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Forschungsartikel
Diese Studie verwendete 16S-rRNA-Sequenzierung, um die Darmmikrobiota bei gesunden Kontrollpersonen, unbehandelten PD-Patienten und mit Piribedil behandelten PD-Patienten zu vergleichen, und identifizierte Unterschiede in der mikrobiellen Zusammensetzung im Zusammenhang mit der Piribedal-Behandlung.
Diese Studie hatte zum Ziel, festzustellen, ob die Piribedil-Therapie die Darmmikrobiota von Parkinson-Patienten (PD) verändert, und bietet so eine theoretische Referenz zum Verständnis der durch Piribedil induzierten Veränderungen der Darmmikrobiota und deren potenziellen klinischen Implikationen. Die Fäkalproben wurden mittels 16S-Ribosomal-RNA (16S rRNA)-Gensequenzierung analysiert. Es wurden Vergleiche zwischen Patienten mit PD angestellt, die Piribedil einnahmen (Piribedil-Gruppe), Patienten mit PD, die kein Piribedil einnahmen (PD-Gruppe), und gesunden Kontrollpersonen (Blank-Gruppe). Im Vergleich zur Blankgruppe war die relative Häufigkeit von Staphylococcus, Rhodococcus und anderen Gattungen in der PD-Gruppe höher, während die relative Häufigkeit von Achromobacter und Delftia geringer war. Außerdem war die relative Häufigkeit von Achromobacter, Delftia und Stenotrophomonas in der Piribedil-Gruppe höher als in der PD-Gruppe, während die relative Häufigkeit von Staphylococcus, Rhodococcus und anderen Arten geringer war. Im Vergleich zu gesunden Personen zeigte die Darmmikrobiota von Patienten mit Parkinson signifikante Veränderungen. Die Darmmikrobiota von Patienten, die Piribedil einnehmen, unterscheidet sich deutlich von der unbehandelter Patienten. Diese Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen Piribedil und veränderter Darmmikrobiota bei Patienten mit PD hin.
Die Inzidenz der Parkinson-Krankheit (PD) nimmt allmählich zu; seine Ätiologie und Pathogenese sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Weitere Studien haben gezeigt, dass die Darmmikrobiota eng mit dem Beginn und der Entwicklung von PD zusammenhängt. Er et al.1dokumentierten, dass die Zusammensetzung der Darmmikrobiota bei Patienten mit PD von der gesunder Menschen abweicht und dass eine Zunahme von Darmpathogenen mit dem Beginn von PD verbunden sein kann. Scheperans et al.2bestätigten, dass die relative Häufigkeit von Prevotella und Bacteroides im Darm von Patienten mit PD verringert ist, und dass diese bakteriellen Gattungen eng mit der Funktion der Darmbarriere verbunden sind.
Mehrere Studien haben den Zusammenhang zwischen der Darmmikrobiota und PD untersucht. Forschungen legen nahe, dass Dysbiose eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie der PD spielen kann, indem sie motorische und nichtmotorische Symptome durch verschiedene Mechanismen, darunter Entzündungen und Stoffwechselstörungen,beeinflusst. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass medikamentöse Behandlungen für PD die Zusammensetzung des Darmmikrobiomsverändern 4,5, was das komplexe Zusammenspiel zwischen Medikamenten und dem Darmmikrobiom unterstreicht.
Als nicht-selektiver Dopaminrezeptor-Agonist ist Piribedil maßgeblich an der Behandlung von PD beteiligt; Es kann motorische Symptome bei Patienten verbessern, indem es Dopaminrezeptoren6 stimuliert. Seine klinische Anwendung wird jedoch oft durch Nebenwirkungen eingeschränkt, hauptsächlich durch gastrointestinale Symptome wie Übelkeit, Erbrechen und Bauchschmerzen7. Der zugrunde liegende Mechanismus dieser Nebenwirkungen bleibt unklar, und ob sie mit Veränderungen der Darmmikrobiota zusammenhängen, die durch Piribedil induziert werden, ist weiterhin unbekannt.
Der Zusammenhang zwischen der Darmmikrobiota und unerwünschten Arzneimittelreaktionen hat in den letzten Jahren zunehmendes Interesse geweckt. Hill-Burns et al.8analysierten das Darmmikrobiota bei Patienten mit PD und stellten fest, dass die Vielfalt der Darmmikrobiota mit der Reaktion auf die medikamentöse Therapie assoziiert ist. Zusätzlich können Dopaminagonisten die Darmmotilität und die mikrobielle Zusammensetzung9 beeinträchtigen. Man nimmt an, dass die Mechanismen hinter diesen Veränderungen Veränderungen im Darmtransportzeitpunkt betreffen, die wiederum die mikrobielle Vielfalt und Häufigkeit beeinflussen. Darüber hinaus kann die Darmmikrobiota die Medikamentenaufnahme und den Stoffwechselbeeinflussen, wodurch die Wirksamkeit und Nebenwirkungen dieser Medikamente beeinflusst werden. Es fehlt jedoch weiterhin an systematischer Forschung darüber, ob und wie Piribedil, ein häufig verwendeter Erreger für Parkinson, die Struktur des Darmmikrobiotas moduliert, sowie wie der Zusammenhang zwischen solchen mikrobiellen Verschiebungen und ihren gastrointestinalen Nebenwirkungen auftritt.
In der vorliegenden Studie verglichen wir die Struktur der Darmmikrobiota bei gesunden Kontrollen, unbehandelten PD-Patienten und PD-Patienten, die mit Piribedil behandelt wurden. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Behandlung mit Piribedil mit deutlichen Veränderungen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota bei Patienten mit PD assoziiert ist und dass diese mikrobiellen Veränderungen mit piribedilassoziierten gastrointestinalen Nebenwirkungen zusammenhängen könnten. Wir wollten spezifische mikrobielle Veränderungen identifizieren, die mit Piribedil assoziiert sind, und deren mögliche Assoziation mit gastrointestinalen Nebenwirkungen untersuchen, um so eine theoretische Grundlage für das Verständnis des Mechanismus piribedil-bedingter Nebenwirkungen zu schaffen.
Die Darmmikrobiota ist eine wichtige Richtung für die Forschung zur Pathogenese vonPD-11. Durch die Beobachtung der Auswirkungen von Piribedil auf die Darmmikrobiota bei Patienten mit PD trägt diese Studie dazu bei, die klinische Bedeutung medikamentenbedingter Veränderungen der Darmmikrobiota zu klären und bietet eine Referenz zur Optimierung der klinischen Anwendung und des Sicherheitsmanagements von Piribedil.
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Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Anhui University of Chinese Medicine geprüft (Ethik-Bewertungsnummer: 2025AH-101, ethisches Genehmigungsdatum: 02.07.2025).
Forschungsthemen
Patienten mit PD und gesunden Kontrollpersonen wurden im Ersten angeschlossenen Krankenhaus der Anhui University of Chinese Medicine aufgenommen. Frische Kotproben wurden für die Nachuntersuchung entnommen. Frische Kotproben wurden entnommen, in sterile EP-Röhrchen eingelagert, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend bei −80 °C zur Langzeitkonservierung gelagert. Die Einschlusskriterien für Patienten mit PD waren wie folgt: (1) klinisch diagnostizierte PD; (2) Alter >70 Jahre; (3) für die Piribedil-Gruppe: begann nach der Einschreibung mit der Piribedil-Monotherapie und hatte vorher keine Exposition mit diesem Medikament; für die PD-Gruppe: keine Behandlung mit Parkinson-Medikamenten; (4) keine anderen schwerwiegenden systemischen Erkrankungen wie schwere Herzkrankheiten, Lebererkrankungen, Nierenerkrankungen oder Krebs. Vor der Einschreibung wurde von jedem Teilnehmer eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt. Die Ausschlusskriterien waren wie folgt: (1) schwere Komplikationen der PD, wie schwere motorische Dysfunktion; (2) kürzlich eine antibiotische Behandlung erhalten hat; (3) das Vorhandensein anderer Gesundheitszustände, die die Studienergebnisse beeinflussen können, wie entzündliche Darmerkrankungen, Reizdarmsyndrom usw.; (4) allergisch gegen Piribedil. Die gesunden Kontrollpersonen (Leergruppe) waren altersangepasste Personen (Alter >70 Jahre) ohne neurologische oder schwere gastrointestinale Erkrankungen.
Alle Teilnehmer mussten vor der Einschreibung ihre regelmäßigen Ernährungsgewohnheiten beibehalten. Keiner hatte Probiotika, Präbiotika, Ballaststoffpräparate oder andere Nahrungsergänzungsmittel erhalten. Außerdem hatten alle Teilnehmer mindestens drei Monate vor der Probenentnahme keine Antibiotikabehandlung erhalten. Während der Studie wurde keine standardisierte Ernährungsintervention durchgeführt, aber alle Teilnehmer wurden angewiesen, einen stabilen Lebensstil und eine stabile Ernährung einzuhalten, um potenzielle störende Effekte auf die Darmmikrobiota zu minimieren.
Forschungsgruppen
Diese Studienkohorte wurde in drei Gruppen unterteilt: PD-Gruppe (n = 10): Stuhlproben, die von Parkinson-Patienten entnommen wurden, die kein Anti-Parkinson-Medikament einnahmen. Piribedil-Gruppe (n=10): Stuhlproben, die von Parkinson-Patienten nach 21 aufeinanderfolgenden Tagen Behandlung mit Piribedil (50 mg, zweimal täglich) entnommen werden. Blanke Kontrollgruppe (n=5): Kotproben von gesunden Personen.
16S-ribosomale RNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung erfolgte auf einer Sequenzierungsplattform, wie in anderen Studien berichtetwurde. 12,13. Kurz gesagt: Die totale mikrobielle DNA wurde aus Fäkalproben mit der Natriumdodecylsulfat-Methode (SDS) isoliert 14,15,16. Die Integrität der extrahierten DNA wurde durch 1 % Agarosegel-Elektrophorese überprüft, und die DNA-Konzentration sowie -Reinheit wurden mit einem Spektrophotometer bestimmt. Die hypervariable Region V3-V4 des bakteriellen 16S-rRNA-Gens wurde aus genomischer DNA mit degenerierten Primern 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') und 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') mit dem Polymerase-Chain Reaction (PCR)-Thermocycler amplifiziert. Die Amplifikation des bakteriellen 16S-rRNA-Gens erfolgte unter folgenden thermischen Bedingungen: ein anfänglicher Vordenaturierungsschritt bei 94 °C für 2 Minuten, gefolgt von 28 Zyklen mit 94 °C Denaturierung für 30 Sekunden, 55 °C Glühen für 30 Sekunden und 72 °C Verlängerung für 30 Sekunden. Eine letzte Verlängerung erfolgte bei 72 °C für 10 Minuten, und die Reaktion wurde dann bei 4 °C gehalten. Die PCR-Gemische enthalten 2× PCR-Mastermischung 25 μL, Vorwärtsprimer (10 μM) 2 μL, Rückwärtsprimer (10 μM) 2 μL, Template-DNA 10 ng und schließlich ddH2O bis 50 μL. PCR-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt. Die PCR-Gemische enthalten 2× PCR-Mastermischung 25 μL, Forward Primer (10 μM) 2 μL, Reverse Primer (10 μM) 2 μL, Template DNA 10 ng und schließlich ddH2Obis 50 μL. PCR-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde aus 2% Agarosegel extrahiert und mit einem Gel-Extraktionskit gereinigt. Das Universal Plus DNA Library Prep Kit für MGI V2 wurde verwendet, um die Bibliothek aufzubauen: (1) Splinter Link; (2) Verwendung von magnetischer Perlenabschirmung, um die selbstverbundenen Segmente der Verbindungen zu entfernen; (3) Anreicherung der Bibliotheksvorlagen durch PCR-Verstärkung; (4) Magnetperlen zur Rückgewinnung von PCR-Produkten; (5) Zyklisierung von PCR-Produkten. Nach der Bibliotheksvalidierung wurde die Sequenzierung durchgeführt.
Qualitätskontrollpunkte: Kontrollpunkt 1 (Probenentnahme): Die Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme eingefroren und bei −80°C gelagert. Jede Probe mit sichtbaren Anzeichen von Auftauen oder Kontamination wurde entsorgt. Checkpoint 2 (DNA-Extraktion): Akzeptable Reinheit: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 ≥1,8; Integrität bestätigt durch ein einzelnes hochmolekulares Gewichtsband auf 1 % Agarosegel. Checkpoint 3 (PCR-Amplifikation): Ein einzelnes Band bei ~460 bp auf 2% Agarosegel zeigt eine erfolgreiche Amplifikation an (Primer 341F/806R, V3-V4-Region); Fehlt oder es nicht spezifisch ist, passen Sie die Glühtemperatur oder die Schablenkonzentration an. Für die Bibliotheksvorbereitung war eine Wiederherstellungskonzentration ≥0,5 ng/μl erforderlich. Checkpoint 4 (Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung): Durchgeführt von der Sequenzierungseinrichtung nach ihren standardisierten validierten Protokollen; es wurde kein zusätzlicher interner Checkpoint (z. B. Bioanalyzer-Größen) angelegt.
Sicherheit und Abfallentsorgung: Handschuhe und Laborkittel wurden bei der gesamten Probenbehandlung getragen. Die Arbeitsflächen wurden mit 70 % Ethanol gereinigt. Alle kontaminierten Verbrauchsgüter (Spitzen, Schläuche, Gele) wurden vor der Entsorgung als biogefährlicher Abfall autoklaviert (121°C, 20 min).
Bioinformatik
Rohsequenzierungslesungen des 16S-rRNA-Gens wurden zunächst demultiplexiert, einer Qualitätsfilterung mit FASTP (Version 0.20.0) unterzogen und mit FLASH (Version 1.2.11) nach standardisierten Screeningkriterien zusammengesetzt. Kurz gesagt: (i) Rohsequenzen von 300 bp wurden gekürzt, als der durchschnittliche Qualitätswert innerhalb eines Schilling-Fensters von 50 bp unter 20 fiel. Lesungen mit abgekürzten Längen kürzer als 50 bp oder mit mehrdeutigen Basen wurden entfernt; (ii) Die Sequenzmontage wurde nur bei Überschneidungen von mehr als 10 bp durchgeführt, wobei das maximale Mismatch-Verhältnis des überlappenden Bereichs bei 0,2 festgesetzt wurde. Ungepaarte Lesungen, die nicht zusammengesetzt wurden, wurden entfernt; (iii) Einzelne Proben wurden anhand von Barcode- und Primer-Sequenzen für die spätere Orientierungsanpassung aufgeteilt. Das Barcode-Matching wurde mit exakter Ausrichtung durchgeführt, während das Primer-Matching maximal 2 Nukleotid-Fehlanpassungen erlaubte. 16S rRNA-Lesungen wurden mit der Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME)-Pipeline (Version 1.8.0)17 analysiert. Tag-Sequenzen wurden mit FLASH (Version 1.2.11)18 an gepaarte Endlesungen angehängt. Das Trimmen erfolgte mit UPARSE (Version 7.0.1090) mit einer Mindestlänge von 200 bp und einer durchschnittlichen Qualität von 25, gefolgt von einer Clusterung mit einem 97%igen Cutoff zur Erzeugung von operationellen taxonomischen Einheiten (OTUs)19. Repräsentative OTU-Werte wurden taxonomisch über RDP Classifier 2.2 klassifiziert, mit einer Konfidenzgrenze ≥0,6. Tag- und Lesehäufigkeiten wurden durch den Vergleich mit USEARCH Global20 bestimmt. Die Identifizierung chimärischer Sequenzen basierte auf Vergleichen mit der Gold-Datenbank unter Verwendung von UCHIME (v4.2.40)21. Die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) wurde anschließend auf dem sparsen Datensatz durchgeführt, der auf der Bray–Curtis-Disklikenz basiert, wobei die Sequenzähnlichkeitsschwelle für Clustering bei 97 % gesetzt wurde. Repräsentative OTUs und entsprechende taxonomische Profile wurden mit R-Software (Version 3.1.1) weiter analysiert. Der Algorithmus der linearen Diskriminantenanalyse (LEfSe), basierend auf der Effektgröße der linearen Diskriminantenanalyse (LDA), wurde angewandt, um Biomarker mit signifikanter unterschiedlicher Häufigkeit auf OTU-Ebene zu screenen. Diese Methode betont sowohl statistische Signifikanz als auch biologische Relevanz, indem zunächst Merkmale mit konsistenten Unterschieden zwischen den Gruppen identifiziert werden (unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests für den Vergleich mehrerer Gruppen) und anschließend die Effektgröße jedes unterschiedlich häufigen Merkmals mittels LDA geschätzt werden. Ein LDA-Wert >2,0 ist definiert als eine signifikant erhöhte Häufigkeitvon 22.
Statistische Methoden
Statistische Analysen wurden mit SPSS durchgeführt. Normalverteilte Daten wurden mittels der Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert. Daten, die nicht der Normalverteilung folgten, wurden mit dem Wilcoxon-Rangsummentest analysiert. Alle quantitativen Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler (SE) für Parameter angegeben, die einer Normalverteilung entsprechen, während nicht-normalverteilte Daten als Median mit Interquartilbereich präsentiert wurden. Ein p-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant.
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Mikrobielle Diversitätsunterschiede im Zusammenhang mit der Behandlung von Piribedil
Die Qualitätskontrollergebnisse der DNA-Extraktion (Konzentrationsbereich, Reinheit) sind in ergänzender Tabelle 1 aufgeführt. Die Qualitätskontrolle der PCR-Verstärkung (Bandgröße, Rückgewinnungskonzentrationen) ist in ergänzender Tabelle 2 dargestellt. Qualitätskontrollkennzahlen der Sequenzierung (Lesezahlen, Tiefe, Abdeckung) sind in
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Die Parkinson-Krankheit ist weltweit die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung, nur übertroffen von Alzheimer23. Seit 1970 wird Piribedil als Dopaminrezeptor-Agonist weit verbreitet zur Behandlung von PD24 eingesetzt. In der klinischen Praxis kann Piribedil jedoch einige Nebenwirkungen wie Übelkeit, Erbrechen und Magen-Darm-Beschwerden verursachen. Zunehmende Forschung zeigt, dass die Entwicklung der Parkinson-Krankheit sowie therapeu...
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Die Autoren stellen fest, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.
Diese Forschung wurde vom Anhui Province Academic Leader Reserve Candidate Funding Project (Nr. 2022H287), dem Anhui Province Hygiene and Health Outstanding Talents Project (Nr. ahsjhmypygc20230074), dem Anhui Provincial Scientific Research Project on Inheritance and Innovation of Traditional Chinese Medicine (2025CCCX017) sowie dem Special Project for Basic-Clinical Integration der Anhui University of Chinese Medicine (JCLCA2025009) unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2× Reaktionspuffer (Taq MasterMix) | Kangweii | CW0690 | |
| Agarose | (allgemein) | nicht anwendbar | Molekularbiologie-Grad |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Axygen Biosciences | (nicht angegeben) | |
| Tischzentrifuge mit Hochgeschwindigkeitsgefriervorrichtung | Hunan Kosei | GTR116C | |
| DNA-Extraktionsreagenzien (SDS, Phenol, Chloroform, Ethanol) | (allgemein) | nicht anwendbar | |
| DNBSEQ-G99 PE300 Sequenzierungsplattform | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| Gelelektrophorese-Apparatur | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Gel-Imaging-System | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| LEfSe Software | (Open Source) | Online-Version | |
| NanoDrop-Spektrophotometer | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| PCR-Gerät | Hangzhou Langji | A200 | |
| Piribedil | Servier | 6094078 | |
| Primer: 341F und 806R (synthetisiert) | (kundenspezifische Synthese) | nicht anwendbar | |
| QIIME Software | (Open Source) | http://qiime.org | Version 1.8.0 |
| Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS (Natriumdodecylsulfat) | (allgemein) | nicht anwendbar | |
| UPARSE Software | (Open Source) | http://drive5.com/uparse | Version 7.0.1090 |
| VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit für MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |