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Methodenartikel

Besiedlung mit Murine pks+ Escherichia coli unter nicht-entzündlichen Bedingungen

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DOI:

10.3791/70204

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10. März 2026

 , 
1Nutrition and Microbiome Laboratory, Institut du Cancer de Montréal, Centre de recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM), 2Department of Medicine, Faculty of Medicine, Université de Montréal

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Besiedlung von Mäusen mit pks+ Escherichia coli unter nicht-entzündlichen Bedingungen sowie nicht-invasive Methoden zur Validierung der Kolonisierung und zur Bewertung der pks+ E. coli-Expansion im Kot.

Zusammenfassung

pks+ Escherichia coli wird zunehmend mit der Entwicklung von Darmkrebs (CRC) in Verbindung gebracht, insbesondere bei einer schnell wachsenden Teilgruppe jüngerer Patienten mit früh einsetzendem CRC. pks+ E. coli-Stämme produzieren das Genotoxin Colibactin, das dafür bekannt ist, Doppelstrang-DNA-Brüche und Mutationen in den Zellproliferations- und Differenzierungswegen, die mit CRC assoziiert sind, zu verursachen. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Besiedlung von pks+ E. coli bei Mäusen unter nicht-entzündlichen Bedingungen, von der Herstellung eines bakteriellen Inokulums bis zur Validierung der Kolonisierung. Nach der nächtlichen Inkubation wird der pks+ E. coli-Stamm E. coli NC101 antibiotika-konditionierten Mäusen mittels oraler Gavage verabreicht. Die Kolonisierung wird im Stuhl durch die Quantifizierung der Anzahl laktosefermentierender gramnegativer Koloniebildungseinheiten (CFUs) und durch quantitative PCR-Amplifikation bewertet. Mit diesem Protokoll wurde gezeigt, dass nach der erfolgreichen Besiedlung von C57BL/6-Mäusen mit E. coli NC101 die Supplementierung mit Ballaststoffen Inulin das Wachstum von pks+ E. coli förderte, was sich in einer erhöhten Erholung von CFUs, einer höheren Häufigkeit der Familie Enterobacteriaceae und erhöhten ClbP-Spiegeln widerspiegelt Gene. Zusammenfassend ermöglicht dieses Modell die Untersuchung präventiver und therapeutischer Behandlungen, die auf einen Schlüsselpathobionten abzielen, der an der Entwicklung von CRC beteiligt ist.

Einleitung

Die Darmmikrobiota ist dafür bekannt, eine bedeutende Rolle für die Gesundheit und Erkrankung des Wirts zu spielen, mit einer Darmmikrobieller Dysbiose oder einem Überwuchern bestimmter potenziell pathogener Bakterien (Pathobionten), die als Kennzeichen mehrerer Krankheitszustände identifiziert werden, darunter Herz-Kreislauf-Erkrankungen, entzündliche Darmerkrankungen (IBD) und Krebs1. pks+ Escherichia coli ist ein Pathobiont, der im Vergleich zu gesunden Personen mit Darmgewebeproben von Patienten mit IBD2 und Darmkrebs (CRC)3 angereichert ist. Die pro-tumorigene Aktivität von pks+ E. coli steht im Zusammenhang mit der Expression des Polyketidsynthase-(pks)-Genclusters und der Produktion des Genotoxins Colibactin4. Colibactin translokiert in den Kern der Kolonepithelzellen, was zur Bildung von Doppelsträng-DNA-Brüchen5 und Mutationen in wichtigen CRC-assoziierten Signalwegen6 führt. Die Kolonisierung von pks+ E. coli hat in präklinischen Modellen des colitis-assoziierten CRC (CAC) zur Tumorinitiation7 und Tumorprogression3 beigetragen. In jüngerer Zeit wurde eine durch Kolibactin induzierte Mutagenese mit früh einsetzendem CRC 8,9 assoziiert. Die Häufigkeit früh einsetzender CRC, die bei Personen unter 50 Jahren auftritt, ist in den letzten Jahrzehnten gestiegen, mit dem Potenzial, den aktuellen Gesamtrückgang der CRC-Raten9 umzukehren.

Die Rolle von pks+ E. coli bei der Entwicklung von CRC sowie in anderen mikrobiota-vermittelten Aspekten der Wirtsgesundheit wird weiterhin aufgeklärt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass mehrere Faktoren die PKS-Genexpression beeinflussen, darunter Entzündung10, luminale Eisenkonzentrationen11 und Ernährungsfaktoren12,13, was die Tür für mikrobiota-gezielte Interventionen öffnet. Hier wird eine Methode für die pks+ E. coli-Darmkolonisierung mittels oralem Gavage bei Mäusen beschrieben, wobei ein muriner Stamm des pks+ E. coli-Stamms NC101 (E. coli NC101) verwendet wird. Andere Modelle haben die Auswirkungen von E. coli NC101 auf Entzündung und Karzinogenese bei keimfreien (GF) Mäusen untersucht, die durch orale Gavage und rektalen Abstrich3 monokolonisiert wurden, in genetisch anfälligen (IL-10-//-) Modellen der Kolitis 3,14 sowie in chemisch induzierten Modellen der Darmentzündung und Störung der Darmbarriere15. Eine kostengünstige Besiedlung mit pks+ E. coli kann jedoch auch unter nicht-entzündlichen Bedingungen bei spezifisch-pathogenfreien (SPF) Mäusen erhalten werden, die mit Antibiotika vorbehandelt wurden, um eine Nische für Kolonisierung und Expansion zu schaffen 14,16,17. Verschiedene Methoden zur Detektion und Quantifizierung von pks+ E. coli im Mäusekot werden ebenfalls vorgestellt, darunter quantitative PCR-(qPCR)-Amplifikation des clbP-Gens, qPCR-Bewertung der Häufigkeit der Familie Enterobacteriaceae sowie die Rückgewinnung von koloniebildenden Einheiten (CFUs) auf MacConkey-Agarmedien, die spezifisch für gramnegative laktose-fermentierende Bakterien sind. Diese Methoden können austauschbar oder zusammen verwendet werden, um das Vorhandensein von pks+ E. coli und die Produktion von Colibactin zu Validierungszwecken zu bestätigen oder Unterschiede in der Expansion von pks+ E. coli als Reaktion auf mikrobiota-gezielte Interventionen zu bewerten.

Hier wird dieses Protokoll verwendet, um die Wirkung des Ballaststoff-Inulins auf die Kolonisierung und Expansion von pks+ E. coli mittels qPCR sowie die Wiederherstellung von CFUs zu bewerten. Inulin ist ein Präbiotikum, das nachweislich das Wachstum nützlicher Bifidobacterium- und Lactobacillus-Arten im Darm fördert sowie die Produktion von kurzkettigen Fettsäuren erhöht, die eine wichtige Rolle bei der intestinalen Homöostasespielen. Allerdings wurde gezeigt, dass Inulin auch das Wachstum von pks+ E. coli und Colibactinproduktion fördert, was in einem DSS-behandelten adenomatösen polyposis coli (Apc)Min/+ CRC-Modell zu einer erhöhten Tumorentstehung führt. Dieses Experiment bewertet die Expansion von pks+ E. coli als Reaktion auf diätetisches Inulin in einem Mausmodell ohne Entzündung oder eine beeinträchtigte Darmbarriere.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien des Canadian Council of Animal Care durchgeführt, nachdem das Institutional Animal Care Committee des Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) genehmigt worden war. Siebenwöchige Mäuse wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen und eine Woche vor Beginn des Experiments akklimatisiert. Eine schematische Darstellung dieser Methode ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Details der in dieser Studie verwendeten Tiere, Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

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Abbildung 1: Schaltplan der Herstellung und Kolonisierung von pks+ E.coli . Tag (D)-4: Vier Tage vor dem Gavage, Mäuse mit Antibiotika beginnen. D-1: 24 Stunden vor der Wandage, Antibiotika entfernen. Bereite die Pks+ E. coli-Kultur für die Übernachtung vor. D0: Bereite das pks+ E. coli bakterielle Inokulum vor. Geben Sie den Mäusen so bald wie möglich nach der Herstellung des Inokulums das pks+ E. coli oder eine Vehikelkontrolle (Kochsalzlösung) über orale Gavage. D7+ Sammelt Kot von Mäusen zur Erkennung und Quantifizierung der Pks+ E. coli-Kolonisierung . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Antibiotikabehandlung

  1. Verdünnen Sie Ampicillin, Colistin und Streptomycin in sterilem Trinkwasser auf eine Endkonzentration von 1 mg/mL für Ampicillin, 1 mg/mL für Colistin und 5 mg/mL für Streptomycin.
  2. Gewähren Sie drei Tage lang ad libitum Zugang zu Antibiotika im Trinkwasser.
  3. Entfernen Sie Antibiotika und stellen Sie den Zugang zu sterilem Wasser für eine 24-stündige Auswaschungsphase vor der Gabe mit E. coli NC101-Inokulum wieder her.
    HINWEIS: Für jedes Experiment sollte eine antibiotische Lösung frisch vorbereitet werden. Die ausreichende Aufnahme der Antibiotikumlösung sollte überwacht werden. Falls nötig, kann dem Wasser ein Süßungsmittel hinzugefügt werden.

2. Herstellung des E. coli NC101-Inokulums (bis n = 12 Mäuse)

HINWEIS: Die Schritte 2.1-2.8 sollten mit der aseptischen Technik durchgeführt werden.

  1. Bereiten Sie Lysogeny Broth (LB) vor und autoklavieren.
  2. Streak E. coli NC101 vom Glycerolmaterial auf eine LB-Agarplatte mit einer sterilen Inokulationsschleife. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  3. Inokulieren Sie 5 ml steriler LB-Brühe in einem Kulturröhrchen mit einer einzelnen Kolonie von der LB-Agarplatte mittels einer Inokulationsschleife. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C in einem Inkubationsshaker auf der Arbeitsplatte bei 150 U/min.
  4. Zentrifugiere das Kulturrohr bei 1500 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  5. Entfernen und entsorgen Sie das Überdachungsmittel, vermeiden Sie das bakterielle Pellet, das als cremefarbene Ablagerung am Rohrbasis erscheint.
  6. Das bakterielle Pellet in 5 ml 0,9 % steriler Kochsalzlösung wieder suspendieren.
  7. Waschen, indem du die Schritte 4 bis 6 wiederholst.
  8. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) mit einem Zelldichtemessgerät und stellen Sie die OD600 auf 0,625 (~1 x 108 CFUs/Maus) mit steriler Kochsalzlösung an.
    HINWEIS: Um in Schritt 3 keine bakterielle Kontamination der Brühe zu vermeiden, inkubieren Sie über Nacht ein separates Rohr mit 2–3 ml steriler LB-Brühe. Die Brühe sollte nach der Inkubation über Nacht klar bleiben, was darauf hindeutet, dass keine bakterielle Kontamination vorhanden ist. Wenn der Start-OD600 kleiner als 0,625 ist, wiederholen Sie die Schritte 4 bis 6 und verwenden Sie ein kleineres Volumen, um das Pellet wieder aufzuhängen. Um eine genaue Dosierung von E. coli NC101 sicherzustellen, sollten serielle Verdünnungen der Gavage-Flüssigkeit über Nacht angelegt und kultiviert werden. Die Anzahl der CFUs pro Verdünnung kann verwendet werden, um die anfängliche CFU-Menge in der bakteriellen Suspension abzuschätzen.

3. Orale Gavage von E. coli NC101

  1. Bewegen Sie das bakterielle Inokulum vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Bakterien sicherzustellen.
  2. Setze die Gavage-Nadel auf eine 1 ml Spritze und fülle sie mit 0,2 ml bakterielles Inokulum, um Luftblasen zu entfernen.
  3. Nehmen Sie die Maus aus dem Käfig und greifen Sie sanft, aber bestimmt mit dem Daumenpad und der Seite des Zeigefingers die Haut von knapp hinter den Ohren bis zu den Schulterblättern. Sichern Sie den Schwanz mit dem Mittel- oder Ringfinger derselben Hand.
  4. Halten Sie die Maus in aufrechter Position und führen Sie die Gavage-Nadel an die Seite des Mundes ein. Gleiten Sie mit dem Ende der Gavage-Nadel am Gaumen entlang und in Speiseröhre und Magen, schieben Sie sanft den Kopf der Maus zurück, um den Hals zu verlängern. Wenn Widerstand gespürt wird, entferne die Streunadel. Setze die Maus bei Bedarf erneut auf, bevor du es erneut versuchst.
  5. Langsam das bakterielle Inokulum (0,2 mL) injizieren und die Nadel herausziehen, im gleichen Winkel wie beim Einsetzen.
  6. Bring die Maus zurück in den Käfig und mach mit den übrigen Mäusen weiter.
    HINWEIS: Das bakterielle Inokulum sollte so bald wie möglich nach der Vorbereitung verabreicht werden. Kontrollmäuse sollten 0,2 mL 0,9 % sterile Kochsalzlösung (Vehikel) erhalten. Die angemessene Länge, das Gauge und der Kugeldurchmesser der Kurvennadel sollten anhand des durchschnittlichen Körpergewichts der Mäuse in jedem Experiment bestimmt werden. Überprüfen Sie das Atemmuster und die Aktivität der Maus nach 5 Minuten und vor dem Verlassen der Tieranlage. Wenn schwere Atmung oder Atemnot festgestellt wird, wird die Maus nach einem genehmigten Protokoll eingeschläfert. Orale Gavage sollte nur von geschultem Forschungspersonal durchgeführt werden. Eine unsachgemäße Durchführung der oralen Gavage kann zu schwerwiegenden Komplikationen oder Todesfällen durch Speiseröhrenperforation oder Injektion der Gavage-Flüssigkeit in die Lunge führen. Bei der Durchführung durch erfahrenes Forschungspersonal wird bei diesem Eingriff keine Sterblichkeit erwartet. Die für dieses Experiment verwendeten Mäuse sollten unter SPF-Bedingungen untergebracht werden. Um eine Kontamination zwischen den Käfigen zu verhindern, sollten einzeln belüftete Käfige verwendet werden, und Mäuse sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank gehandhabt werden. Vor dem Öffnen jedes Käfigs sollten die Hände und die Außenseite des Deckels mit einem geeigneten Desinfektionsmittel (z. B. beschleunigtem Wasserstoffperoxid) abgewischt werden. Die PSA-Anforderungen für die Handhabung von Mäusen, die in diesem Protokoll verwendet werden, umfassen einen Kittel (Einweg- oder Wiederverwendbarkeit) und Handschuhe. Zusätzliche PSA kann von der Gasttiereinrichtung erforderlich sein. Alle Manipulationen mit Kontrollmäusen sollten zuerst durchgeführt werden.

4. Entnahme von Fäkalienproben

  1. Sammeln Sie von jeder Maus ein Kotpellet in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, indem Sie die Maus wie in Schritt 3.3 beschrieben mit Nacktröhrchen berühren. Die Maus sollte sofort kacken. Alternativ kannst du die Maus in einen sauberen, leeren Käfig setzen und bis zu 30 Minuten auf Überlaufen warten.
  2. Frosten Sie die Probe ein, indem Sie das Röhrchen in flüssigen Stickstoff legen. Die Probe wird bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert.
    HINWEIS: Der Nachweis von clbA oder die Quantifizierung von clbP im Stuhl mittels Echtzeit-PCR sollte vor Beginn des Experiments durchgeführt werden, um zu überprüfen, dass Mäuse nicht mit pks+ E. coli kolonisiert sind. Um die Besiedlung über eine Woche hinaus aufrechtzuerhalten, kann wiederholtes bakterielles Gavage ohne Vorgabe von Antibiotika (Schritte 2.1–3.6) erforderlich sein, abhängig von den experimentellen Bedingungen. Die Quantifizierung von E. coli NC101 im Stuhl mittels CFU-Rückgewinnung oder Echtzeit-PCR sollte mindestens wöchentlich während des gesamten Experiments durchgeführt werden, wenn dieses Protokoll erstmals implementiert wird, um die Dosierungsfrequenz zu optimieren.

5. DNA-Extraktion von fäkalen Bakterien

  1. Extraktion von bakterieller DNA aus gesammelten Stuhlproben mit einem DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  2. Missen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer und stellen Sie die DNA-Konzentration auf 5 ng/μL an.

6. Bestätigung der Kolonisierung durch den Nachweis von clbA- und E. coli-16S-Genen

  1. Führen Sie eine gleichzeitige Amplifikation der clbA - und E. coli-16S-ribosomalen RNA-(rRNA)-Gene durch PCR durch PCR mit einem geeigneten Mastermix und Instrument für PCR gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  2. Visualisieren Sie clbA- und E. coli-16S-Gene in von E. coli NC101 kolonisierten Mäusen mittels Agarosegel-Elektrophorese, wie zuvor beschrieben19. Nicht kolonisierte Mäuse sollten das CLBA-Band nicht haben.

7. Quantifizierung von E. coli NC101 durch CFU-Rückgewinnung

HINWEIS: Führen Sie die Schritte 7.1-7.7 mit aseptischer Technik aus.

  1. Wiegen Sie ein leeres 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr.
  2. Geben Sie etwa 20 mg Stuhl in das 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr und zeichnen Sie das Gewicht des Rohrs mit der hinzugefügten Probe auf.
  3. Fügen Sie jedem Röhrchen 200 μL 0,9 % sterile Kochsalzlösung hinzu.
  4. Warten Sie 10–15 Minuten, bis die Stuhle bei Raumtemperatur weich werden, und lassen Sie jedes Rohr 5 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit vortexen, um eine homogene Suspension zu erhalten. Kleine Partikel unverdauten Nahrungsmittels werden sichtbar sein.
  5. Übertragen Sie 100 μL jeder Suspension in eine MacConkey-Agarplatte und verteilen Sie das Homogenat gleichmäßig mit einem L-förmigen Streuer.
  6. Die Platten über Nacht bei 37 °C bebrüten.
  7. Zähle die Anzahl der rosa Kolonien und normalisiere sie anhand des Gewichts jedes Kotpellets und des verplattenten Volumens.
    HINWEIS: MacConkey-Agar selektiert auf gramnegative Bakterien. Außerdem bilden Bakterien, die Laktose fermentieren können (wie E. coli), rosa Kolonien, während solche, die keine farblosen oder gelben Kolonien bilden können. Für die Zwecke dieses Protokolls sollten nur pinke Kolonien gezählt werden. Ist die Koloniezahl zu erhöht, um sie zu zählen, können serielle Verdünnungen des ursprünglichen Homogenats mit 0,9 % steriler Kochsalzlösung durchgeführt werden. Berücksichtigen Sie den Verdünnungsfaktor bei der Berechnung der Anzahl der Kolonien pro Probe.
    Pelletgewicht = Gewicht des Mikrozentrifugenrohrs mit der Pelletprobe – Gewicht des leeren Mikrozentrifugenrohrs.

8. Quantifizierung des clbP-Gens

  1. Führen Sie eine Amplifikation der clbP - und universellen 16S-rRNA-Gene durch (Ergänzungstabelle 1) durch quantitative PCR mit einem geeigneten Mastermix und Instrument für Echtzeit-PCR gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.

9. Quantifizierung von Enterobacteriaceae

  1. Führen Sie eine Amplifikation der Enterobacteriaceae - und universellen 16S-RNA-Gene (ergänzend) durch quantitative PCR mit einem geeigneten Master-Mix und Instrument für Echtzeit-PCR durch.

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Ergebnisse

Die Amplifikation und Visualisierung der clbA - und E. coli-16S-Gene in Fäkalien am Endpunkt mittels PCR und Gelelektrophorese zeigte, dass beide Gene zwar bei E. coli NC101-kolonisierten Mäusen sichtbar waren, jedoch nur das E. coli 16S-Gen bei Kontrollmäusen sichtbar war, was bestätigte, dass E. coli NC101 nicht vorhanden war (Abbildung 2B).

Wie erwartet zeigten 15 E. coli NC...

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Diskussion

Die pro-karzinogenen Effekte der colibactinproduzierenden pks+ E. coli wurden kürzlich sowohl mit dem Anstieg des früh einsetzenden CRC9 als auch mit der Einführung einer "westlichen" Diät12 in Verbindung gebracht – Faktoren, die die CRC-Trends in den kommenden Jahrzehnten weiterhin prägen werden. Die meisten Modelle der Kolonisierung von pks+ E. coli werden im Zusammenhang mit kolitisassoziiertem Krebs gezeigt, was die Ch...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Canadian Institutes of Health Research [CIHR, Fördermittel CSV-198232] finanziert. Wir danken der Tiereinrichtung des CRCHUM. Die Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % sterile KochsalzlösungBaxterJF7634
10% Inulin-SpezialdiätTekladTD.240286Repräsentative Ergebnisse
50 ppm FeS04 (Ballaststofffrei) individuelle DiätTekladTD.120515Repräsentative Ergebnisse
8-12 Wochen alte weibliche B6-MäuseCharles River LaboratoriesC57BL/6Repräsentative Ergebnisse 
Ampicillin-Natriumsalz Wisent Inc400-110 XG
TischzentrifugeFisher Scientific75004381
ZelldichtemesserBiochrom80-2116-30
Kulturröhre, 13 mlSarstedt62.515.006
EcNC101N/AN/AGestiftet von Dr. Christian Jobin, University of North Carolina at Chapel Hill 
Gavage-Nadel, 38 mm x 22 gHarvard-Apparat Kanada34-024Nicht mehr verfügbar – Eine mögliche Alternative ist bei Instech Labs (FTP-22-38) verfügbar;
Inkubierender orbitaler ShakerVWR980153
InokulationsschleifeFisher Scientific22-363-595
L-förmiger SpreizerFisher Scientific14-665-230
Lysogeniebrühe Wisent Inc800-060 LGFüge 35 g LB-Pulver hinzu, 1 Liter Wasser. Autoklaven vor der Benutzung.
Lysogenes Brühe agar Wisent Inc800-011 LGFüge 35 g LB-Pulver hinzu, 1 Liter Wasser. Autoklaven vor der Benutzung.
MacConkey agarBecton Dickinson211387Füge 50 g MacConkey-Pulver zu 1 Liter Wasser hinzu. Autoklav vor der Nutzung. 
Mikrobielles DNA-ExtraktionskitQiagen47016
Mikrobiologischer InkubatorFisher Scientific150152633
Mikrozentrifugenröhre, 1,5 mL UltiDent Wissenschaftlich73-M150-C
PCR-Rotor – Genstreifenröhren UltiDent Wissenschaftlich73-V100-RG
PetrischaleSarstedt82.1472.001
Echtzeit-PCR SYBR Green Master MixThermoFisher A25742
Echtzeit-PCR-WärmezyklusCorbett-ForschungRG-3000A
Schraubverschlussrohr, 15 mlSarstedt62.554.502
Natriumkolistimethat Fresenius KabiC309306
Streptomycin-SulfatsalzMillipore SigmaS9137
Tuberkulin-Schlupfrohr, 1 mlBecton Dickinson309659
VortexFisher Scientific12-812

Referenzen

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