Diese Studie bewertet den diagnostischen und prognostischen Nutzen der kombinierten Erkennung von Serum-IFN-γ und Neutrophilen CD64 für aktive pulmonale Tuberkulose bei immungeschwächten älteren Patienten.
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Forschungsartikel
Diese Studie bewertet den diagnostischen und prognostischen Nutzen der kombinierten Erkennung von Serum-IFN-γ und Neutrophilen CD64 für aktive pulmonale Tuberkulose bei immungeschwächten älteren Patienten.
Diese Studie bewertete das Risiko aktiver pulmonaler Tuberkulose (ATB) bei älteren Patienten mit geschwächter Immunität, indem gemeinsam Seruminterferon-γ (IFN-γ) und Neutrophil CD64 nachgewiesen wurden und die Auswirkungen dieses Diagnoseprotokolls auf den Verlauf von ATB analysiert wurden. Insgesamt wurden 50 Patienten mit ATB und 50 alters- und geschlechtsabgleichbare gesunde Kontrollgruppen rekrutiert. Anschließend wurden das Neutrophilil CD64 des Patienten (quantifiziert als Prozentsatz der CD64-positiven Neutrophilen [CD64%]), IFN-γ (mittels enzymgebundener Immunsorbent-Test [ELISA]), das C-reaktive Protein (CRP; mittels Immunoturbidimetrie) und die Erythrozytensedimentationsrate (ESR; nach Westergren-Methode) quantifiziert. Sputumproben von Patienten wurden auf Löwenstein-Jensen (L-J) Medium und im automatisierten MGIT-960-System kultiviert. Die diagnostische Wirksamkeit einzelner und kombinierter Biomarker wurde mit einer Analyse der Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC) bewertet, und ein logistisches Regressionsmodell wurde für die kombinierte Detektion entwickelt. Signifikant erhöhte Spiegel von sowohl IFN-γ als auch CD64 wurden bei ATB-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen beobachtet (P<0,05). Ein diagnostisches Modell, das beide Biomarker einbezieht, hatte eine Fläche unter der Kurve (AUC) von 0,838, mit einer Sensitivität von 84,00 % und einer Spezifität von 76,00 %. Beide Marker sanken nach therapeutischer Intervention (P<0,05) und zeigten die niedrigsten Werte bei kulturnegativen Patienten (P<0,05). Darüber hinaus zeigte das kombinierte Modell einen prädiktiven Nutzen für die Kulturkonvertierung und erreichte einen AUC von 0,756 (65,71 % Sensitivität, 80,00 % Spezifität; P<0,001). Der kombinierte Nachweis von IFN-γ und CD64 kann das Auftreten von ATB bei immungeschwächten älteren Menschen effektiv diagnostizieren und dient als Referenz für die klinische Praxis.
Lungentuberkulose (TB), eine chronische Infektionskrankheit, die durch Mycobacterium tuberculosis (MTB) verursacht wird, verursacht weltweit jährlich mehr als 10 Millionen neue Fälle und ist die häufigste Todesursache durch einen einzelnen infektiösen Erreger1. Klinisch gehören zu den Populationen mit hohem Risiko für ATB immungeschwächte Personen, Patienten mit Diabetes, Langzeitraucher, enge Kontakte von TB-Fällen und ältere Erwachsene2. Unter diesen Gruppen haben ältere Erwachsene mit eingeschränkter Immunität ein deutlich erhöhtes Risiko für ATB3. Die genaue und frühe Diagnose der aktiven TB (ATB) ist für die Prognose entscheidend, da sie übertragbar ist und das Risiko eines schweren Fortschreitensbesteht. Dennoch fehlen aktuelle Strategien, die auf Symptomatologie, Bildgebung und Sputumtests basieren, spezifische Biomarker, was eine kritische diagnostische Lücke5 schafft. Diese diagnostische Unsicherheit wird durch das Fehlen dynamischer Indikatoren zur Schwerebewertung verschärft, was oft zu empirischen Behandlungen führt, die nicht den individuellen Patientenbedürfnissen entspricht6. Daher ist es unerlässlich, hochsensible und spezifische Biomarker zu identifizieren, um die frühe Differenzierung und Stratifizierung von ATB zu verbessern.
Interferon-γ (IFN-γ), ein zentrales Zytokin in der T-Zell-Antwort auf MTB-spezifische Antigene, spiegelt den Immunaktivierungszustand in ATB wider, wobei erhöhte Serumspiegel bei der Diagnose helfen; darüber hinaus ist es wertvoll darin, zwischen latenter TB-Infektion (LTBI) und ATB 7,8 zu unterscheiden. Obwohl wertvoll, wird sein Nutzen durch begrenzte Spezifität durch die Einwirkung durch die Bacillus Calmette-Guerin-Impfung und andere Infektionen beeinträchtigt9. Umgekehrt sind Neutrophile die erste Immunzellpopulation, die in die Lunge rekrutiert wird und ATB-Läsionen infiltriert, wobei ihre Beteiligung an der Entzündungsamplifikation mit der Überexpression von CD64, dem hochaffinitätsstarken Fc-Gamma-Rezeptor I10, verbunden ist. Dennoch hat keine frühere Studie IFN-γ und Neutrophil CD64 kombiniert, um deren synergetische diagnostische und prognostische Nützlichkeit für ATB zu bewerten, insbesondere bei immungeschwächten älteren Erwachsenen, einer Kohorte mit besonderen diagnostischen Herausforderungen aufgrund abgeschwächter Immunantworten und atypischer klinischer Präsentationen.
Diese Studie wählte IFN-γ und CD64 aufgrund ihrer komplementären Rollen bei adaptiver und angeborener Anti-MTB-Immunität, klinischer Assay-Zugänglichkeit und unabhängigem diagnostischem Wert, der in früheren Studien berichtet wurde, ohne bisher eine kombinierte Untersuchung bei immungeschwächten älteren Patienten. Die Studie kombiniert Serum-IFN-γ (gemessen mittels enzymgebundener Immunsorbent-Assay [ELISA], der adaptive T-Zell-Immunität widerspiegelt) und Neutrophil CD64 (gemessen mittels Durchflusszytometrie, was die angeborene Immunaktivierung und entzündliche Belastung widerspiegelt), wobei die diagnostische Leistung mittels Analyse der Empfänger-Betriebseigenschaften (ROC) und logistischer Regressionsmodellierung bewertet wird. Der Nutzen dieses kombinierten Tests zur Diagnose und Überwachung des Fortschreitens der ATB-Erkrankung bei immungeschwächten älteren Erwachsenen wurde systematisch bewertet.
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Das Studienprotokoll erhielt die Zustimmung vom Institutional Review Board des Ganzhou Fifth People's Hospital in Ganzhou, Jiangxi, China. Von allen Beteiligten wurde eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt. Alle Verfahren mit lebensfähiger Mycobacterium tuberculosis (MTB) wurden in einer Biosicherheits-Level-3-Containment-Anlage (BSL-3) durchgeführt, in voller Übereinstimmung mit nationalen Biosicherheitsrichtlinien für den Umgang mit infektiösen Krankheitserregern. Bei NaOH-vermittelter Sputumverflüssigung trugen die Bediener vollständige persönliche Schutzausrüstung (N95-Atemschutzmasken, Nitrilhandschuhe, flüssigkeitsbeständige Kittel und Gesichtsschutzschilde), um eine Chemikalien- und Aerosolexposition zu verhindern. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Forschungsteilnehmer
Das Studienprotokoll beginnt mit der Einschreibung und der informierten Zustimmung der berechtigten Teilnehmer und endet mit der Abschluss der statistischen Analyse aller primären und sekundären Endpunkte. Diese retrospektive Einzel-Zentrum-Studie nahm ATB-Patienten (ATB-Gruppe) und gesunde Kontrollpersonen (Kontrollgruppe) aus unserem Krankenhaus zwischen Mai 2023 und Mai 2025 ein, wobei alle Studienverfahren vor der Datenanalyse abgeschlossen wurden. Das Flussdiagramm der Studie ist in Abbildung 1 dargestellt. Die ATB- und Kontrollgruppen waren zu Beginn vergleichbar, ohne signifikante Unterschiede in demografischen Merkmalen und häufigen chronischen Komorbiditäten (P>0.05, Tabelle 1), was die Homogenität der beiden Gruppen bestätigte.
2. Stichprobengrößenschätzung
Die Stichprobengröße wurde anhand vorläufiger Daten von 10 Probanden geschätzt, die mediane IFN-γ-Werte von 20 pg/mL bei ATB-Patienten gegenüber 10 pg/mL bei gesunden Kontrollgruppen zeigten. Um einen signifikanten Unterschied zu erkennen (unter Annahme des Signifikanzniveaus [α]=0,05, zweiseitig; Teststärke [1-β]=80 %; mittlere Effektgröße [Cohens d≈1,2]) ergab eine Analyse mit PASS 15.0-Software eine Mindestanforderung von 42 Teilnehmern pro Gruppe (tatsächliche Leistung = 81,2 %, α=0,05, zweiseitig). Unter Berücksichtigung einer Abbrecherquote von 10 % bis 15 % rekrutierten wir letztlich insgesamt 100 Probanden (50 pro Gruppe), nachdem wir sie anhand der Studienkriterien überprüft hatten.
3. Entnahme von Testproben
Von jedem Patienten wurden 3–5 ml nüchterndes venöses Blut entnommen. Das Blut wurde direkt in ein EDTA-Röhrchen zur CD64-Analyse mittels Durchflusszytometrie und einem Gerinnselaktivatorröhrchen zur Serumtrennung entnommen. Das Serum wurde anschließend auf IFN-γ, C-reaktives Protein (CRP) und Erythrozytensedimentationsrate (ESR) getestet.
4. Flusszytometrie
Vollblut (100 μL) wurde mit einem vorgemischten Antikörpercocktail (je 5 μL aus CD16-FITC, CD14-APC und CD64-PE) für 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Erythrozyten wurden anschließend 10 Minuten lang mit 1 ml BD FACS Lysing-Lösung lysiert, um vor Licht geschützt zu sein. Nach der Zentrifugation (Zentrifugation bei 300 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur) wurde das Überstandsmittel entsorgt. Das verbleibende Zellpellet wurde zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und schließlich in 500 μL PBS für die sofortige Aufnahme am Durchflusszytometer wieder suspendiert. Zur Analyse haben wir zunächst die Leukozytenpopulation mithilfe von Forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Parametern gegartet. Neutrophile wurden dann innerhalb dieses Gates selektiv als Ereignisse als negativ für CD14-APC (ohne Monozyten) und positiv für CD16-FITC identifiziert. Die CD64-positive Population wurde mit einer isotyp-abgestimmten Kontrolle definiert, wobei das Gatter <1 % der Isotyp-Kontrollereignisse einschließt; der Prozentsatz der CD64-positiven Neutrophilen (CD64 %) wurde als der Anteil der gated Neutrophilen innerhalb dieses positiven Gates berechnet. Zur Qualitätskontrolle wurde in jedem Experiment eine gesunde Kontrollprobe einbezogen, um einen Basis-MFI-Bereich (15–30) festzulegen. Jede Stichprobe mit einem MFI über 30 wurde vermerkt. Die tägliche Instrumentenkalibrierung wurde ebenfalls mit BD CS&T-Perlen durchgeführt, um eine konsistente Fluoreszenzkompensation und Spannungseinstellungen aufrechtzuerhalten. Instrumentenerfassungsparameter: Die Durchflusszytometrie wurde mit einem Durchflusszytometer durchgeführt, wobei pro Probe mindestens 10.000 gesteuerte Neutrophilenereignisse gesammelt wurden. Die Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuspannung (SSC) wurden auf 350 V bzw. 280 V gesetzt. Die Spannungen des Fluoreszenzkanals wurden täglich mit BD CS&T-Perlen optimiert, um eine konsistente Erkennung und Kompensation sicherzustellen. Visuelle Qualitätskontrollpunkte: (1) Die Leukozytenpopulation wurde auf FSC/SSC-Diagrammen eindeutig aufgelöst, ohne signifikante Kontamination durch Trümmer; (2) Das Neutrophilengate wurde als CD14-negativ und CD16-positiv bestätigt, mit einer <5%igen Monocytenkontamination; (3) Das CD64-Fluoreszenzhistogramm war unimodal ohne signifikante unspezifische Färbung.
5. ELISA
Das Serum wurde durch Zentrifugation getrennt, und der Test erfolgte gemäß den Anweisungen des Herstellers des ELISA-Kits. Kurz gesagt, wurden 50 μL Standard- oder Testserumproben in antikörperbeschichtete Bohrlöcher gegeben und bei 37 °C für 90 Minuten inkubiert. Weitere Schritte umfassten die sequentielle Zugabe des biotinylierten antihumanen IFN-γ-Antikörpers (100 μL), des Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-(HRP)-Komplexes (100 μL), des chromogenen Substrats und einer Stoplösung. Ein Vier-Parameter-Fitting-Algorithmus wurde auf die Standardkurve angewendet, um die endgültigen IFN-γ-Konzentrationen in pg/ml zu berechnen. Qualitätskontrolle: Die Validität des Assays erforderte, dass niedrige/mittlere/hohe Qualitätswerte (15,6, 62,5, 250 pg/mL) im angegebenen Bereich ± 2 SD liegen, wobei die Intra- und Interassay-Variationskoeffizienten (CVs) unter 8 % bzw. 10 % gehalten wurden.
6. Immunoturbidimetrischer Test
Nach der Zentrifugation wurden die Serum-CRP-Werte mit einem automatisierten biochemischen Analysator mit einem passenden, mit Latexpartikeln verstärkten immunoturbidimetrischen Kit gemäß dem standardisierten Protokoll des Herstellers bestimmt. Der Test basierte auf der Agglutination von CRP mit spezifischen Antikörpern, die an Latexpartikel gebunden sind, was die Trübung im direkten Verhältnis zur CRP-Konzentration erhöhte und photometrisch quantifiziert wurde. Qualitätskontrolle: Jede Probencharge enthielt eine niedrige (<3 mg/L) und eine hochkonzentrierte (>100 mg/L) Qualitätsserum (Beckman). Die erhaltenen Werte mussten im vom Hersteller angegebenen akzeptablen Bereich (±3 SD) liegen. Der intraassay CV wurde bei ≤5 % gehalten, der interassay CV bei ≤8 %.
7. Westergren-Methode
Das venöse Blut im Gerinnselaktivatorrohr durfte 1 Stunde stehen. Das Plasma wurde dann in ein 1,6-mL Westergren-Rohr aspiriert und vertikal in einen ESR-Analysator bei 37 °C für 1 Stunde platziert. Das Ergebnis wurde automatisch berechnet und als Sedimentationshöhe in mm/h angegeben. Qualitätskontrolle: Der Analysator wurde täglich mit einem Standard-Sedimentationsrohr für die Nullpunktkalibrierung kalibriert.
8. MTB-Kultur
Sputumproben wurden mit 4 % NaOH verflüssigt, neutralisiert und zentrifugiert (Zentrifugation bei 1200 × g für 15 Minuten bei Raumtemperatur), gefolgt von der Supernatantenentfernung. Das entstehende Sediment wurde auf das Löwenstein-Jensen (L-J)-Medium (2–3 Tropfen pro Röhre) geimpft. Die Kulturen wurden bei 37 °C in einem Inkubator mit konstanter Temperatur inkubiert und wöchentlich auf Koloniewachstum untersucht. Ein positives Ergebnis wurde durch das Auftreten typischer blomkohlähnlicher Kolonien innerhalb von ≥2 Wochen definiert. Qualitätskontrolle: Qualitätskontrollmaßnahmen umfassten gleichzeitige negative (sterile Kochsalzlösung) und positive (H37Rv) Kontrollen in jeder Charge sowie monatliche Sterilitätstests des Kulturmediums.
9. Behandlung und Nachsorge
Alle ATB-Patienten erhielten eine standardisierte Erstlinien-Antituberkulosetherapie (2HRZE/4-Stunden-Regime: 2-monatige intensive Phase mit Isoniazid, Rifampicin, Pyrazinamid, Ethambutol; 4-monatige Fortsetzungsphase mit Isoniazid und Rifampicin). Eine Sputum-Mykobakterienkultur wurde zu Beginn und zwei Monate nach Behandlungsbeginn durchgeführt, um die Kulturumwandlung zu bewerten.
10. Abfallentsorgung
Biogefährliche Abfälle (einschließlich Restblutproben, Sputumproben und MTB-Kulturmaterialien) wurden durch Autoklavierung bei 121 °C für 30 Minuten vor der endgültigen Entsorgung dekontaminiert. Chemische Abfälle (einschließlich NaOH-Lösung, Lysepuffer und fluoreszierende Färbstoffreagenzien) wurden in versiegelten, ausgewiesenen Behältern für gefährliche Abfälle gesammelt und gemäß institutionellen Chemikalienabfallprotokollen entsorgt.
11. Statistische Methoden
Die Studienanalyse verwendete SPSS 30.0. Kategoriale Daten (z. B. Geschlecht) wurden mit Chi-Quadrat-Tests verglichen. Die Normalität kontinuierlicher Daten wurde durch den Shapiro-Wilk-Test bestätigt, und die Homogenität der Varianz durch den Levene-Test. Normalverteilte kontinuierliche Daten mit homogener Varianz wurden mit unabhängigen Stichproben t-Tests verglichen; nicht normal verteilte Daten wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test verglichen. Die Analyse der ROC-Kurve wurde mit dem Modul "ROC-Kurve" durchgeführt, wobei der binäre Diagnosestatus (ATB vs. Kontrolle) die Zustandsvariable und die Biomarker-Stufen die Testvariable war. Das kombinierte Diagnosemodell wurde mittels binärer logistischer Regression konstruiert, wobei IFN-γ und CD64 als kontinuierliche unabhängige Variablen und der diagnostische Status (ATB=1, Kontroll=0) als abhängige Variable eingegeben wurden. Die Regressionsformel lautete: Logit(P) = -3,274 + 0,082×IFN-γ (pg/mL) + 0,115×CD64%. Der Grenzwert für die kombinierte Detektion basierte auf der modellvorhergesagten Wahrscheinlichkeit, wobei der optimale Schwellenwert durch den Youden-Index bestimmt wurde. Modellvorhergesagte Wahrscheinlichkeiten wurden verwendet, um die kombinierte ROC-Kurve zu erzeugen. Korrelationen wurden mit dem Pearsonschen Koeffizienten berechnet. Ein P-Wert <0,05 definiert die statistische Signifikanz.
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Die diagnostische Wirksamkeit der kombinierten Detektion von IFN-γ und CD64 in ATB
Im Vergleich zur Kontrollgruppe stieg der durchschnittliche Serum-IFN-γ-Wert in der ATB-Gruppe um 22,57 % (21,84 ± 4,23 gegenüber 16,91 ± 4,41 pg/mL, P<0,05), und der mittlere CD64 % stieg um 24,97 % (14,90 ± 4,04 gegenüber 11,18 ± 3,56, P<0,05). Die Analyse der ROC-Kurve zeigte, dass IFN-γ eine diagnostische Sensitivität von 64,00 % und eine Spezifität von 86,00 % für ATB (AUC=0,803, P...
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Diese Studie schlägt einen integrierten diagnostischen und prognostischen Rahmen mit zwei Biomarkern vor, der Serum-IFN-γ (ein Marker adaptiver T-Zell-Immunität) und Neutrophil CD64 (ein Marker der angeborenen Immunaktivierung) für ATB bei immungeschwächten älteren Patienten kombiniert, einer Hochrisikogruppe mit ungedeckten klinischen Bedürfnissen für präzise, nicht-invasive TB-Tests. Die Behandlung von ATB wird durch seine infektiöse Natur und das Potenzial für schwere Erkrankungen ers...
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AU5800 automatischer biochemischer Analysator | Beckman Coulter | B04077 | Ein Instrument, das zur Erkennung und Analyse von Lebenschemikalien verwendet wird. |
| CD14-APC | Agilent | 8730057 | Ein fluoreszierend markierter Antikörper für die Durchflusszytometrie, der das CD14-Antigen speziell erkennt. |
| CD16-FITC | Agilent | 8920064 | Ein fluoreszierend markierter Antikörper für die Durchflusszytometrie, der das CD16-Antigen speziell erkennt. |
| CD64-PE | Agilent | 8730119 | Ein fluoreszierend markierter Antikörper für die Durchflusszytometrie, der das CD64-Antigen speziell erkennt. |
| CytoFLEX LX-Durchflusszytometrie | Beckman Coulter | C00445 | Ein Zellanalysator, der die Fluoreszenzintensität gefärbter Zellmarker misst. |
| IFN-γ ELISA-Kit | Wuhan Jilid Biotechnology Co., LTD | J20272 | Ein Werkzeug, das auf dem doppelten Antikörper-Sandwich-Test zur Detektion von IFN-& Gamma basiert; Konzentrationen. |
| L-J-Medium | Shandong Topu Biological Engineering Co., LTD | M1607 | Ein Medium, das zur Isolierung und Kultur von Mykobakterien wie Mycobacterium tuberculosis verwendet wird. |
| PASS | NCSS | v.15.0 | Eine Software zur Unterstützung von Leistungsanalysen und Stichprobengrößenberechnungen. |
| SPSS | IBM | v.30.0 | Eine Software für Datenverarbeitung, Datenanalyse und Datenvisualisierung. |
| XS-1000i Erythrozytensedimentationsanalysator | Sysmex | V147451 | Ein medizinisches Gerät, das für klinische Bluttests verwendet wird. |