Methodenartikel

Ein chirurgisches Verfahren zur Herstellung eines Mausmodells der Kniearthrose mittels eines modifizierten Hulth-Verfahrens

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DOI:

10.3791/70379

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15. Mai 2026

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll skizziert die verfeinerten chirurgischen Schritte des modifizierten Hulth-Modells und bietet eine standardisierte, reproduzierbare Methode zur Induzierung experimenteller Arthrose.

Zusammenfassung

Kniearthrose (KOA) ist eine chronisch degenerative Gelenkerkrankung, die durch Degeneration des Gelenkknorpels, subchondrale Knochenbildung, Osteophytenbildung und Synovitis gekennzeichnet ist – die häufigste Form der Arthrose.

Dieses Protokoll stellt eine chirurgische Methode vor, um ein Mausmodell der Kniearthrose mit einem modifizierten Hulth-Verfahren zu etablieren. Im Vergleich zu injektionsinduzierten oder konventionellen chirurgischen Modellen wie der Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) und der vorderen Kreuzbanddurchtrennung (ACLT) induziert das modifizierte Hulth-Modell einen früheren Krankheitsbeginn und eine schwerere Gelenkentzündung. Durch das Durchschneiden des medialen Kollateralbandes, des medialen Meniskus und des vorderen Kreuzbands wird die mechanische Ausrichtung des Kniegelenks gestört und so das Fortschreiten der OA gefördert. Dieses Modell eignet sich besonders gut zur Untersuchung der akuten OA-Pathologie und zur Bewertung potenzieller therapeutischer Interventionen. Um den Schweregrad der Arthritis zu bewerten, verwendeten wir Kleintier-Ultraschall in Kombination mit einer dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion der Gelenkhöhle, um deren Volumen zu quantifizieren und die Ansammlung von Synovialflüssigkeit zu beurteilen. Zusätzlich wurde eine Safranin-O/schnelle grüne Färbung der histologischen Schnitte für die Osteoarthritis Research Society International (OARSI) Bewertung durchgeführt, um die Knorpelzerstörung zu bewerten.

Einleitung

Kniearthrose (OA) ist eine häufige, chronische, degenerative Gelenkerkrankung, die klinisch durch Schmerzen, Steifheit, eingeschränkten Beweglichkeitsradius und Muskelschwäche rund um das Knie gekennzeichnet ist. Seine Häufigkeit ist bei Frauen höher als bei Männern. Wenn sie unzureichend kontrolliert wird, kann Arthrose zu einem fortschreitenden Verlust der körperlichen Leistungsfähigkeit, Schlafstörungen, chronischer Müdigkeit und letztendlicher Behinderung führen. Mit zunehmendem Alter der Weltbevölkerung steigt die Häufigkeit von Knieartrose weiter an und stellt weltweit Gesundheitssysteme und -wirtschaften eine erhebliche Herausforderung dar.

Pathophysiologisch stellt Knorpelverlust das zentrale Merkmal der OA dar, begleitet von strukturellen und funktionellen Beeinträchtigungen des gesamten Gelenks und des periartikulären Gewebes. Um die Krankheitsmechanismen zu klären und therapeutische Interventionen zu evaluieren, wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt, die zentrale Aspekte der humanen OA wiederholen. Unter diesen werden am häufigsten chirurgisch induzierte Modelle eingesetzt. Wie eine Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM)3 und die vordere Kreuzbanddurchtrennung (ACLT)4, stören die normale Gelenkstruktur, was zu Knorpeldegeneration und OA-ähnlichen Veränderungen führt. Alternativ basieren chemische Modelle auf intraartikulärer Injektion von Wirkstoffen, die die extrazelluläre Matrix abbauen (z. B. Kollagenase oder Mononatriumiodoacetat), was zu schnellem Chondrozytentod und Knorpelerosionführt. Während Injektionsmodelle typischerweise innerhalb von Wochen die Endpunktpathologie erreichen, benötigen chirurgische Modelle in der Regel einen längeren Verlauf.

Unter den verfügbaren chirurgischen Techniken haben wir das Hulth-Modell ausgewählt und weiter verfeinert, da es beschleunigt mit OA7 beginnt. Durch die Kombination der Durchtrennung des vorderen Kreuzbands und des hinteren Kreuzbandes mit der Resektion des medialen Kollateralbands und der totalen medialen Menissektomie induziert dieses Modell zuverlässig schwere, schnell fortschreitende Knorpelschäden und Veränderungen des subchondralen Knochens. Der kurze Zeitraum bis zum strukturellen Gelenkversagen macht das modifizierte Hulth-Modell besonders geeignet für akute oder subakute OA-Studien, und wir schlagen vor, dass unser optimiertes Protokoll eine praktische, reproduzierbare Plattform für zukünftige präklinische Untersuchungen bietet.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Tierethikkomitee der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine genehmigt. Männliche C57BL/6 Mäuse im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht von etwa 20 g wurden von kommerziellen Anbietern gekauft (siehe Materialtabelle) (Ethik-Zulassungsnummer: PZSHUTCM2312210005).

1. Präoperative Versorgung

  1. Lassen Sie die Mäuse sich mindestens eine Woche vor der Operation akklimatisieren.
  2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Operation und desinfizieren Sie den Arbeitsbereich.
  3. Schalten Sie die Gasanästhesiemaschine ein und legen Sie die Maus für 5 Minuten in eine Induktionskammer mit 2–3 % Isofluran, um die Vollnarkose einzuleiten.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Sauerstoffflussrate zwischen 0,5 NL/min und 1 NL/min gehalten wird.
  4. Nach der Betäubung wird die Maus auf die chirurgische Plattform übertragen und die Anästhesie mit 1–1,5 % Isofluran über eine Anästhesiemaske bis zum Abschluss der Operation (1–1,5 % Isofluran) aufrechterhalten.
  5. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage mit nach oben gerichteten Kniegelenken, um Stabilität und einen guten Zugang zur Operationsstelle zu gewährleisten.
  6. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie auf das Fehlen von Reflexen prüfen, und tragen Sie dann Enthaarungscreme auf, um die Haare um das Kniegelenk vollständig zu entfernen.
  7. Entfernen Sie die Restcreme vorsichtig mit Mullbinden oder Wattestäbchen, desinfizieren Sie die freiliegende Haut zunächst mit 75 % Ethanol, gefolgt von einer Jod-Tinktur, um aseptische Bedingungen zu gewährleisten.

2. Chirurgischer Eingriff (Abbildung 1)

  1. Strecken Sie das Hintergliedmaß der Maus aus und wenden Sie Traktion aus, um die Haut zu straffen. Machen Sie einen 0,5–1 cm langen Längsschnitt entlang der medialen Seite des rechten Kniegelenks mit einer sterilen chirurgischen Klinge.
    HINWEIS: Alle unten beschriebenen chirurgischen Eingriffe wurden unter chirurgischem Mikroskop durchgeführt.
  2. Ziehe die Haut zurück und führe eine stumpfe Dissektion der darunterliegenden Faszie durch, um die Gelenkkapsel vollständig freizulegen, und visualisiere das Patellarband.
  3. Probe und schneide die Faszie über dem medialen Kollateralband (MCL) mit einer feinen Injektionsnadel ein.
  4. Transektieren Sie das MCL mit einer Mikroskopschere unter Vergrößerung.
  5. Verschieben Sie das Patellarband mit einer Nadel, um den intraartikulären Raum freizulegen und den medialen Meniskus zu identifizieren.
  6. Schneiden Sie nach dem Schneiden das mediale Meniscotibiaband (MMTL) mit einer Mikroschere durch und untersuchen Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Nadel, um die vollständige Ablösung und Beweglichkeit des Meniskus zu bestätigen.
  7. Identifizieren und durchschneiden Sie das vordere Kreuzband (ACL), wobei Sie darauf achten, Schäden am hinteren Kreuzband (PCL) oder dem lateralen Meniskus zu vermeiden. Dies führt typischerweise nach der Operation zu einem positiven vorderen Zeichen, das eine Gelenkinstabilität bestätigt.
    HINWEIS: Schubladentest: Vor dem Schließen der Wunde wurde der Oberschenkelknochen mit einer Hand stabilisiert, während der Knöchel mit der anderen Hand gehalten wurde, wobei Tibia und Oberschenkelknochen in senkrechte Ausrichtung gehalten wurden. Die relative anteroposteriore Verschiebung zwischen Tibia und Oberschenkelknochen wurde manuell angewendet; Beobachtbare translationale Bewegung zeigte ein positives Schubladenzeichen, was eine Kreuzbandstörung bestätigte.
  8. Um eine schwerere Arthrose zu induzieren, führt man alternativ eine gleichzeitige Durchtrennung sowohl des vorderen Kreuzbands (ACL) als auch des hinteren Kreuzbands (PCL) in Kombination mit einer medialen Menissektomie (MMT) (wie im klassischen Hulth-Modell) durch.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und kann bei Bedarf durchgeführt werden; wenn ausgewählt, stellt dies den Modellierungsansatz des klassischen Hulth-Modells dar.

3. Postoperative Versorgung

  1. Schließen Sie den Schnitt mit 4-0 Nylonnähten und desinfizieren Sie die Operationsstelle mit Jod-Tinktur.
  2. Legen Sie die Maus auf ein temperaturkontrolliertes Heizkissen, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt und normale Atmung und motorische Aktivität zeigt. Sobald er vollständig genesen ist und keine Anzeichen von Stress zeigt, bringen Sie ihn zurück in seinen Stammkäfig.
  3. Überwachen Sie die Nahtintegrität kontinuierlich 3-5 Tage nach der Operation. Wenn ein Nahtbruch festgestellt wird, betäuben Sie die Maus erneut und führen Sie eine Neunähung durch
  4. Verabreichen Sie bis zu 3 Tage nach der Operation intramuskuläre Antibiotika, um eine postoperative Infektion zu verhindern.
    HINWEIS: Die Verabreichung von Antibiotika wird zur Prophylaxe gegen postoperative Infektionen eingesetzt. Die postoperative Analgesie wird durch experimentelle Ziele bestimmt; In der Arthroseforschung werden Analgetika typischerweise während der akuten Phase verzichtet, um eine störende therapeutische Wirksamkeitsbewertung zu vermeiden.
  5. Überwachen Sie die Operationsstelle täglich auf Anzeichen von Schwellung, Ausfluss oder lokaler Entzündung.
  6. Die Maus wird am Endpunkt der Studie nach genehmigten Protokollen eingeschläfert und das Kniegelenk für eine histologische oder bildgebende Analyse seziert.
    HINWEIS: In diesem Schritt haben wir das Protokoll der Euthanasie der Versuchstiere durch Überdosis-Anästhesie übernommen. Dies wurde durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbitalnatriumlösung in einer Dosierung von >100 mg/kg bei Mäusen erreicht.

4. Bewertung der OA-Entwicklung

  1. Vor der Euthanasie sollte die Gelenkschwellung beurteilt und eine Ultraschalluntersuchung durchgeführt werden, um strukturelle Veränderungen im Kniegelenk zu bewerten. Bewerten Sie die motorische Leistung der Maus durch den Rotarod-Test.
    HINWEIS: Für die Ultraschalluntersuchung bei Mäusen ist eine Isofluran-Anästhesie erforderlich.
  2. Nach der Euthanasie wird das Kniegelenk disziert und vorsichtig der umliegende Muskel und die Faszie entfernt, wobei Tibia, Fibula und Oberschenkelknochen erhalten bleiben.
    Richten Sie die Gelenke und entkalken Sie sie für mindestens 30 Tage in einer 10%igen Ethylendiamintetraessigsäurelösung (EDTA), wobei Sie die Lösung zweimal pro Woche ersetzen, um eine vollständige Entkalkung sicherzustellen.
  3. Die entkalkten Kniegelenke in Paraffin einbetten und sagittale Schnitte mit einer Dicke von 4 μm8 vorbereiten.
  4. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Abschnitten, sobald der Meniskus deutlich sichtbar ist. Färben Sie die Schnitte mit Safranran O und schnellgrünem Motiv, um Knorpel und subchondrale Knochenmorphologie zu visualisieren. Bewerten Sie den Knorpelabbau mit dem OARSI-9-Bewertungssystem.
  5. Safranin O-Fast Green Färbeverfahren (kommerzielles Set, siehe Materialtabelle)
    1. Deparaffinisierung und Rehydrierung
      1. Deparaffinisiere Abschnitte in Xylol für 3 Minuten, wiederhole das 3 Mal.
      2. Rehydrieren Sie durch eine graduierte Ethanolserie (100 %, 90 %, 80 %), um Reste von Xylen zu entfernen, jeweils 2 Minuten.
        HINWEIS: Ethanolserien müssen in absteigender Konzentrationsreihenfolge verwendet werden.
      3. 1 Minute in destilliertem Wasser abspülen und kurz abtropfen.
    2. Weigerts Eisenhämatoxylin-Färbung
      1. Trage Weigerts Arbeitslösung auf Abschnitte auf und beize 5 Minuten.
      2. 1 Minute in destilliertem Wasser abspülen und kurz abtropfen.
    3. Säuredifferenzierung
      1. Trage die säuredifferenzierende Lösung 15 Sekunden lang auf Schnitte auf.
      2. Waschen Sie 10 Minuten mit Wasser und lassen Sie überschüssiges Wasser ab.
        HINWEIS: Die Differenzierungszeit ist entscheidend – eine verlängerte Differenzierung verhindert schnelle Grünfärbung, während unzureichende Differenzierung zu tiefer, schneller Grünfärbung mit schlechter Saranaufnahme führt
    4. Schnelles Grünfärben
      1. Trage eine schnelle grüne Lösung für 5 Minuten auf Abschnitte auf und lasse kurz abgießen.
      2. Trage eine schwache Säurelösung auf, um den restlichen schnellen grünen Fleck für 15 Sekunden zu entfernen, und lasse kurz abtropfen.
    5. Safranin O-Fleck
      1. Trage 4,5 Minuten die Safrarin-O-Lösung auf Abschnitte auf.
      2. Schnell Abschnitte auf 90 % Ethanol übertragen, um überschüssiges Saranin O, 2-3 S, zu entfernen.
        HINWEIS: Dieser Schritt kann je nach Intensität der Safrainfärbung entsprechend verlängert werden.
    6. Dehydrierung und Reinigung
      1. Dehydriere Abschnitte in 100 % Ethanol für 1 Minute.
      2. Entfernen Sie Abschnitte mit Xylol für vollständige Dehydrierung, 2 Minuten, wiederholen Sie es 3 Mal.
        HINWEIS: Das in diesem Schritt verwendete Xylol darf nicht mit dem in Abschnitt 4.5.1 verwendeten vermischt werden; Kreuzkontamination kann die Qualität der Sektionen beeinträchtigen.
    7. Montage mit Neutral Balsam
      1. Setze Abschnitte in eine Abzugshaube, damit überschüssiges Xylol verdunsten kann.
      2. Entferne Abschnitte, trage eine angemessene Menge neutralen Balsam auf das Exemplar auf und decke vorsichtig mit einem Deckzettel ab.
      3. Untersuchen Sie Schnitte unter einem Lichtmikroskop auf Luftblasen und entfernen Sie sorgfältig alle Anwesenheiten.
      4. Lagern Sie Stücke in einer Folienbox und geben Sie sie 24 Stunden in einen 60 °C Ofen, um eine vollständige Aushärtung des neutralen Balsams zu gewährleisten.

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Ergebnisse

Längsschnitte des Kniegelenks wurden mit einem Mikroultraschall-8-System mit einem Scan-Schritt von 4 mm und einer axialen Auflösung von 0,04 mm durchgeführt. Am postoperativen Tag 7 zeigte die 3D-Rekonstruktion einen deutlichen Anstieg des Gelenkraumvolumens in der Modellgruppe im Vergleich zur Scheingruppe (Abbildung 2A,B). Rotarod-Ermüdungstests10,11 bestät...

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Diskussion

Im Vergleich mit anderen chirurgischen Modellierungsmethoden, wie der Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) und der vorderen Kreuzbanddurchtrennung (ACLT)-Modelle, induziert das modifizierte Hulth-Modell Arthrose durch kombinierte Band- und Meniskenverletzungen. Die spezifische strukturelle Störung bestimmt Veränderungen in der Gelenkbiomechanik über verschiedene Ebenen hinweg. ACLT4 beeinträchtigt die Rotationsstabilität (Innen- und Außenrotation) und verr...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Diese Studie wurde vom Science and Technology Innovation Action Plan in Shanghai (23YF1447900 an CJM), dem Chenguang-Programm der Shanghai Education Development Foundation und der Shanghai Municipal Education Commission (23CGA53 an CJM) sowie der National Natural Science Foundation of China (U24A6013 bis XH) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL Injektionsspritze//Spezifikationen: 30 G & Times; 0,13 mm
3D-Ultraschall Vevo 3100 BildgebungssystemOptikVevo 2100Ein Hochfrequenz-Ultraschallbildsystem, das mit der Vevo LAB-Software zur Datenanalyse integriert ist.
4-0 Nylonnaht//
75 % EthanolShanghai Titan Scientific Co., Ltd.G73537O
C57BL/6J männliche Mäuse (6-8 Wochen alt)Shanghai Jiesijie Laboratory Animal Co., Ltd./
EnthaarungscremeVeetLos: C021123001
Jod-Tinktur//
IsofluraneRWD R650-IE
MikropinzettenRWD F12013-10
Mikro-SchereRWD S11035-08
Modifiziertes Safranin O und Fast Green Stain KitSolarbioG1371
NadelhalterRWD F21001-12
Chirurgische Klingen (10#)RWD S31010-01
Chirurgisches MikroskopOlympusSZ61

Referenzen

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GelenkdegenerationKnorpelzerst rungmediale Meniskustransektionvorderes KreuzbandKleintier UltraschallSynovialfl ssigkeitSafranin O F rbung
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