Kausaler Zusammenhang zwischen ischämischem Schlaganfall und vaskulärer Demenz: Eine Mendelsche Randomisierungsstudie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen reproduzierbaren Workflow für die zweistufige Mendelsche Randomisierung zur Bewertung des potenziellen kausalen Zusammenhangs zwischen ischämischem Schlaganfall und vaskulärer Demenz unter Verwendung öffentlich zugänglicher Zusammenfassungsstatistiken aus genomweiten Assoziationsstudien.

Zusammenfassung

Der ischämische Schlaganfall (IS) ist weltweit eine wesentliche Ursache für Behinderungen und Sterblichkeit, und die vaskuläre Demenz (VaD) ist eine häufige Demenzform, die mit zerebrovaskulären Schäden assoziiert ist. Beobachtungsstudien haben einen Zusammenhang zwischen IS und VaD nahegelegt, jedoch sind diese anfällig für Störfaktoren und umgekehrte Kausalität. Dieses Protokoll beschreibt einen reproduzierbaren zweistichprobenbasierten Mendelschen Randomisierungsansatz (MR) zur Bewertung eines möglichen kausalen Zusammenhangs zwischen IS und VaD unter Verwendung öffentlich zugänglicher Zusammenfassungsstatistiken aus genomweiten Assoziationsstudien (GWAS). Genetische Instrumente, die mit IS assoziiert sind, wurden aus einem öffentlichen GWAS-Datensatz extrahiert, und Assoziationen für das Outcome VaD wurden aus einem öffentlichen VaD-GWAS-Datensatz bezogen. Die entsprechenden Datensatz-IDs sind im Abschnitt „Protokoll“ angegeben. Nach der Outcome-Zuordnung und der Harmonisierung der Allele wurden 51 einzelne Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) für die endgültige MR-Analyse beibehalten. Der Arbeitsablauf umfasst die Auswahl der Instrumentvariablen, die Clustering-Analyse aufgrund von Kopplungsungleichgewicht, die Harmonisierung der Allele, die Beurteilung der Instrumentstärken, die gewichtete inverse Varianzanalyse (IVW), die gewichtete Median-Analyse, die MR-Egger-Analyse, die Prüfung auf Heterogenität, die Bewertung horizontaler Pleiotropie sowie eine Leave-one-out-Sensitivitätsanalyse. In der repräsentativen Analyse zeigte die IVW-Methode einen positiven Zusammenhang zwischen genetisch vorhergesagtem IS und dem VaD-Risiko, und die gewichtete Median-Methode lieferte ein in der Richtung übereinstimmendes Ergebnis. Die MR-Egger-Schätzung war in der Richtung konsistent, erreichte jedoch keine statistische Signifikanz. Die Befunde sollten daher als Hinweise auf einen möglichen kausalen Effekt verstanden werden, nicht jedoch als endgültiger Nachweis einer Kausalität. Dieses Protokoll kann Forschern helfen, einen transparenten und reproduzierbaren MR-Arbeitsablauf anzuwenden, um Ergebnisse im Zusammenhang mit zerebrovaskulären Erkrankungen mithilfe öffentlich zugänglicher GWAS-Daten zu untersuchen.

Einleitung

Der ischämische Schlaganfall (IS) ist weltweit eine der Hauptursachen für schwere Behinderungen und Todesfälle¹. Laut den neuesten Daten der Global Burden of Disease Study ist die globale Inzidenz des IS zurückgegangen, bleibt jedoch insbesondere in Osteuropa, Ostasien, Zentralasien und im subsaharischen Afrika eine erhebliche Belastung^2,3. Darüber hinaus steigt die Inzidenz des IS in Ländern mit einem niedrigen soziodemografischen Index (SDI), und es wird prognostiziert, dass sie von 2020 bis 2030 weiter ansteigen wird.

Zahlreiche epidemiologische Studien haben auf einen möglichen Zusammenhang zwischen zerebrovaskulären Erkrankungen und vaskulärer Demenz (VaD) hingewiesen^4,5. Insbesondere in China ist VaD eine der häufigsten Demenzformen bei älteren Menschen, und die hohe Prävalenz von IS steht in engem Zusammenhang mit dem Auftreten von VaD. Die meisten bisherigen Studien sind jedoch Beobachtungsstudien, und verbleibende Störfaktoren, umgekehrte Kausalität sowie Unterschiede in der Krankheitsdefinition können die kausale Interpretation einschränken. Daher sind zusätzliche analytische Ansätze erforderlich, um zu bewerten, ob IS möglicherweise an der Entstehung von VaD beteiligt ist.

IS kann den Beginn von VaD durch mehrere Mechanismen beeinflussen. Durch IS verursachte zerebrovaskuläre Schäden können zu einer unzureichenden zerebralen Perfusion und anschließenden neurodegenerativen Veränderungen führen⁶. Außerdem kann VaD mit chronischen zerebrovaskulären Verletzungen, Mikrogefäßerkrankungen und entzündlichen Reaktionen nach IS in Verbindung stehen^7,8. Daher ist die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen IS und VaD wichtig, um mögliche Krankheitsverbindungen zu verstehen und zukünftige Präventionsstrategien zu leiten.

Die Mendelsche Randomisierung (MR) ist eine analytische Methode, die genetische Varianten als instrumentelle Variablen verwendet, um mögliche kausale Zusammenhänge zwischen einer Exposition und einem Ergebnis zu bewerten⁹. Im Vergleich zu konventionellen Beobachtungsstudien kann die MR Störgrößen und Verzerrungen durch umgekehrte Kausalität unter gültigen Annahmen über instrumentelle Variablen reduzieren. Im Vergleich zu randomisierten kontrollierten Studien oder experimentellen Modellen kann die MR bereits vorhandene Zusammenfassungsstatistiken von genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) nutzen, um klinisch relevante Zusammenhänge zu untersuchen, wenn direkte Interventionsstudien nicht durchführbar, unethisch oder schwierig zu realisieren sind. Kürzlich durchgeführte genetische Studien, die auf Ansätzen der Mendelschen Randomisierung basieren, haben den Zusammenhang zwischen IS und VaD untersucht¹⁰. Detaillierte, protokollbasierte Beschreibungen der Auswahl der Expositions-Instrumente, der Extraktion der Ergebnisdaten, der Harmonisierung von Allelen, der Beurteilung der Instrumentenstärke, der Untersuchung auf Heterogenität, der Bewertung von Pleiotropie sowie der Sensitivitätsanalysen sind jedoch weiterhin entscheidend für eine reproduzierbare Anwendung.

Dieses Protokoll ist geeignet, wenn öffentlich zugängliche GWAS-Zusammenfassungsstatistiken sowohl für die Exposition als auch für das interessierende Ergebnis verfügbar sind, gültige genetische Instrumente für die Exposition ausgewählt werden können und die Forschungsfrage darauf abzielt, eine mögliche kausale Assoziation zu bewerten, anstatt biologische Mechanismen direkt zu etablieren. Die vorliegende Studie stellt daher ein Zweistichproben-MR-Protokoll zur Bewertung der potenziellen kausalen Assoziation zwischen IS und VaD unter Verwendung öffentlich zugänglicher GWAS-Zusammenfassungsstatistiken vor. Ziel ist es, einen reproduzierbaren analytischen Arbeitsablauf bereitzustellen, anstatt endgültige biologische Mechanismen zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt die Auswahl genetischer Instrumente, das Abgleichen der Ergebnisdaten, die Harmonisierung der Allele, die MR-Schätzung sowie Sensitivitätsanalysen und verwendet die Assoziation zwischen IS und VaD als repräsentatives Beispiel.

Protokoll

Diese Studie verwendete öffentlich zugängliche GWAS-Zusammenfassungsstatistiken. Die ursprünglichen Studien hatten die Genehmigung der zuständigen Ethikkommission sowie die informierte Einwilligung der Teilnehmer erhalten. Für diese sekundäre Analyse war keine zusätzliche ethische Genehmigung erforderlich.

1. Studiendesign und Ethikstellungnahme

1. Verwenden Sie ein Two-Sample-MR-Design, um die potenzielle kausale Assoziation zwischen IS und VaD zu bewerten.
2. Verwenden Sie ausschließlich öffentlich verfügbare GWAS-Zusammenfassungsstatistiken. Da alle ursprünglichen Studien, die in die GWAS-Datensätze einbezogen wurden, die Genehmigung einer institutionellen Ethikkommission und die informierte Einwilligung der Teilnehmer erhalten hatten, ist für diese Sekundäranalyse keine zusätzliche ethische Genehmigung erforderlich.
3. Definieren Sie IS als Exposition und VaD als Zielgröße, bevor Sie die Datengewinnung durchführen.

2. Softwarevorbereitung

1. Führen Sie alle Analysen mit der statistischen Software R durch.
2. Laden Sie das TwoSampleMR-Paket für die Instrumentenextraktion, die Extraktion der Ergebnisdaten, die Harmonisierung der Allele, die MR-Schätzung, die Heterogenitätsprüfung und die Sensitivitätsanalysen. Laden Sie das MRPRESSO-Paket, um globale horizontale Pleiotropie und potenzielle Ausreißervarianten zu bewerten.
3. Verwenden Sie die folgenden Kernfunktionen im Workflow: extract_instruments, extract_outcome_data, harmonise_data, mr, generate_odds_ratios, mr_heterogeneity, mr_pleiotropy_test, mr_singlesnp, mr_leaveoneout, mr_scatter_plot, mr_forest_plot, mr_funnel_plot und mr_leaveoneout_plot. Nutzen Sie MRPRESSO::mr_presso, um den globalen MR-PRESSO-Test sowie gegebenenfalls die Ausreißer- und Verzerrungstests durchzuführen.

3. Auswahl des Expositions-Datensatzes und Screening von Instrumentalvariablen

1. Extrahieren Sie mit IS assoziierte Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) aus dem IEU OpenGWAS-Datensatz ebi-a-GCST90018864. Dieser Datensatz umfasst 11.929 IS-Fälle und 472.192 Kontrollen mit einer Gesamtstichprobengröße von 484.121 Teilnehmern.
2. Wählen Sie Kandidaten-SNPs, die mit IS assoziiert sind, anhand einer Signifikanzschwelle von p < 5 × 10^-6 aus.
   1. Die Schwelle von p < 5 × 10^-6 wird in diesem repräsentativen Protokoll verwendet, um eine ausreichende Anzahl unabhängiger Instrumente für Sensitivitätsanalysen beizubehalten. Da diese Schwelle weniger streng ist als die konventionelle genomweite Signifikanzschwelle, sollten Befunde, die auf diesen Instrumenten basieren, als explorativ und hinweisend und nicht als endgültig interpretiert werden.
3. Führen Sie ein Linkage-Disequilibrium-Clumping durch, um unabhängige SNPs beizubehalten. Verwenden Sie eine r²-Schwelle von 0,001 und ein Clumping-Fenster von 10.000 kb.
4. Verwenden Sie den folgenden R-Befehl, um Kandidaten-Instrumente zu extrahieren:
   extract_instruments(outcomes = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE)
5. Berechnen Sie die F-Statistik für jeden beibehaltenen SNP anhand der Formel F = (β/SE)², wobei β und SE die Wirkungsschätzung und der Standardfehler des SNP–Expositionseffekts sind.
6. Streichen Sie SNPs mit einer F-Statistik < 10 aus, um das Risiko einer Verzerrung durch schwache Instrumente zu verringern. Fassen Sie die Verteilung der F-Statistiken anhand des Minimums, Maximums, Medians und des Interquartilsabstands (IQR) zusammen.

4. Extraktion des Ergebnisdatensatzes

1. Extrahieren Sie die Assoziationen für das VaD-Ergebnis aus dem FinnGen-GWAS-Datensatz finn-b-F5_VASCDEM. Dieser Datensatz umfasst 881 VaD-Fälle und 211.508 Kontrollen.
2. Extrahieren Sie die Ergebnisassoziierungen für alle ausgewählten IS-assoziierten SNPs mithilfe der Funktion extract_outcome_data.
3. Suchen Sie nach Proxy-SNPs, wenn die Ziel-SNPs im Ergebnisdatensatz nicht direkt verfügbar sind. Behalten Sie die passenden Proxy-Varianten bei, sofern gültige Proxy-Informationen und Allel-Übereinstimmungen vorliegen.
4. Verwenden Sie den folgenden R-Befehl, um den Ergebnisdatensatz zu extrahieren:
   extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)

5. Allel-Harmonisierung und Beibehaltung von SNPs

1. Standardisieren Sie die Expositions- und Outcome-Datensätze vor der MR-Analyse.
2. Passen Sie das Effektallel und das andere Allel so an, dass die SNP–Expositions- und SNP–Outcome-Effektschätzungen demselben Effektallel entsprechen.
3. Überprüfen Sie die SNPs während der Harmonisierung auf Allel-Unverträglichkeiten, fehlende Outcome-Assoziationen und mehrdeutige Allelausrichtungen. Behalten Sie SNPs mit verfügbaren Effektschätzungen für Exposition und Outcome nach der Harmonisierung bei.
4. Verwenden Sie den folgenden R-Befehl für die Allelharmonisierung: harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
5. Dokumentieren Sie die Anzahl der ursprünglich aus dem Expositionsdatensatz extrahierten SNPs, die Anzahl der SNPs mit verfügbaren Outcome-Assoziationen, die Anzahl der über Proxy abgeglichenen Varianten sowie die Anzahl der für die endgültige MR-Analyse beibehaltenen SNPs.

6. Primäre MR-Analyse und Sensitivitätsanalysen

1. Führen Sie die primäre MR-Analyse unter Verwendung der Methode des inversen Varianzgewichts (IVW) durch.
2. Führen Sie ergänzende MR-Analysen unter Verwendung der gewichteten Median- und MR-Egger-Methoden durch, um die Konsistenz der kausalen Schätzung unter verschiedenen Annahmen zu überprüfen.
3. Erzeugen Sie Odds Ratios (ORs) und 95%-Konfidenzintervalle (CIs) aus den MR-Schätzungen.
4. Verwenden Sie die folgenden R-Befehle, um die MR-Analyse durchzuführen und ORs zu berechnen:
   res <- mr(dat)
   res <- generate_odds_ratios(res)
5. Da eine vorab festgelegte primäre Exposition–Ergebnis-Assoziation bewertet wird, definieren Sie die Bonferroni-korrigierte Schwelle für die primäre MR-Inferenz als 0,05/1 = 0,05. Verwenden Sie einen zweiseitigen p-Wert < 0,05 als Schwelle für statistische Signifikanz für die primäre IVW-Analyse.
6. Um die statistische Präzision der primären Analyse im Hinblick auf die begrenzte Anzahl an VaD-Fällen einzuordnen, führen Sie eine nachträgliche, zweiseitige Power-Berechnung mittels Wald-Test basierend auf der beobachteten IVW-Schätzung und ihrem Standardfehler durch. Berechnen Sie die Power unter Verwendung des Nichtzentralitätsparameters βIVW/SEIVW bei einem zweiseitigen α-Niveau von 0,05. Berechnen Sie den minimal nachweisbaren Effekt, der einer Power von 80 % entspricht, als exp[(z0,975 + z0,80) × SE]. Da IS eine binäre Exposition ist und die SNP–Expositions-Assoziationen auf der Log-Odds-Skala angegeben werden, berichten Sie diese Analyse als eine effektbedingte, deskriptive Beurteilung der Präzision und nicht als vorab festgelegte Stichprobengrößenberechnung¹¹.

7. Heterogenität, horizontale Pleiotropie und Leave-one-out-Analysen

1. Beurteilen Sie die Heterogenität zwischen SNP mithilfe der Cochran-Q-Statistik.
2. Verwenden Sie den folgenden R-Befehl, um die Heterogenitätsstatistiken zu berechnen:
   mr_heterogeneity(dat)
3. Beurteilen Sie die direktionale horizontale Pleiotropie mithilfe des MR-Egger-Achsenabschnittstests.
4. Verwenden Sie den folgenden R-Befehl, um den MR-Egger-Achsenabschnitt zu berechnen:
   mr_pleiotropy_test(dat)
5. Beurteilen Sie die globale horizontale Pleiotropie und potenzielle Ausreißervarianten mithilfe von MR-PRESSO mit 10.000 Simulationen, einem Signifikanzschwellenwert von 0,05 und aktivierten Ausreißer- und Verzerrungstests¹².
6. Verwenden Sie den folgenden R-Befehl für die MR-PRESSO-Analyse:
   set.seed(20260729)
   mr_presso(
   BetaOutcome = "beta.outcome",
   BetaExposure = "beta.exposure",
   SdOutcome = "se.outcome",
   SdExposure = "se.exposure",
   OUTLIERtest = TRUE,
   DISTORTIONtest = TRUE,
   data = dat,
   NbDistribution = 10000,
   SignifThreshold = 0.05
   )
7. Führen Sie eine Einzel-SNP-Analyse durch, um den Effekt jedes SNP separat abzuschätzen.
8. Verwenden Sie den folgenden R-Befehl für die Einzel-SNP-Analyse:
   res_single <- mr_singlesnp(dat)
9. Führen Sie eine Leave-one-out-Analyse durch, indem Sie nacheinander jeweils ein SNP entfernen und die IVW-Analyse wiederholen.
10. Verwenden Sie den folgenden R-Befehl für die Leave-one-out-Analyse:
    res_loo <- mr_leaveoneout(dat)

8. Visualisierung und Ausgabe

1. Erstellen Sie ein Streudiagramm, um die MR-Schätzungen über verschiedene Methoden hinweg darzustellen.
2. Erstellen Sie ein Wald-Diagramm, um die Einzel-SNP-Schätzungen und die gesamte MR-Schätzung darzustellen.
3. Erstellen Sie ein Einfüll-Diagramm, um die Symmetrie der SNP-spezifischen Schätzungen visuell zu beurteilen.
4. Erstellen Sie ein „Leave-one-out“-Diagramm, um zu prüfen, ob die Gesamtschätzung von einem einzelnen SNP beeinflusst wird.
5. Verwenden Sie die folgenden R-Befehle, um die Diagramme zu erstellen:
   mr_scatter_plot(res, dat)
   mr_forest_plot(res_single)
   mr_funnel_plot(res_single)
   mr_leaveoneout_plot(res_loo)
6. Exportieren Sie die MR-Ergebnisse, die Instrumentalvariablen-Tabelle, die Outcome-Assoziations-Tabelle und die Ergebnisse der Sensitivitätsanalyse zur Berichterstattung und Reproduzierbarkeit.

Ergebnisse

Abbildung 1 fasst den gesamten Arbeitsablauf des Zweistichproben-Mendelschen-Randomisierungsprotokolls zusammen, von der Datensatzauswahl und Instrumentenprüfung bis hin zu Sensitivitätsanalysen und der Visualisierung der Ergebnisse. Repräsentative Ausgaben aus jedem Stadium werden unten dargestellt.

Genetische Instrumentalvariablen und Qualitätskontrolle der Harmonisierung

Insgesamt wurden 52 mit IS as...

Diskussion

Diese Studie stellt ein Two-Sample-MR-Protokoll zur Bewertung der potenziellen kausalen Assoziation zwischen IS und VaD unter Verwendung öffentlich zugänglicher GWAS-Zusammenfassungsstatistiken vor. In der repräsentativen Analyse unterstützten die IVW- und gewichtete Median-Methoden eine positive Assoziation zwischen genetisch vorhergesagtem IS und dem VaD-Risiko, während die MR-Egger-Schätzung in gleicher Richtung verlief, jedoch keine statistische Signifikanz erreichte. Daher liefern diese Ergebnisse Hinweise auf einen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
FinnGen GWAS-Datensatz	FinnGen	finn-b-F5_VASCDEM	Öffentlicher GWAS-Datensatz, der als Ergebnisquelle für vaskuläre Demenz verwendet wurde
IEU OpenGWAS-Datenbank	MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol	ebi-a-GCST90018864	Öffentlicher GWAS-Datensatz, der als Expositionssource für ischämischen Schlaganfall verwendet wurde
R-Software	R Foundation for Statistical Computing	Nicht zutreffend	Statistische Software zur Durchführung der MR-Analyse
RStudio	Posit Software, PBC	Nicht zutreffend	Integrierte Entwicklungsumgebung zum Ausführen von R-Skripten
TwoSampleMR-Paket	MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol	Nicht zutreffend	R-Paket zur Extraktion von Instrumenten, Harmonisierung, MR-Analyse und Sensitivitätsanalysen
MRPRESSO-Paket	CRAN	Version 1.0	R-Paket zur Beurteilung globaler horizontaler Pleiotropie und potenzieller Outlier-Instrumente
writexl-Paket	CRAN	Nicht zutreffend	R-Paket zum Exportieren von Ergebnistabellen als xlsx-Dateien