Forschungsartikel

Etablierung von zonenangereicherten Primärkulturen aus dem Nebennierenkortex der Maus

DOI:

10.3791/70403

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8. Mai 2026

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1Division of Endocrinology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Harvard Stem Cell Institute, 4Institute of Biomedical Science, University of São Paulo, 5Broad Institute of MIT and Harvard

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein robuster und reproduzierbarer Ansatz zur Etablierung von 2D-Primärkulturen von Zona-Glomerulosa- und Zona-Fasciculata-angereicherten Zellen wurde für den Nebennieren-Cortex der Maus entwickelt. Dieses System bewahrt wichtige molekulare und funktionelle Merkmale jeder Zone und ermöglicht so eine gezielte Untersuchung von Signalwegen, Hormonproduktion und dem Verhalten der Nebennierenkortikale Zellen ex vivo.

Zusammenfassung

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Die Nebenniere der Maus ist von einer mesenchymalen Zellschicht (Kapsel) eingeschlossen und enthält einen darunterliegenden Kortex, der in klar konzentrische Zonen mit spezialisierten endokrinen Funktionen organisiert ist: die Zona glomerulosa (zG), die Aldosteron produziert, und die Zona fasciculata (zF), die Corticosteron produziert. Die Nebennierenmedulla, die sich im Zentrum der Drüse befindet, produziert Katecholamine. Mechanistische Studien von Zellen aus jeder adrenokortikalen Zone wurden durch das Fehlen von In-vitro-Modellen , die ihre zonenspezifischen molekularen, zellulären und funktionellen Eigenschaften bewahren, eingeschränkt. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde ein Fraktionierungsansatz entwickelt, bei dem Mikrodissektion adulter Maus-Nebennieren verwendet wurden. Diese Methode trennt Nebennierenzellen von männlichen Mäusen in eine zG-angereicherte äußere Fraktion (OF), die Kapsel- und zG-Zellen enthält, sowie eine zF-angereicherte innere Fraktion (IF), die zF- und Medullärzellen enthält. Diese Fraktionen wurden verwendet, um zweidimensionale (2D) Primärkulturen zu erzeugen, die entweder für zG- oder zF-Zellen angereichert wurden. Die Genexpressionsanalyse bestätigte, dass die zG-angereicherten Kulturen hohe Werte von zG-Markern (Cyp11b2, Dab2 und Shh) sowie erhöhte Wnt/β-Catenin-Signalmarker (Wnt4, Lef1) aufweisen. Im Gegensatz dazu wiesen zF-angereicherte Kulturen eine höhere Expression von zF-Markern (Cyp11b1 und Akr1b7) und niedrigere Werte von Wnt/β-Catenin-Signalmarkern auf, was mit einer zF-Transkriptionssignatur übereinstimmt. Die Expression steroidogener Marker (Nr5a1, Star) bestätigte den adrenokortikalen Ursprung beider Zellfraktionen. Tyrosinhydroxylase weist auf das Vorhandensein von Nebennierenmedullärzellen in zF-angereicherten Kulturen hin. Funktionell produzierten zG-angereicherte Kulturen unter basalen Bedingungen Aldosteron und zeigten eine erhöhte Produktion als Reaktion auf Angiotensin II, Kalium und das Adrenokortikotrope Hormon (ACTH). Umgekehrt produzierten zF-angereicherte Kulturen Corticosteron zu Beginn und zeigten eine erhöhte Produktion als Reaktion auf die ACTH-Stimulation. Insgesamt stellt dieses Protokoll ein robustes, reproduzierbares und biologisch relevantes In-vitro-Modell zur Untersuchung der Nebennieren-Kortexbiologie dar. Dieses System ermöglicht zonenspezifische Untersuchungen von Signalwege, molekularen Mechanismen und physiologischen Reaktionen.

Einleitung

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Eine dünne mesenchymale Kapsel umschließt die Nebenniere der Maus, die aus zwei Hauptkompartimenten besteht: dem äußeren Kortex und dem inneren Medulla. Der Nebennierenkortex der erwachsenen männlichen Maus ist weiter in unterschiedliche Zonen unterteilt, die Zona glomerulosa (zG) und die Zona fasciculata (zF), die jeweils einzigartige morphologische und funktionelle Eigenschaften 1,2,3,4 aufweisen. Die Hauptfunktion des Nebennierenkortex ist die Produktion von Steroidhormonen, darunter Mineralokortikoide (Aldosteron) und Glukokortikoide (Kortikosteron bei Mäusen)5. Das zG ist der äußerste und kompakteste Bereich und besteht aus ovalen Zellen, die in Rosettenstrukturen organisiert sind und Aldosteronsynthase (CYP11B2) exprimieren, was die Produktion von Aldosteron 2,3,5,6,7 ermöglicht. Die Sekretion von Aldosteron wird hauptsächlich durch das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS), Kalium und in geringerem Maße durch ACTH 5,8 geregelt. Das zF besteht aus größeren Zellen, die in radialen Strängen/Faszikeln angeordnet sind, macht den Großteil (~85 %) des Kortex aus und wird hauptsächlich durch ACTH 2,3,5,9 reguliert. Mehrere Signalwege steuern die Entwicklung, Wartung und Funktion der Nebennieren, indem sie die Dynamik, Zonation und steroidogene Aktivität der Vorläuferzellen regulieren. Unter diesen ist SF-1 (Steroidogener Faktor-1, Nr5a1) ein Hauptregulator, der für die adrenokortikale Spezifikation, Proliferation und Hormonproduktionunerlässlich ist. Die Schall-Igel-(Shh)-Signalübertragung, die im zG aktiv ist, fördert die Expansion der Vorläuferzellen und unterstützt die kortikale Erneuerung im zG 11,12,13.

Die Wnt-Signalübertragung, insbesondere über den kanonischen β-Catenin-Weg, ist entscheidend für die Nebennierenzonation und die kortikale Integrität. Bei der Maus werden die normale Adrenokortikalgröße und Zonation durch einen Gradienten der WNT-Signalaktivität reguliert, der sich von der Kapsel bis zum zF erstreckt. Dieser Gradient wird durch eine lokale Expression von WNT-Liganden und Potentiatoren unterstützt, hauptsächlich WNT4 im zG sowie WNT2B und R-Spondine (RSPO1 und/oder RSPO3) in der Kapsel 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . Der Nebennierenkortex wird durch den zentripetalen Fluss von Zellen aus proliferativen Vorläuferzellen im subkapsularen/äußeren zG-Bereich aufrechterhalten, welche differenzierte zG-Zellen hervorbringen, die nach innen zum zF wandern. Wenn Zellen vom zG zum zF übergehen, unterliegen Veränderungen in der Genexpression und Funktion, die als Transdifferenzierung bezeichnet werden. Dieses Modell wurde durch Linienverfolgungsstudien mit der transgenen Mauslinie ASCre/+ stark unterstützt, die speziell aldosteronproduzierende Zellen im zG 23,24,25 anvisiert.

Mehrere in-vitro-Ansätze wurden verwendet, um die Nebennierenbiologie basierend auf der Dissoziation der gesamten Nebenniere zu untersuchen 26,27,28. So beschrieb beispielsweise eine Studie die Dissoziation des Nebennierenkortex für elektrophysiologische und Patch-Clamp-Analysen27, und eine weitere Studie nutzte dissoziierte Nebennierenkortikale Zellen, um Signalmechanismen im Zusammenhang mit der Nebennierenphysiologie und der Blutdruckregulationzu untersuchen 26. Obwohl diese Methoden wichtige funktionelle Erkenntnisse geliefert haben, basieren sie auf Zellen ganzer Nebennierenpräparate und nicht auf der Trennung der kortikalen Zonen vor der Zellkultur.

Angesichts der Komplexität und histologischen Vielfalt der Nebenniere ist das Verständnis der unterschiedlichen Funktionen ihrer zellulären Kompartimente unerlässlich, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Nebennierenfunktion zu erklären. In dieser Studie wurden primäre adrenokortikale Zellkulturen der Maus, angereichert für entweder zG- oder zF-Zellen, etabliert. Ein großer Vorteil dieser Methode ist die Erzeugung von zG-angereicherten Zellkulturen, die eine experimentelle Modulation von Signalwegen und Umweltfaktoren ermöglichen, um ihre spezifische Rolle in der Biologie des Nebennierenkortex besser zu untersuchen. Dazu gehören die Untersuchung der Erhaltung der Vorläuferzellen, der Mechanismen der zonalen Plastizität und Transdifferenzierung hin zum zF sowie die Modellierung der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix. Parallel dazu erzeugt diese Methode hochangereicherte zF-Zellkulturen, die eine komplementäre Plattform für zonenspezifische funktionelle und signalisierende Studien bieten. Zusammen bieten diese Merkmale ein robustes, experimentell kontrolliertes System zur Weiterentwicklung des Verständnisses der Nebennierenbiologie.

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Protokoll

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Alle Experimente wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Boston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) unter der Genehmigungsnummer 00002611 genehmigt wurden. Eine vollständige Liste aller in diesem Protokoll verwendeten Materialien, einschließlich Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Ausrüstung, ist in der Materialtabelle zusammen mit den entsprechenden Herstellern und Katalognummern bereitgestellt, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

Primärkulturen von Maus-Adrenalzellen von Zona glomerulosa und Zona fasciculata-Zellen
Die in dieser Studie verwendeten Methoden zur Etablierung von Primärkulturen adulter männlicher Maus-Wildtyp-Zellen (Mus musculus, C57BL/6) wurden aus einem ursprünglich für Sprague-Dawley-Ratten28 entwickelten Verfahren adaptiert. Um die Segregation und Identität der Zellpopulationen von Zona glomerulosa und Zona fasciculata zu bestätigen, wurde ein Linienverfolgungsmodell verwendet, das Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (auch bekannt als Cre) Mäuse 1,2,3,4 und Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (auch bekannt als ROSAmT/mG) Mäuse29 verwendet.

Vorbereitung vor dem Eingriff
Materialien
Zwei Sätze von Zangen und Scheren für oberflächliche Schnitte und ein weiteres Set für den Schnitt in der Bauchhöhle (ergänzende Abbildung 1A). Erwärmte das Kulturmedium und PBS (37 °C). Ich habe 2 Gerichte (P60) mit DMEM/F-12 vorbereitet. Bereitete 3 Gerichte (P60) mit erwärmtem PBS vor, um die Drüsen nacheinander zu waschen (Bad 1, 2 und 3) (ergänzende Abbildungen 1B, 1–3), und 1 Gericht, um die Nebenniere in Lösung zu halten (ergänzende Abbildungen 1B, 4). Bereitete 2 Gerichte (P60) mit sterilem Filterpapier auf der Oberfläche vor (ergänzende Abbildungen 1C, 1–2). Er bereitete 2 P60-Gerichte mit 500 μL Verdauungslösung vor und beschriftete sie für die Glomerulosa (zG) oder die Fasciculata (zF) (ergänzende Abbildungen 1D, zG, zF). Ich habe 2 Tuben vorbereitet, mit zG und zF beschriftet, und 4,5 ml Verdauungslösung hinzugefügt.

Lösungen
Zur Herstellung der Verdauungslösung wurden Kollagenase Typ I (Endkonzentration 4 mg/mL) und DNase I (Endkonzentration 0,04 mg/mL) in 5 mL reines DMEM/F-12-Medium gelöst. Die Lösung wurde mit einer Spritze und einem 0,22 μM-Filter in ein 50-mL-Rohr gefiltert. Die Verdauungslösung sollte jedes Mal frisch vorbereitet werden.

Tiere
Um Primärkulturen zu erhalten, die für Maus-Adrenalzellen von Zona glomerulosa und Zona fasciculata angereichert sind, werden 10–15 junge erwachsene männliche Mäuse im Alter von etwa 6–7 Wochen verwendet. Weibchen haben etwas größere Nebennieren als Männchen, und beide Geschlechter können mit diesem Protokoll verwendet werden. In dieser Studie wurden jedoch nur Männchen verwendet, um potenzielle Interferenzen durch die X-Zone bei jungen Weibchen zu vermeiden und so eine genaue zonale Trennung zu gewährleisten. Mäuse wurden gemäß den institutionellen Richtlinien zur Tierpflege durch CO₂-Inhalation eingeschläfert. Der Tod wurde durch das Ausbleiben der Atmung und das Ausbleiben von Reflexreaktionen bestätigt. Die Nebennieren wurden sofort innerhalb von 3–5 Minuten nach Bestätigung des Todes seziert, um die Gewebelebensfähigkeit zu erhalten.

Position und Sichtbarkeit des Bauches
Die Maus wurde in eine dorsale Decubitus-Position auf einer sterilen, flachen Oberfläche gelegt (Abbildung 1A). Das Fell des Tieres wurde mit 70 % Alkohol desinfiziert. Für die Hautschnitte wurden Zange und Schere verwendet, der zweite Satz für den Bauchhöhlenschnitt. Ein erster Schnitt im Leistenbereich des Bauches wurde gemacht, der sich seitlich zum Thorax auf beiden Seiten erstreckt, um das Peritoneum freizulegen (Abbildung 1B). Die Haut wurde vorsichtig zurückgezogen, gefolgt von der Bauchmuskulatur, um die Bauchhöhle freizulegen (Abbildung 1C). Der erste Schnitt sollte oberflächlich sein, um Schäden an den inneren Organen zu vermeiden. Führe vorsichtig bis zur Muskelschicht voran und lege dann die Bauchhöhle frei. Vermeiden Sie ein Platzen der Blutgefäße, da Blutungen es erschweren können, die Nebennieren zu orten und die Entnahme zu verzögern. Wechseln Sie chirurgische Instrumente, um eine mikrobielle Kontamination zu minimieren.

Identifikation und Entnahme der linken Nebenniere
Die linke Nebenniere befindet sich medial und liegt oberhalb der linken Niere im Retroperitoneum, mit ovaler Form und rosa Färbung, umgeben von weißem Fettgewebe (Abbildungen 1D–G). Während benachbarte Organe vorsichtig mit einer stumpfen Zange verdrängt werden, um die Sichtbarkeit zu verbessern, verwenden Sie eine Schere, um den Großteil des Fettgewebes mit kurzen, kontrollierten Schnitten zu entfernen, wodurch die Nebenniere isoliert wird. Vermeiden Sie es, die Nebenniere direkt zu greifen, um Schäden an der Kapsel zu vermeiden. Die Drüse wurde unmittelbar nach der Isolierung in eine P60-Kulturschale mit 10 ml vorgewärmtem DMEM/F-12 bei 37 °C (Abbildung 1F) platziert.

Identifikation und Sammlung der rechten Nebenniere
Die rechte Nebenniere befindet sich seitlich und liegt oberhalb der rechten Niere im Retroperitoneum, mit ovaler Form und rosa Färbung (Abbildungen 1E–H). Die Identifikation dieser Nebenniere kann aufgrund ihrer Nähe zu anderen Organen wie der Leber und dem aufsteigenden Dickdarm sowie nahegelegenen Blutgefäßen schwieriger sein. Während Sie benachbarte Organe vorsichtig mit einer stumpfen Zange verdrängen, um die Sichtbarkeit zu verbessern, verwenden Sie eine Schere, um den Großteil des Fettgewebes mit kurzen, kontrollierten Schnitten zu entfernen, wobei die Nebenniere isoliert wird und dabei darauf achtet, die Kapsel nicht zu beschädigen. Die Drüse wurde unmittelbar nach der Isolierung in eine P60-Kulturschale mit 10 ml vorgewärmtem DMEM/F-12 bei 37 °C platziert. Die Nebennieren sind in derselben Schale vereint (Abbildung 1F). Während des Eingriffs ist es wichtig, die wichtigsten Blutgefäße im Bereich vorsichtig zu behandeln, um versehentliche Schnitte zu vermeiden, die Blutungen verursachen und den Entnahmeprozess erschweren können. Die wichtigsten Gefäße, auf die man achten sollte, sind die Nierenvenen und Nierenarterien. Die Nebenniere wurde mit etwas anhaftendem Fettgewebe aufgenommen. Dies erleichtert die Handhabung der Drüse und schützt vor Kapselschäden und Kontaminationen (Abbildung 1I).

Arbeit in einer sterilen laminaren Flusshaube
Bevor die Drüsen in die laminare Flusshaube übertragen wurden, wurde die Schale mit 70 % Alkohol abgewischt. Die Nebennieren wurden dreimal mit PBS bei Raumtemperatur (25 °C) gewaschen (in Schalen 1, 2 und 3 und gesammelt in Schüssel 4) (ergänzende Abbildung 1B). Das Filterpapier hilft bei der Fetthaftung und sorgt für bessere Ergebnisse. Während der Vorbereitung mehrerer Drüsen sollten die getrennten Gewebe in vorgewärmtem DMEM erhalten bleiben, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Die Nebenniere wurde vom anhaftenden Fettgewebe erfasst (Abbildungen 1I–J), und das Fett wurde sorgfältig auf dem Filterpapier (ergänzende Abbildung 1C, Schüssel 1) mit feiner Pinzette und kontrollierten Bewegungen seziert, um die Kapsel nicht zu beschädigen. Das erwartete Ergebnis ist eine glatte, intakte Drüse ohne überschüssiges Fett- und Bindegewebe, wie in Abbildung 1K dargestellt. Die Nebennieren wurden vorsichtig auf frisches Filterpapier übertragen (ergänzende Abbildung 1C, Schüssel 2), um eine präzise Mikrodissektion zu ermöglichen. Die Kapsel wurde vorsichtig mit einer feinen Zange zusammengezogen, und mit der Skalpellklinge wurde ein radialer Schnitt in der Drüse gemacht, ohne das Gewebe vollständig zu durchschneiden.

Der innere Inhalt des Kortex wurde sanft freigelegt, indem er durch den Schnitt durch leichten mechanischen Druck mit der Pinzette nach außen gestoßen wurde. Die Kapsel und der zG blieben mit der Spitze der Zange verbunden, während das innere ausgestoßene Drüsenmaterial mit dem zF und der Medulla entsprach. Die enzymatische Verdauung sollte erst eingeleitet werden, nachdem alle Drüsen verarbeitet wurden (Abbildung 1L), aufgrund der mechanischen Trennung der äußeren und inneren Zone.

Verdauung
Zwei Röhrchen waren als OF (äußerer Anteil: Kapsel und zG) oder IF (Innenanteil: zF und Medulla) gekennzeichnet (Abbildung 1M). Insgesamt wurden 4,5 ml vorgewärmte Verdauungslösung (37 °C) hinzugefügt, und OF und IF wurden in die entsprechenden Röhren übertragen. Die Proben wurden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ für 30 Minuten inkubiert, und die Röhren wurden alle 10 Minuten sanft gewirbelt, indem sie manuell 2–3 Mal invertiert wurden, um eine gleichmäßige Exposition gegenüber der Enzymlösung sicherzustellen. Die für die Verdauung benötigte Zeit kann je nach Qualität, Aktivität und Speicherbedingungen der Kollagenase variieren. Nach 30 Minuten wurde das Gewebe durch 40-faches Auf- und Abpipettern mit langsamen, kontrollierten Stößen dissoziiert, wobei eine 5-mL serologische Pipette verwendet wurde, um eine Einzelzell-Schlamm zu erzeugen. Nach der Dissoziation des Gewebes sollten idealerweise keine sichtbaren Fragmente mehr übrig bleiben und das Medium trüb erscheinen. Wenn noch Fragmente vorhanden sind, kann eine zusätzliche 15-minütige Verdauung in Betracht gezogen werden.

Waschen und Plattieren
Nach der Verdauung wurden die Zellen durch Zugabe von 45 ml DMEM/F-12 gewaschen, um das Restenzym zu entfernen (Abbildung 1 M). Die Proben wurden bei 150 × g für 12 Minuten bei Raumtemperatur (25 °C) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird ein kleines und kompaktes Pellet mit leicht rosafarbenem bis blassgelbem Aussehen erwartet, während das Supernatant klar und frei von sichtbaren Partikeln bleiben sollte. Das Supernatant wurde vorsichtig entfernt und weggeworfen, wobei darauf geachtet wurde, das Pellet nicht zu stören. Die Kugel wurde in vorgewärmtem (37 °C) Kulturmedium entsprechend dem für die Plattierung benötigten Volumen (siehe unten) wieder aufgehängt. Eine optimale Beschichtungsdichte von etwa 70 % wurde aufrechterhalten, um die Kultur lebensfähig und vitalisiert zu gewährleisten. Die Zellanzahl wurde vor dem Galvanisieren mittels einer Neubauer-Zählkammer geschätzt, und die Anzahl der ausgesäten Zellen wurde entsprechend dem Bereich der Kulturschale angepasst, um die gewünschte Konfluenz zu erreichen. Platten werden die zG-angereicherten äußeren Fraktionszellen (OF) mit einer Dichte von etwa einem Tier pro Bohrloch (typischerweise ~1,5–2,5 × 104Zellen ) und die zF-angereicherten Innenfraktionszellen (IF) mit ~0,63 Tieren pro Bohrloch (typischerweise ~2,5–4,0 × 104 Zellen) in einer 48-Well-Platte plattiert.

Erhaltung der Zellkultur
Die Zellen wurden im oben beschriebenen Kulturmedium kultiviert und unter Standardbedingungen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ aufrechterhalten. Nach 24 Stunden Kultur wurde das Medium ersetzt, um Rückstände und eventuelle Restblutzellen zu entfernen. Dieser Schritt fördert ein optimales Wachstum. Der Teller wurde sorgfältig aspiriert und frisches, vorgewärmtes (37 °C) Medium hinzugefügt. Warten Sie mindestens 48 Stunden, bevor Sie die Zellen in funktionellen Experimenten beurteilen. Es wird empfohlen, drei Tage vor funktionellen Experimenten zu warten, um sicherzustellen, dass die Kulturen gut etabliert sind. Eine längere Kultur über diesen Zeitraum hinaus kann eine Trypsinisierung und Übertragung erfordern, was zu Zellselektion und zum Verlust primärer Kulturmerkmale führen kann.

Datenanalyse und unterstützende Verfahren
Herstellung primärer Nebennierenkulturen
Primärkulturen ganzer Nebennieren wurden nach denselben Verfahren für Gewebeentnahme, Verdauung, Waschen und Beschichtung eingerichtet und als Standardkontrollen für molekulare und funktionelle Tests verwendet.

Genexpressionsanalyse
Um die gesamte RNA aus OF- und IF-Zellen zu reinigen, wurden die kultivierten Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers in TRIReagent mit dem RNA-Kit homogenisiert. Die Integrität und Konzentration der RNA wurden mittels Spektrometrie bewertet. Die weitere Verarbeitung der Gesamt-RNA beinhaltete die Reverse-Transkription in cDNA mit dem hochkapazitä cDNA-Reverse-Transkriptionskit. Die Genexpressionsanalyse wurde mittels Echtzeit-quantitativer PCR (qPCR) mit dem Thermocycler durchgeführt. Technische Duplikate wurden verwendet, um die Variabilität zu kontrollieren. Der TaqMan Universal PCR Master Mix und die TaqMan-Mausprimer wurden verwendet (Tabelle 1). Für jede doppelte Probe wurde innerhalb des linearen Verstärkungsbereichs (CT) ein Zyklus-Schwellenwert (CT) ausgewählt. Sie wurde durch endogene Kontrollgene β-Aktin und das ribosomale Protein 18S (Rps18) normalisiert. Die relativen Expressionsniveaus wurden mit der 2–ΔΔCt-Methode 30 berechnet. Die Daten aus drei verschiedenen Experimenten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Wir führten drei unabhängige Experimente durch.

Stimulation der Aldosteron- und Kortikosteronsekretion in primären ZG- und ZF-Kulturen
Primärkulturen von Zona glomerulosa (ZG) und Zona fasciculata (ZF) Zellen wurden etabliert und bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ erhalten. Etwa 5 × 104 Zellen wurden pro Bohrloch in einer 48-Well-Platte mit vollständigem Wachstumsmedium plattiert. Nach vier Tagen kontinuierlicher Kultur spiegelten die Basalsekretionsmessungen die kumulative Hormonproduktion über diesen Zeitraum wider. Für Stimulationstests wurde das Medium aspiriert, und die Zellen wurden einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, um Restfaktoren zu entfernen. Anschließend wurden jedem Bohrloch 200 μL frisches Medium hinzugefügt, und die folgenden Assays stellen eine akute stimulierte Sekretion innerhalb eines definierten Zeitfensters dar. Für Aldosteron-Stimulationstests wurde das Kulturmedium mit Angiotensin II (Ang II, 10 nM), Kalium (K+), als Kaliumchlorid (KCl, 10 mM) und ACTH (10 nM) ergänzt. Natriumchlorid (NaCl, 10 mM) wurde als Fahrzeugsteuerung verwendet. Für Corticosteron-Stimulationstests wurden die gleichen Verfahren angewendet, jedoch wurde das Medium mit ACTH (10 nM), Forskolin (10 μM) oder NaCl (10 mM) als Kontrollmittel ergänzt. Nach 6 Stunden Inkubation bei 37 °C und 5 % CO₂ wurden die Kultursupernatanten gesammelt und bei −80 °C für die anschließende Hormonquantifizierung gelagert, wie zuvorbeschrieben 31. Die verbleibenden adhärenten Zellen wurden zur Proteinextraktion lysiert, und die Hormonspiegel wurden auf den Gesamtproteingehalt des entsprechenden Lysats normalisiert.

Proteinextraktion und Normalisierung von Aldosteron- und Kortikosteronmessungen
Die Proteinextraktion erfolgte mit RIPA-Lyse und Extraktionspuffer, ergänzt durch einen 1x-Stop-Protase-Inhibitor-Cocktail. Die Zellen wurden durch 15-mal auf- und ab-Pipettieren mit einer P200-Pipettenspitze wieder aufgehängt und anschließend mit einem Sonikator soniziert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.

Aldosteronmessung mittels Radioimmunoassay (RIA)
Die Konzentration von Aldosteron in Zellkultur-Supernatanten wurde durch Befolgung des Protokolls des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt, wurden 50 μL Supernatant und 150 μL 1 % BSA in PBS zusammen mit 500 μL des radioaktiven Aldosteron-Tracers zu aldosteron-antikörperbeschichteten Röhrchen hinzugefügt. Nach dem Mischen wurden die Röhren bei Raumtemperatur (25 °C) für 18 Stunden inkubiert. Anschließend wurde das Inkubationsgemisch dekantiert und die Radioaktivität in den Röhren mit einem Cobra-II-Auto-Gamma-Zähler31 gezählt. Die Aldosteronwerte wurden wie zuvor beschrieben auf das Gesamtprotein normalisiert.

Corticosteron-Messung
Die Corticosteronkonzentrationen in Zellkultur-Supernatanten wurden mit einem Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)-Kit gemessen, das spezifisch für Maus- und Rattencorticosteron ist, nach dem Protokoll des Herstellers. Die Corticosteronwerte wurden auf das Gesamtprotein normalisiert, wie zuvorbeschrieben 32.

Immunfärbung
Die Immunfluoreszenz wurde sowohl an paraffin-eingebetteten Nebennieren als auch an kultivierten Zellen, die auf vorbehandelten Glasdeckschichten mit Poly-L-Lysin gezüchtet wurden, durchgeführt. Bei allen Proben wurde die Blockierung mit 5 % normalem Ziegenserum (NGS) in PBS durchgeführt, und die Kerne wurden mit DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindol, 1:1000) gegenfärbt. Folien und Deckfolien wurden dreimal für jeweils 5 Minuten gewaschen, mit 0,1 % Tween-20 in PBS zwischen den Inkubationsschritten. Nach der Färbung wurden die Proben mit Antifade Mountant montiert und bis zur Bildaufnahme im Dunkeln aufbewahrt. Gewebeschnitte: Nebennierenparaffinschnitte wurden in Xylol deparaffinisiert, dann durch eine graduierte Ethanolserie (100 %, 95 %, 70 %) gespült und schließlich mit PBS gespült. Die Antigengewinnung erfolgte im Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 0,05 % Tween-20, pH 9,0) durch Erhitzen bei 95 °C für 20 Minuten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Abschnitte in PBS gewaschen und mit 5 % NGS in PBS für 1 Stunde blockiert. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert, wobei folgende primäre Antikörper mit 1:100 in 5 % NGS in PBS verdünnt wurden: Maus-Anti-Dab2, Hühner-Anti-GFP und Kaninchen-Anti-RFP. Folgende sekundäre Antikörper wurden verwendet (1:300): Alexa Fluor 594 Ziegen-Anti-Maus-IgG, Alexa Fluor 594 Ziegen-Anti-Huhn-IgY und Alexa Fluor 647 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG.

Kultivierte Zellen: Die Immunfluoreszenz auf Deckblättern wurde vier Tage nach der Plattierung durchgeführt. Die Zellen wurden mit vorgewärmtem 4%-Paraformaldehyd (PFA) bei 37 °C für 15 Minuten fixiert und dreimal mit PBS gewaschen. Das Blockieren erfolgte mit 5 % NGS in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Deckzettel wurden über Nacht bei 4 °C mit Maus-Anti-Dab2 (1:100 in 5 % NGS/PBS) inkubiert, gefolgt von Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus (1:500).

Bildaufnahme: Hellfeld- und Fluoreszenzbilder (mGFP und mTomato) von kultivierten Zellen wurden mit einem Mikroskopsystem aufgenommen. Die mGFP-Fluoreszenz wurde mit einem Filter für grüne Fluoreszenz erfasst (Anregung: 470 nM, Emission: 525 nM), und die mTomato-Fluoreszenz wurde mit einem Filter für rote Fluoreszenz erfasst (Anregung: 585 nM, Emission: 624 nM).

Software und statistische Analyse
Visuelle Zusammenfassungen, Schaltpläne und Abbildungen wurden mit Adobe Illustrator 2023 (Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html) und BioRender (https://www.biorender.com) erstellt, die im Mai 2025 abgerufen wurden. Die Daten wurden mit GraphPad Prism Version 10.0 analysiert. Verfügbar unter: https://www.graphpad.com. Alle Experimente wurden mindestens dreifach durchgeführt und unabhängig wiederholt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde der Schüler-t-Test (je nach Bedarf gepaart oder ungepaart) verwendet. Für Vergleiche mit drei oder mehr Gruppen wurde eine Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt vom entsprechenden Post-hoc-Test durchgeführt, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu identifizieren. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

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Etablierung und Charakterisierung von zonenangereicherten primären Nebennierenkulturen
Primäre Nebennierenkulturen wurden erfolgreich aus dem OF, angereichert für zG-Zellen, und dem IF, angereichert für zF-Zellen, hergestellt. Repräsentative Bilder der kultivierten Zellen sind in Abbildung 2A (OF–zG) und Abbildung 2B (IF–zF) dargestellt. Zur Bewertung der Anreicherung von zG-Zellen und Nicht-zG-Zellen in dies...

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Diskussion

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In dieser Studie wurde ein verfeinertes Protokoll vorgestellt, das primäre Maus-Nebennierenkulturen erzeugt, die für zG- (OF)- und zF-(IF)-Zellen angereichert sind, welche die zonale Identität und steroidogene Funktion jeder Zone getreu wiedergeben. Dieses Protokoll sollte eine detaillierte Untersuchung der zellulären und molekularen Biologie des Nebennierenkortex in einem zonenspezifischen Kontext ermöglichen und die Untersuchung von Proteinen, Signalwegen und Mechanismen unterstützen, ...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen in Bezug auf diese Studie haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von FAPESP (São Paulo Research Foundation, Brasilien), Projektnummer 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L) sowie Unterstützung durch 2R01DK123694 (an DTB) und Mittel der Abteilung für Endokrinologie am Boston Children's Hospital (DTB) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Konischer Rohr (50 mL )Corning (Corning, NY, USA)352070Steril
0,22 µm SpritzenfilterMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)SLGV033RSFiltration der Verdauungslösung
10 mL EinwegspritzeBD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)300912Steril
5 mL Serologische PipetteCorning (Corning, NY, USA)4487Steril
10 mL Serologische PipetteCorning (Corning, NY, USA)4488Steril
Gefilterte Pipettenspitzen (P200)Axygen (Union City, CA, USA)TF-200-R-SSteril
Gefilterte Pipettenspitzen (P1000)Axygen (Union City, CA, USA)TF-1000-R-SSteril
P60 KulturschaleCorning (Corning, NY, USA)430166Gewebekulturbehandelt
48-Well-PlatteCorning (Corning, NY, USA)3527Gewebekulturbehandelt
Steriles FilterpapierN/AN/AFettentfernung und Unterstützung bei der Dissektion
DMEM/F-12 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)113200331:1 Formulierung
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10082147Wärme-inaktiviert
ITS-SupplementGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)41400045100X
GlutaMAX-SupplementGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)35050061100X
Penicillin-Streptomycin (100X)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)15140122Antibiotikum
PBS 1XGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10010023pH 7,4
Collagenase Typ IGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)17100-017Gewebeverdauung
DNase ISigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)DN25-1Gewebeverdauung
Angiotensin II (Ang II)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A9525Hormonstimulation
Adrenocorticotropes Hormon (ACTH)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A0298Hormonstimulation
ForskolinSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)F6886cAMP-Stimulation
Kaliumchlorid (KCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)P9541Aldosteronstimulation
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)S7653Fahrzeugkontrolle
Kleine chirurgische SchereFine Science Tools (Foster City, CA, USA)14060-09Dissektion
Skalpell mit EinwegklingeFine Science Tools (Foster City, CA, USA)10003-12Mikrodissektion
FeinzangeFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11252-00Dissektion
Gekrümmte ZangeFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11251-10Dissektion
Laminar Flow-HaubeThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/ASterile Gewebeverarbeitung
InkubatorThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/AZellkultur
ZentrifugeEppendorf (Hamburg, Germany)N/AZellpelletierung
Neubauer-ZählkammerHausser Scientific (Horsham, PA, USA)1490Zellzählung
RIPA-Lyse- und ExtraktionspufferThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)89901Proteinextraktion
Halt Protease Inhibitor CocktailThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)87786Proteinextraktion
Fisherbrand Modell 120 Sonic DismembratorThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)FB120Sonifizierer
RIA-SystemTecan (Männedorf, Switzerland)MG13051Hormonquantifizierung
Cobra II Auto-Gamma-ZählerBerthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)N/ARadioaktivitätsmessung
Corticosteron-ELISA-Kit (96-Well)Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)55-CORMS-E01Hormonmessung
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)P36930Montagemedium
Maus-anti-Dab2BD Biosciences (San Jose, CA, USA)610464Primärantikörper
Huhn-anti-GFPAves Labs (Tigard, OR, USA)GFP-1020Primärantikörper
Kaninchen-anti-RFPRockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)600-401-379Primärantikörper
Alexa Fluor 594 Ziege anti-MausInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11005Sekundärantikörper
Alexa Fluor 594 Ziege anti-HuhnInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11042Sekundärantikörper
Alexa Fluor 647 Ziege anti-KaninchenInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-21244Sekundärantikörper
Alexa Fluor 488 Ziege anti-MausThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)A-11001Sekundärantikörper
EVOS MikroskopsystemThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/ABildgebung
TRI ReagentSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)T9424RNA-Extraktion
Direct-zol RNA-KitZymo Research (Irvine, CA, USA)R2050RNA-Reinigung
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)ND-1000RNA-Quantifizierung
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)4304437qPCR
QuantStudio 6 Flex ThermocyclerLife Technologies (Carl

Referenzen

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ZonenanreicherungNebenniere der MausMikrodissektionGenexpressionZona glomerulosaZona fasciculatasteroidogene MarkerWnt Beta Catenin

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