Sie SelectIntegrationFeatures und PrepSCTIntegration, um gemeinsam variable Merkmale zu identifizieren.
   3. Finden Sie Integrationsanker mithilfe von FindIntegrationAnchors mit normalization.method = "SCT".
   4. Integrieren Sie die Daten mithilfe von IntegrateData mit normalization.method = "SCT".
3. Führen Sie eine Dimensionsreduktion und Clusterung des integrierten Assays durch.
   1. Führen Sie eine PCA auf den integrierten Daten mit RunPCA durch.
   2. Bestimmen Sie die optimale Anzahl an Hauptkomponenten (PCs) für die nachfolgende Analyse, indem Sie die kumulierte erklärte Varianz berechnen. Identifizieren Sie den Ellenbogenpunkt programmatisch (z. B. der Punkt, an dem die kumulierte Varianz 90 % überschreitet und der marginale Zuwachs unter 0,1 % fällt), mithilfe des Codes in 3_IntegrationAndClustering.R, Zeilen 36–38. Die resultierende Anzahl an PCs wird im Folgenden als pc.use bezeichnet.
   3. Führen Sie RunUMAP mit dims = 1:pc.use durch.
   4. Clustern Sie die Zellen mithilfe von FindNeighbors mit dims = 1:pc.use und FindClusters mit resolution = 0,5. Passen Sie die Auflösung nur an, nachdem Sie die Stabilität der Cluster und die Kohärenz der Marker-Gene überprüft haben.
   5. Führen Sie eine differentielle Expressionsanalyse zwischen Zielgruppen (z. B. „B1_colon_d14“ im Vergleich zu „A1_colon_d0“) mithilfe der Funktion FindMarkers durch.
      ​HINWEIS: Visueller Kontrollpunkt: Bei einer erfolgreichen Integration zeigt das UMAP-Diagramm eine geeignete Durchmischung der Proben, während biologisch unterschiedliche Cluster erhalten bleiben.
4. Identifizieren Sie räumlich variable Gene.
   1. Führen Sie für jede ursprüngliche Probe FindSpatiallyVariableFeatures mit der Methode „moransi“ auf dem „SCT“-Assay durch, um die räumliche Autokorrelation zu berechnen.

5. Vorverarbeitung von Einzelzell-Referenzdaten (4_scDataPreProcessing.R)

1. Lesen Sie die Single-Cell-RNA-seq-Zählmatrix mithilfe von Read10X ein und erstellen Sie ein Seurat-Objekt.
2. Führen Sie die standardmäßige Qualitätskontrolle, Normalisierung und Clusterung durch.
   1. Berechnen Sie den Anteil der mitochondrialen Reads (percent.mt) und filtern Sie Zellen (z. B. nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
   2. Normalisieren Sie die Daten mithilfe von SCTransform, wobei vars.to.regress = "percent.mt" festgelegt wird.
   3. Führen Sie PCA, UMAP und die Clusterung der Zellen unter Verwendung der in Schritt 4.3.2 beschriebenen dynamischen PC-Auswahlmethode durch.
3. Bezeichnen Sie die Zelltypen.
   1. Berechnen Sie die Modulwerte für kanonische Marker-Gene der Zelltypen mithilfe von AddModuleScore.
   2. Bezeichnen Sie die Cluster basierend auf den Modulwerten und dem bekannten biologischen Hintergrund. Alternativ importieren Sie vorab berechnete Annotationen aus den Metadaten.

6. Referenzgeführte Dekonvolution mit SPOTlight (5_SPOTlight_Deconv.R)

1. Bereiten Sie die Daten für SPOTlight vor.
   1. Konvertieren Sie das annotierte Einzelzell-Seurat-Objekt und das räumliche Seurat-Objekt in SingleCellExperiment-Objekte.
   2. Log-normalisieren Sie die Einzelzelldaten mithilfe von logNormCounts.
2. Führen Sie die SPOTlight-Dekonvolution durch.
   1. Identifizieren Sie hypervariable Gene (HVGs) in den Einzelzell-Daten mithilfe von modelGeneVar und getTopHVGs.
   2. Berechnen Sie die markergene für Zelltypen mithilfe von scoreMarkers und filtern Sie nach hochwertigen Markern (z. B. mean.AUC > 0,8).
   3. Reduzieren Sie die Anzahl der Zellen im Einzelzell-Referenzdatensatz für jeden Zelltyp auf eine überschaubare Größe (z. B. 50 Zellen), um die Rechenzeit zu verkürzen.
   4. Führen Sie die Dekonvolution mit der SPOTlight-Funktion aus, wobei weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster" und gene_id = "gene".
3. Visualisieren und exportieren Sie die Ergebnisse.
   1. Extrahieren Sie die Dekonvolutionsresultat-Matrix (Anteile der Zelltypen pro Spot).
   2. Verwenden Sie plotSpatialScatterpie, um die zelluläre Zusammensetzung anhand der räumlichen Koordinaten darzustellen.
   3. Fügen Sie die Dekonvolutionsergebnisse der Metadaten des räumlichen Seurat-Objekts mithilfe von AddMetaData hinzu. Erwartetes Ergebnis: eine Dekonvolutionsmatrix mit Spalten für die Anteile der Zelltypen pro räumlichem Spot, räumliche Scatterpie-Diagramme, die die lokale zelluläre Zusammensetzung zeigen, sowie ein Seurat-Objekt, das die Dekonvolutionsanteile als Metadaten enthält.

7. Referenzfreie Dekonvolution mit STdeconvolve (7_STdeconvolve.R)

1. Bereiten Sie die räumlichen Daten vor.
   1. Extrahieren Sie die rohe Zählmatrix aus dem räumlichen Seurat-Objekt mithilfe von GetAssayData mit slot = "counts".
   2. Entfernen Sie Spots und Gene von geringer Qualität mithilfe von cleanCounts aus STdeconvolve (z. B. min.lib.size = 100).
2. Identifizieren Sie die latenten Zelltypen.
   1. Filtern Sie den Korpus weiter nach Genen, die in einem minimalen Anteil der Spots exprimiert werden, mithilfe von restrictCorpus (z. B. removeAbove=1.0, removeBelow = 0.05).
   2. Passen Sie ein Latent Dirichlet Allocation (LDA)-Modell über einen Bereich möglicher Themenanzahlen (K) an (z. B. Ks = seq(2, 9, by = 1)) mithilfe von fitLDA.
   3. Wählen Sie das optimale Modell basierend auf der minimalen Perplexität mithilfe von optimalModel mit opt = "min".
3. Analysieren und visualisieren Sie die Ergebnisse.
   1. Extrahieren Sie die Anteile der Zelltypen (Themen) (theta) und die Genprofile (beta) aus dem optimalen Modell mithilfe von getBetaTheta.
   2. Um die biologische Interpretation der entfalteten Themen zu unterstützen, importieren Sie Region-of-interest-(ROI-)Annotationen, die mit dem Werkzeug „Select Spatial Spots“ erstellt wurden (siehe Schritt 9.3.3). Verwenden Sie diese Annotationen als Parameter „groups“ in der Funktion vizAllTopics, um die entfalteten Anteile der Zelltypen zurück auf die räumlichen Koordinaten abzubilden und die Spots entsprechend ihrer ROI einzufärben. Dieser Schritt ist optional.
      HINWEIS: Erwartete Ausgabe: STdeconvolve sollte theta-Werte zurückgeben, die die Themenanteile pro Spot darstellen, sowie beta-Werte, die die Genprofile für jedes Thema repräsentieren. Falls Nutzer die unüberwachten STdeconvolve-Ergebnisse quantitativ mit den referenzgeführten SPOTlight-Ausgaben (aus Schritt 6) vergleichen möchten, können sie beide Anteile-Matrizen (theta aus STdeconvolve und die SPOTlight-Matrix) exportieren und pro Spot Korrelations- oder Konkordanzmaße (z. B. Pearson- oder Spearman-Korrelation) mithilfe gängiger R-Funktionen berechnen. Ein quantitativer Vergleich zwischen SPOTlight und STdeconvolve ist optional und nicht erforderlich, um den Kernablauf auszuführen; die entsprechenden Ausgabematrizen sind jedoch aus den Schritten 6.3.1 und 7.3.1 verfügbar, falls Nutzer eine solche Analyse durchführen möchten.

8. Räumliche Zell-Zell-Kommunikation mithilfe von Giotto (8_Giotto_Communication.R)

1. Konvertieren Sie das Seurat-Objekt in ein Giotto-Objekt.
   1. Verwenden Sie die Funktion createGiottoObject, und geben Sie die Matrix der rohen Zählungen und die räumlichen Koordinaten an.
2. Verarbeiten Sie das Giotto-Objekt vor und fügen Sie die Ergebnisse der Deconvolution hinzu.
   1. Normalisieren Sie die Daten mithilfe von normalizeGiotto.
   2. Fügen Sie die Zelltyp-Annotationen (z. B. den Hauptzelltyp aus der SPOTlight-Deconvolution) den Zell-Metadaten mithilfe von addCellMetadata hinzu.
3. Schließen Sie auf räumlich informierte Zell-Zell-Kommunikation.
   1. Erstellen Sie ein räumliches Netzwerk mithilfe von createSpatialNetwork mit method = "Delaunay" und name = "Delaunay_network".
   2. Laden Sie eine Ligand-Rezeptor-Datenbank in die R-Umgebung. Stellen Sie sicher, dass das geladene Objekt als Datenrahmen mit zwei separaten Spalten formatiert ist, die die Gen-Symbole für Ligand und Rezeptor repräsentieren (z. B. ein vorab zusammengestelltes Maus-Netzwerk von Zenodo: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, Version v6, veröffentlicht am 7. April 2025).
   3. Führen Sie exprCellCellcom mit cluster_column = "celltype_major" aus, um signifikante Ligand-Rezeptor-Interaktionen zwischen Zelltypen, die räumlich benachbart sind, zu identifizieren. Erwartete Ausgabe: eine Ergebnistabelle mit Ligand-Rezeptor-Paaren, Kombinationen von Quell- und Zielzelltypen, log2-Fold-Change-Werten und adjustierten p-Werten; behalten Sie signifikante Interaktionen (z. B. p.adj < 0,05) zur Visualisierung bei.

9. Interaktive Spot-Auswahl mit selektiven räumlichen Spots (6_SelectSpatialSpots.R)

1. Bereiten Sie die Daten für das interaktive Tool vor.
   1. Extrahieren Sie die räumlichen Koordinaten aus dem Seurat-Objekt mithilfe von GetTissueCoordinates.
2. Formatieren und exportieren Sie die Daten.
   1. Formatieren Sie den Koordinaten-Datenrahmen so, dass er genau die Spaltenüberschriften CELL_ID, X und Y enthält.
   2. Exportieren Sie den formatierten Datenrahmen in eine CSV-Datei.
3. Führen Sie die Analyse des Interessenbereichs (ROI) durch.
   1. Starten Sie die benutzerdefinierte Dash-Anwendung Select Spatial Spots und laden Sie die CSV-Datei.
   2. Wählen Sie interaktiv Stellen basierend auf ihrem räumlichen Standort aus.
   3. Exportieren Sie die Liste der ausgewählten Stellen und ihrer zugeordneten Gruppen-/ROI-Bezeichnungen als neue CSV-Datei. Erwartetes Ergebnis: eine CSV-Datei mit Spot-Identifikatoren, X/Y-Koordinaten und zugeordneten Gruppen-/ROI-Bezeichnungen, die über CELL_ID wieder dem Seurat-Objekt zugeordnet werden können.

Ergebnisse

Implementierung des Arbeitsablaufs und Datenintegration veranschaulichen wichtige Gewebemerkmale

Der rechnergestützte Arbeitsablauf wurde an räumlichen Transkriptomikdaten der Mauskolon angewandt, um die erwarteten Ergebnisse in den einzelnen analytischen Phasen zu veranschaulichen. Wie im schematischen Arbeitsablauf dargestellt (Abbildung 1) begann die Analysepipeline mit der Datenerfassung und Qualitätskontrolle, wobei räumliche Merkmalsdarstellungen die Gewebegrenzen abgrenzten (Abbildung 2A,B). Anschließend wurde der auf Anker basierende Integrationsablauf von Seurat verwendet, um technische Batch-Effekte zu reduzieren, gleichzeitig aber biologisch interpretierbare Variationen beizubehalten. UMAP-Darstellungen zeigten die Ausrichtung der Proben und räumliche Clustermuster nach der Integration (Abbildung 2C,D). Die quantitative, dynamische Auswahl der Hauptkomponenten (PCs) basierend auf der kumulativen Varianz wurde implementiert, um die Dimensionsreduktion und die nachfolgende Clusterung zu steuern (siehe ergänzende Abbildung 1). Die Analyse der Marker-Gen-Heatmap zeigte unterschiedliche transkriptionelle Profile, die den räumlichen Clustern zugrunde liegen (Abbildung 2E).

Um zu beurteilen, ob die rechnergestützten Cluster mit der bekannten anatomischen Architektur der Kolonhistologie übereinstimmten, wurden die Expressionsprofile kanonischer, schichtspezifischer Marker gene analysiert. Die Mukosa-Epithelschicht zeigte Expression von Epithelzellmarkern wie Epcam und Krt8 sowie des Becherzellmarkers Muc2. Mesenchymale und stromale Marker wie Col1a1 und Vim kennzeichneten die Lamina propria und submuköse Regionen, während die äußere Muscularis propria-Schicht durch strukturelle Gene der glatten Muskulatur wie Acta2 und Tagln angezeigt wurde. Die räumliche Beschränkung dieser linienassoziierten Marker stützt die Interpretation, dass der Integrations- und Clusterungsworkflow die wesentlichen histologischen Schichtungen des kolorektalen Gewebes entlang der Mukosa-zur-Muskularis-Achse erhalten hat (siehe Supplementary Figure 2).

Nach der Cluster-Validierung wurde eine nachgeschaltete differentielle Expressionsanalyse durchgeführt, um differentiell exprimierte Gene (DEGs) zwischen experimentellen Bedingungen zu identifizieren (Abbildung 2F,G). Darüber hinaus wurden räumlich variable Gene mithilfe der Moran's-I-Statistik identifiziert, wodurch Gene mit einer signifikanten, nicht zufälligen räumlichen Verteilung im Gewebe hervorgehoben wurden (Abbildung 2H).

Zelluläre Entmischung und räumliche Interaktionsnetzwerke offenbaren die mikroskopische Gewebestruktur

Die Verarbeitung der Single-Cell-RNA-seq-Referenzdaten ergab Annotationen, die durch QC-Filterung (Abbildung 3A), unüberwachtes Clustering (Abbildung 3B), Validierung mittels Marker-Genen (Abbildung 3C) und Übereinstimmung mit unabhängigen Annotationen (Abbildung 3D) gestützt wurden. Die zelluläre Zusammensetzung (Abbildung 3E) diente als Grundlage für die Strategie der Downsampling zur Deconvolution. SPOTlight schätzte die referenzgeleiteten Anteile der Zelltypen über die räumlichen Spots hinweg (Abbildung 4A,B), während STdeconvolve eine unüberwachte, auf Topic-Modelling basierende Darstellung räumlicher zellulärer Muster lieferte (Abbildung 5B). Das benutzerdefinierte Werkzeug „Select Spatial Spots“ bot histologischen Kontext für diese Muster (Abbildung 5A). Schließlich identifizierte die Analyse räumlicher Kommunikation mittels der deconvolutierten Zelltyp-Zuweisungen Ligand-Rezeptor-Interaktionen zwischen räumlich benachbarten Gruppen von Zelltypen (Abbildung 6A,B).

Problembehandlungshinweise aus der Protokolloptimierung

Während der Protokolloptimierung wurden mehrere Probleme identifiziert, die praktische Kontrollpunkte ergaben. Suboptimale Entfaltungsergebnisse traten auf, wenn Einzelzell-Referenzen nicht gut zum Gewebekontext passten, was die Notwendigkeit unterstreicht, wenn verfügbar, gewebe- und artenspezifische scRNA-seq-Daten zu verwenden. Erste Clustering-Versuche mit Standardparametern lösten nicht immer die erwarteten biologischen Strukturen auf; die Überprüfung der PC-Auswahl, der Clustering-Auflösung und der Kohärenz von Markergenen half dabei, räumlich interpretierbare Domänen zu identifizieren, die mit der Gewebemorphologie übereinstimmten. Diese Beobachtungen liefern praktische Beispiele dafür, wie Anwender häufige analytische Probleme während der Durchführung des Workflows diagnostizieren können.

Abbildung 1: Workflow für die integrierte räumliche Transkriptomik-Analyse. Schematische Darstellung der analytischen Pipeline, von der Datenerfassung und Vorverarbeitung bis hin zu fortgeschrittenen räumlichen Analysen. Zu den wichtigsten Schritten gehören: (1) Dateneinlesen, Qualitätskontrolle und Integration mehrerer Proben mithilfe von Seurat; (2) Räumliche Clusterung und Identifizierung räumlich variabler Gene; (3) Zelltyp-Entmischung via referenzbasierte (SPOTlight) und unüberwachte (STdeconvolve) Methoden; (4) Analyse der räumlichen Zell-Zell-Kommunikation mit Giotto und interaktive Auswahl von Interessenbereichen (Regionen) mithilfe eines benutzerdefinierten Tools, Select Spatial Spots. Die Ergebnisse aller Module werden zusammengeführt, um biologische Erkenntnisse über die Gewebearchitektur und das zelluläre Mikroumfeld zu gewinnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Datenintegration, Clustering und differentielle Expressionsanalyse. (A,B) Qualitätskontrollmetriken für die räumlichen Proben A1 und B1, die die Verteilungen der Genanzahlen, UMI-Anzahlen und Anteile an mitochondrialen Genen zeigen. (C) UMAP-Darstellung integrierter räumlicher Transkriptomikdaten, eingefärbt nach Probenursprung (links) und Clustering-Identität (rechts). (D) Räumliche Projektion der Cluster-Identitäten auf Gewebeschnitte. (E) Heatmap der wichtigsten Markergene für jeden räumlichen Cluster. (F) Volcano-Plot, der die differentiell exprimierten Gene zwischen den Bedingungen A1_colon_d0 und B1_colon_d14 anzeigt. (G) Räumliche Expressionsmuster repräsentativer differentiell exprimierter Gene über die Gewebeschnitte hinweg. (H) Räumliche Expressionskarten der wichtigsten räumlich variablen Gene, identifiziert via Moran's I-Statistik, wobei die beiden linken Felder Gene aus der Probe A1_colon_d0 und die beiden rechten Felder Gene aus der Probe B1_colon_d14 zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Verarbeitung und Annotation von Einzelzell-Referenzdaten. (A) Qualitätskontrollkennzahlen für scRNA-seq-Referenzdaten vor und nach Filterung. (B) UMAP-Visualisierung der scRNA-seq-Daten, gefärbt nach unüberwachten Clustern. (C) Punktdiagramm, das die Expressionswerte kanonischer Marker-Gene für Zelltypen über die Cluster hinweg zeigt. (D) Annotierte UMAP-Visualisierung der scRNA-seq-Daten mit Bezeichnung der Hauptzelltypen. (E) Zelluläre Zusammensetzung des scRNA-seq-Referenzdatensatzes. Die gestrichelte rote Linie zeigt den Downsampling-Schwellenwert (n = 50 Zellen pro Typ), der während der SPOTlight-Dekonvolution angewendet wurde, um Recheneffizienz und Repräsentanz der Zelltypen auszugleichen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Räumliche Dekonvolution der zellulären Heterogenität. (A,B) Räumliche Streudiagramme aus der SPOTlight-Dekonvolution, die die anteilsmäßige Zusammensetzung der wichtigsten Zelltypen an jeder Position für die Proben A1 (A) und B1 (B) zeigen. (C) Repräsentative räumliche Verteilung von B-Zellen in den Proben A1 (links) und B1 (rechts), die die räumlich aufgelösten Lokalisierungsmuster einer spezifischen Immunzellpopulation darstellt, die durch Dekonvolution identifiziert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Interaktive Analyse von Interessenbereichen und Vergleich der unsupervidierten Dekonvolution. (A) Benutzeroberfläche des benutzerdefinierten Werkzeugs „Select Spatial Spots“, das die interaktive Auswahl von Bereichen zeigt, die dem proximalen Kolon, distalen Kolon und anderen Gewebebereichen entsprechen. (B) Räumliche Scatterpie-Darstellung der Ergebnisse der unsupervidierten Dekonvolution (STdeconvolve) für Probe A1, wobei die Spots entsprechend den manuell annotierten Bereichen aus (A) eingefärbt sind, was die Übereinstimmung zwischen histologiebasierten Annotationen und rechnerisch abgeleiteten Verteilungen der Zellthemen veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Räumlich informierte Zell-Zell-Kommunikationsnetzwerke. (A,B) Ligand-Rezeptor-Interaktionsnetzwerke, abgeleitet mittels Giotto für die Proben A1 (A) und B1 (B). Die Knoten repräsentieren Zelltypen, die Kanten signifikante Ligand-Rezeptor-Paare (FDR < 0,05), und die Dicke der Kanten entspricht der Interaktionsstärke. Um Vergleichbarkeit und Klarheit der Visualisierung sicherzustellen, wurde für alle Proben eine einheitliche Signifikanzschwelle (FDR < 0,05) angewandt, und jeweils die 20 stärksten Interaktionen, sortiert nach log2FC, für jede Bedingung dargestellt. Die Netzwerke verdeutlichen zelltypspezifische Kommunikationsmuster im räumlichen Kontext von Kolon-Gewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung S1: Quantitative Bewertung der Parameteroptimierung für die Dimensionsreduktion. Der Ellenbogenplot veranschaulicht den programmatischen Ansatz des Workflows zur dynamischen Auswahl der optimalen Anzahl an Hauptkomponenten (PCs). Die Auswahl wird basierend auf kumulativer Standardabweichung und Schwellenwerten für die marginale Varianz getroffen, die durch die rote vertikale Linie dargestellt sind, um biologische Varianz zu erfassen und gleichzeitig technisches Rauschen vor der nachgeschalteten Clusterung zu reduzieren.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S2: Validierung der räumlichen Clusterung mittels kanonischer, schichtspezifischer Marker des Colon. (A) Punktdiagramm, das die angereicherte Expression von epithelialen, stromalen und glattmuskulären Markern über die rechnerisch identifizierten Cluster zeigt. (B) Räumliche Darstellungen ausgewählter Marker (Epcam, Col1a1, Acta2) in Bezug auf die Gewebekoordinaten.Klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen umfassenden rechnergestützten Arbeitsablauf für die Analyse von Daten der räumlichen Transkriptomik, der analytische Tiefe mit praktischer Zugänglichkeit in Einklang bringt. Der schrittweise Ansatz führt Forschende durch die gesamte analytische Pipeline, von der anfänglichen Datenerfassung bis hin zu fortgeschrittenen räumlichen Analysen, und betont dabei kritische Entscheidungspunkte und mögliche Fallstricke.

Mehrere Schritte im Protokoll erfordern besondere Aufmerksamkeit, da sie erheblichen Einfluss auf nachfolgende Ergebnisse haben. Die Qualitätskontrolle und die Filtergrenzwerte sollten sorgfältig an spezifische Gewebetypen und Technologieplattformen angepasst werden, da übermäßig strenge Filterung biologisch relevante Stellen entfernen kann, während zu großzügige Grenzwerte technisches Rauschen einführen können. Die Wahl der Normalisierungsmethode beeinflusst signifikant die nachfolgenden Ergebnisse bezüglich Clustering und differentieller Expression. Beispielsweise verwendet die Pipeline SCTransform anstelle der Standard-Log-Normalisierung, da berichtet wurde, dass SCTransform technische Variationen im Zusammenhang mit Sequenziertiefe und anderen technischen Effekten in Einzelzell- und räumlichen Workflows modelliert und reduziert^14,15. Während der Integration erfordert die Auswahl der Integrationsmerkmale und Auflösungsparameter eine sorgfältige Abwägung, um die Integrationsstärke mit der Erhaltung des biologischen Signals in Einklang zu bringen. Für den Nachweis räumlich variabler Gene wurde Moran's I aufgrund seiner rechnerischen Skalierbarkeit und Eignung für die Analyse räumlicher Autokorrelation in arraybasierten Daten gewählt, obwohl alternative Methoden wie SPARK je nach Datensatzgröße und Studienzielen in Betracht gezogen werden können¹⁶.

Die Fehlerbehebungskomponente dieses Workflows konzentriert sich auf häufige Interoperabilitätsprobleme, die auftreten, wenn Ausgabedaten von einem Paket an das nächste weitergegeben werden. Anstatt auf einen einzigen generischen Konvertierungsschritt zu setzen, verwendet der Workflow maßgeschneiderte Formatkonvertierungen an jeder Software-Schnittstelle: Räumliche Zähldaten werden in einen standardmäßigen RNA-Assay-Slot kopiert, bevor die Seurat-Integration erfolgt; Seurat- und Single-Cell-Referenzobjekte werden in SingleCellExperiment-Objekte für SPOTlight umgewandelt; räumliche Zählmatrizen werden für STdeconvolve neu formatiert; aus Seurat abgeleitete Zähldaten, Koordinaten und Zelltyp-Metadaten werden in ein Giotto-Objekt konvertiert, um die Analyse der Zell-Zell-Kommunikation durchzuführen; und ROI-Anmerkungen aus Select Spatial Spots werden als CSV-Dateien mit CELL_ID, X/Y-Koordinaten und Gruppenbezeichnungen exportiert, damit sie zurück zum Seurat-Objekt zugeordnet werden können. Diese Schritte helfen Nutzern dabei, häufige Probleme zu erkennen und zu beheben, wie inkompatible Assay-Slots, nicht übereinstimmende Spot-Identifikatoren, fehlende Metadaten-Spalten, falsche Koordinatenformate und Diskrepanzen bei Ligand-Rezeptor-Gen-Symbolen.

Ein weiteres Merkmal dieses Workflows ist die Nutzung zweier komplementärer Dekonvolutionsstrategien anstelle der alleinigen Verwendung eines einzelnen Algorithmus. SPOTlight nutzt vorherige scRNA-seq-Referenzen zur referenzgeleiteten Schätzung der Zelltyp-Anteile, während STdeconvolve die referenzfreie Identifizierung latenter transkriptioneller Themen ermöglicht. Im Demonstrationsdatensatz korrelierten die STdeconvolve-Themen mit histologisch definierten Regionen (Abbildung 5B), was die biologische Interpretierbarkeit stützt. Ein direkter quantitativer Vergleich zwischen beiden Methoden wurde in diesem Protokoll nicht durchgeführt; Nutzer, die diese an ihren eigenen Daten vergleichen möchten, können dem in Protokollschritt 7.3.2 bereitgestellten Rahmen folgen. Darüber hinaus unterstützt das Protokoll Benutzerfreundlichkeit und Nachvollziehbarkeit, indem es Skripte für zentrale Funktionen verwendet und gleichzeitig eine grafische Benutzeroberfläche („Select Spatial Spots“) für eine intuitive Abgrenzung von interessierenden Bereichen (ROI) bereitstellt.

Durch die Verknüpfung von Seurat und Giotto kann der Arbeitsablauf die auf Seurat basierende Vorverarbeitung und Integration mit den auf Giotto basierenden räumlichen Statistiken und Netzwerkanalysen kombinieren. Seurat bietet eine etablierte Umgebung für Forscher mit Erfahrung in scRNA-seq und unterstützt die Integration mehrerer Proben, während die Übertragung der harmonisierten Daten in Giotto die Erstellung räumlicher Netzwerke und die Analyse von Ligand-Rezeptor-Interaktionen ermöglicht. Dieses Konzept erlaubt es den Nutzern, die dokumentierten Stärken beider Plattformen zu nutzen, ohne dass diese hier gegen Squidpy oder andere Frameworks evaluiert wurden. Für die Zell-Zell-Kommunikation wurde die auf dem Delaunay-Netzwerk basierende Ligand-Rezeptor-Interpretation von Giotto verwendet, da sie räumliche Nachbarschaftsbeziehungen innerhalb derselben Analyseumgebung berücksichtigt; Frameworks wie CellChat bieten umfangreiche Signalisierungsdatenbanken, werden jedoch in diesem Protokoll nicht bewertet¹⁷.

Mehrere Einschränkungen müssen berücksichtigt werden. Der referenzbasierte Dekonvolution-Ansatz hängt entscheidend von der Verfügbarkeit hochwertiger, passender Einzelzell-Referenzen ab. Darüber hinaus basieren die grundlegenden Annahmen hinter der Analyse von Zell-Zell-Kommunikation auf der Transkript-Koexpression als Stellvertreter für physikalische Proteininteraktionen, was eine anschließende experimentelle Validierung erforderlich macht. Schließlich wurde dieser Workflow hauptsächlich für standardmäßige Visium-Datensätze entwickelt. Da sich das Forschungsfeld hin zu Technologien mit nahezu Einzelzell-Auflösung wie Visium HD entwickelt, werden sich auch die analytischen Überlegungen ändern; Daten mit höherer Auflösung könnten andere Vorverarbeitungsparameter erfordern und die absolute Notwendigkeit einer Spot-Dekonvolution verringern. Um diesen Workflow für Visium-HD-Datensätze anzupassen, können die hochauflösenden Bins rechnerisch zu größeren räumlichen Bins zusammengefasst werden oder die Spot-Dekonvolutionsmodule können zugunsten einer bildbasierten Zellsegmentierung umgangen werden¹⁸.

Diese Merkmale deuten auf eine mögliche Anwendbarkeit in verschiedenen biologischen Bereichen hin, einschließlich der Entwicklungsbiologie, Neurowissenschaften, Krebsforschung und Immunologie^19,20,21,22. Das modulare Design ermöglicht es Forschenden, bestimmte Komponenten an ihre jeweiligen Anforderungen anzupassen, unabhängig davon, ob der Fokus auf der Identifizierung räumlicher Domänen, zellulärer Kommunikation oder regionaler Spezialisierung liegt. Da sich die räumlichen Technologien kontinuierlich weiterentwickeln und die Datensätze wachsen, bietet dieses Protokoll eine Grundlage, die erweitert werden kann, um neue analytische Methoden einzubeziehen und neu auftretende biologische Fragestellungen zu bearbeiten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ggplot2	Posit Software, PBC	v4.0.0(CRAN)	Erweiterte Datenvisualisierung
Giotto	Dries Lab	v4.2.2 (GitHub)	Analysen räumlicher Netzwerke und zellulärer Kommunikation
patchwork	Thomas Lin Pedersen	v1.3.2 (CRAN)	Erstellung und Anordnung von Diagrammen
R software	R Foundation for Statistical Computing	v4.4.3	Kern-Ausführungsumgebung (macOS aarch64)
scater	Davis McCarthy et al.	v1.34.1 (Bioconductor)	Qualitätskontrolle und Visualisierung von Einzelzell-Daten
scran	Aaron Lun et al.	v1.34.0 (Bioconductor)	Modellierung der Einzelzell-Varianz und Markererkennung
Select Spatial Spots (Benutzerdefiniertes Python-Tool)	LeafLight	v1.0.0 (GitHub)	Interaktive Auswahl räumlicher Regionen von Interesse (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat	Satija Lab	v5.3.0 (CRAN)	Vorverarbeitung, Integration und Clustering räumlicher Daten
SeuratObject	Satija Lab	v5.2.0 (CRAN)	Datenstrukturen für Einzelzell- und räumliche Daten
SingleCellExperiment	Bioconductor Core Team	v1.28.1 (Bioconductor)	Standardisierter Datencontainer für scRNA-seq
SPOTlight	Marc Elosua-Bayes et al.	v1.10.0 (Bioconductor)	Referenzgeführte räumliche Dekonvolution
Stdeconvolve	Jean Fan Lab	v1.3.2 (Bioconductor)	Unüberwachtes latentes Thema-Modellieren
tidyverse	Posit Software, PBC	v2.0.0 (CRAN)	Grundlegende Werkzeuge zur Datenmanipulation und -formatierung