Messung der Abflussanlage und der Augencompliance in ex vivo Mausaugen mit einem Spritzenpumpensystem

Zusammenfassung

Die Integration analytischer Ansätze etablierter druckkontrollierter Perfusionsmethoden optimierte ein einfaches, kostengünstiges Spritzenpumpensystem zur Bewertung der Ausflussanlage und der Augencompliance bei Mausaugen.

Zusammenfassung

Die Aufrechterhaltung des intraokularen Drucks (IOP) auf einem geeigneten und stabilen Niveau ist für die Augengesundheit unerlässlich. Die biomechanischen Eigenschaften des trabekulären Netzwerks (TM), des Schlemm-Kanals (SC) und der gesamten Corneoskleralschale spielen eine entscheidende Rolle bei der IOP-Homöostase. Abflussanlage (C) ist ein Schlüsselparameter zur Bewertung der Wirksamkeit von TM und SC beim Ablassen von Wasserhumor, während die okulare Compliance (φ) die Elastizität der Corneoskleralschale und des vorübergehenden Abflusses durch TM und SC widerspiegelt. Zuvor wurde ein einfaches, kostengünstiges Spritzenpumpensystem zur Bewertung von C entwickelt. Die Verwendung einfacher linearer Regression für die In-vivo-Datenanalyse hat jedoch Einschränkungen bei der Charakterisierung von TM- und SC-Funktionen. In dieser Studie wurde das Spritzenpumpensystem durch Anwendung analytischer Ansätze optimiert, die für etablierte druckgesteuerte Augenperfusionssysteme entwickelt wurden. Die gemessenen C- und φ-Werte in ex vivo Augen wurden mit zuvor veröffentlichten Perfusionssystemwerten verglichen und stimmten mit diesen berichteten Bereichen überein. Zusammenfassend erleichtert dieses unkomplizierte, kostengünstige Spritzenpumpensystem die Bewertung der biomechanischen Eigenschaften von TM und SC.

Einleitung

Die Aufrechterhaltung eines geeigneten und stabilen Intraokulardruckniveaus (IOP) ist für die Augengesundheit^{unerlässlich 1}. Die anhaltende Erhöhung von IOP ist der Hauptrisikofaktor für Glaukom ^2,3. Langfristige IOP-Schwankungen über Monate oder Jahre tragen ebenfalls zum Sehverlust^{bei 4,5}. Neuere Studien identifizierten eine weitere Form der IOP-Schwankungen, vorübergehende Schwankungen, die durch tägliche Aktivitäten verursacht werden und ebenfalls das Fortschreiten des Glaukoms^{beschleunigen können.} Zum Beispiel zeigten ein 46-jähriger Mann mit 20 Jahren Lidreibung und ein 52-jähriger Mann, der sich 10 Jahre lang die Augen gerieben hatte, beide eine beschleunigte Schädigung der Sehnervenscheiben ^8,9. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung zeitnader und angemessener Reaktionen auf die Veränderungen im IOP, um das Risiko eines Sehverlusts zu minimieren.

IOP wird durch das Gleichgewicht zwischen der Produktion von wässrigem Humor (AH) und seiner Entwässerung¹⁰ geregelt. AH verlässt das Auge hauptsächlich über die konventionellen und uveoskleralen Bahnen¹¹. Sowohl bei normalen als auch bei glaukomatösen Augen ist der konventionelle Weg aus dem trabekularen Netz (TM) und dem Schlemm-Kanal (SC) die Hauptquelle des Ausflusswiderstands, der die IOP-Homöostase 12,13,14 beeinflusst. Daher sind die biomechanischen Eigenschaften von TM und SC entscheidend, damit sich das Auge an Veränderungen in IOP 15,16,17 anpassen kann.

Jüngste technologische Fortschritte haben eine genauere Bewertung des AH-Abflusses ermöglicht. Invasive Ansätze wie schwerkraftbasierte Perfusion und das Spritzenpumpensystem wurden entwickelt, um die Abflussanlage (C) zu berechnen, die zeigt, wie TM und SC den stationären Abfluss^regulieren 18,19,20,21,22,23,24. Nicht-invasive Methoden wie Tonographie²⁵ und Fluorophotometrie²⁶ wurden klinisch eingesetzt, um C bei Patienten mit Glaukom zu bestimmen. Die meisten Ansätze sind jedoch nicht in der Lage, TM- und SC-Funktionen speziell zu bewerten. Beispielsweise werden im Spritzenpumpensystem die Stationäre Durchfluss- und Druckdaten mittels einfacher linearer Regression angepasst, und die Steigung wird als druckabhängiges C interpretiert. Dieses berechnete C bei lebenden Mäusen kann jedoch die AH-Abflusskapazität über den konventionellen Weg nicht genau widerspiegeln, da es von der AH-Sekretion, dem uveoskleralen Ausfluss und dem episcleralen Venendruck beeinflusst wird, wie in der Goldmann-Gleichung beschrieben.

Um diese Einschränkung zu beheben, berechneten Millar et al. den AH-Zufluss, den konventionellen Abfluss und den uveoskleralen Abfluss im selben Mausauge anhand mehrerer konstanter Strömungsmessungen, basierend auf der Annahme eines fehlenden AH-Zuflusses, keines episkleralen Venendrucks und unveränderten uveoskleralen Abflusses nach der Euthanasierung²². Im Jahr 2016 berichteten Sherwood et al., dass der uveosklerale Ausfluss in ex vivo Augen bei 0 mmHg 0 beträgt, und beantworteten diese Frage, indem sie ein Potenzgesetzmodell mit iPerfusion (ein druckkontrolliertes Perfusionssystem, im Folgenden als Perfusionssystem bezeichnet) einführten27. Die methodischen Fortschritte haben die unterschiedlichen Rollen von TM und SC klargestellt und das Verständnis ihrer physiologischen Funktionen bei der Aufrechterhaltung eines stationären AH-Abflusses verbessert.

Darüber hinaus ist die vorübergehende Reaktion von TM und SC auf IOP-Schwankungen unerlässlich, um die IOP-Homöostase aufrechtzuerhalten. Um diese Bewegung zu verfolgen, entwickelten Xin et al. die phasensensitive optische Kohärenztomographie (OCT), die eine Beobachtung auf einer Zeitskala von²⁸ Sekunden ermöglicht. Die dreidimensionale serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie kann diese Bewegung auf ultrastruktureller^{Ebene 29} untersuchen. Bildbasierte Methoden schätzen jedoch nur die biomechanischen Eigenschaften von TM und SC und liefern keine tatsächlichen Werte der vorübergehenden AH-Drainage. Im Jahr 2019, nach der Entwicklung von iPerfusion, berechneten Sherwood et al. die okulare Compliance (φ) als Schlüsselindikator sowohl für die corneosklerale Elastizität als auch für die transiente Antwort von TM und SC³⁰. Dieser Fortschritt bietet einen quantitativen Parameter zur Bewertung der vorübergehenden Verhaltensweisen von TM und SC als Reaktion auf IOP-Schwankungen.

Basierend auf diesen Fortschritten bei der Bewertung der TM- und SC-Funktion verbesserte diese Studie das Spritzenpumpensystem, indem das Potenzgesetzmodell für die C-Berechnung integriert und neue Methoden zur Berechnung φ integriert wurden. Diese Messungen wurden mit veröffentlichten Daten verglichen mit dem Perfusionssystem, um zu bewerten, ob das optimierte Spritzenpumpensystem für die Bewertung der Ausflussanlage und der Augenkonformität in ex vivo Mausaugen geeignet ist.

Protokoll

Alle Experimente wurden gemäß der ARVO-Erklärung zur Nutzung von Tieren in der Augen- und Sehforschung sowie den Richtlinien für die Versorgung und Nutzung von Labortieren des Qingdao University Medical Center (QDU-AEC-2022069) durchgeführt.

1. Tierauswahl und -handhabung

1. Verwenden Sie 5 Monate alte Mäuse mit einem genetischen Hintergrund von 50 % C57BL/6 und 50 % BALB/c. Betrachten Sie Sex nicht in das experimentelle Design.
2. Halten Sie Mäuse unter einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus bei 23 ± 2 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 ± 5 %.

2. IOP-Messung

1. Betäuben Mäuse mit 2,5 % Isofluran und 80 % (Vol/Vol) Sauerstoff in einer versiegelten Kammer für 3,5 Minuten.
   VORSICHT: Isofluran ist ein flüchtiges Anästhetikum. Führen Sie eine Anästhesie in einem gut belüfteten Bereich oder in einem geeigneten Eindämmungssystem durch.
2. Übertrage die Mäuse auf eine Betriebsplattform. Halten Sie die Narkose mit Maske weitere 30 Sekunden aufrecht.
3. Führen Sie alle Messungen zwischen 9:00 und 12:00 Uhr durch. Zeichnen Sie drei Messungen pro Auge auf. Berechnen Sie den Durchschnittswert für jeden Datenpunkt.

3. Systemaufbau (Abbildung 1)

1. Schließen Sie eine 100-μL-Spritze an eine Spritzenpumpe an.
2. Verbinde die Spritze mit einem Durchflussdrucksensor.
3. Verbinden Sie den Sensor mit einem Datenerfassungssystem.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Drucksensor und Augenhalter auf gleicher Höhe ausgerichtet sind, um Druckartefakte zu vermeiden.
4. Füllen Sie das System mit 1× phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entferne alle Luftblasen.
5. Setzen Sie das Auge in einen Halter mit einer runden Vertiefung (4–6 mm Durchmesser). Stellen Sie sicher, dass das Auge während der Kannulation stabil ist. Positioniere den Drucksensor und den Augenhalter auf derselben Höhe.
   HINWEIS: Fehlausrichtung kann zu Druckmessfehlern führen. Die STL-Designdatei für den individuellen Augenhalter wird als Supplemental File 1 bereitgestellt.

4. Softwarebetrieb

1. Drucksensorkalibrierung
   1. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware. Lade die Kalibrierungs-Einrichtungsdatei. Wählen Sie die Kalibrierungsfunktion .
   2. Verbinden Sie das System mit einem Wasserreservoir auf zwei definierten Höhen.
   3. Eingabegemessene und tatsächliche Drücke mit der Umwandlung:
      1 cm H₂O = 0,735 mmHg
2. Pumpenaufbau
   1. Öffne die Moduleinstellungen. Lade die Regulator-Konfigurationsdatei.
   2. Wählen Sie das Pumpengerät aus. Geben Sie die maximale Durchflussrate und den Durchmesser der Spritze ein.
3. Datenaufzeichnung
   1. Fang an mit der Aufnahme.
   2. Stoppe die Aufnahme nach jedem Druckschritt.
   3. Gib den nächsten Druckwert ein.
   4. Aufnahme neu starten.

5. Nadelvorbereitung

1. Ziehen Sie eine Glas-Mikropipette gemäß einem etablierten Protokoll⁸.
2. Schleifen Sie die Spitze auf einen Innendurchmesser von 80–100 μm. Polieren Sie die Nadelspitze.
   VORSICHT: Behandle Glasnadeln vorsichtig, um Verletzungen zu vermeiden.
3. Befestige die Nadel an einem Mikromanipulator. Verbinde die Nadel mit dem Druckwandler.
4. Fülle die Nadel mit PBS.
5. Positioniere die Nadelspitze auf derselben Höhe wie der Drucksensor.
6. Widerstandsmessung
   1. Üben Sie einen Druck von 1 mmHg aus. Zeichnen Sie die Durchflussrate auf.
   2. Nadelwiderstand berechnen:
      
   3. Verwenden Sie Nadeln mit einem Widerstand zwischen 0,01 und 0,5 mmHg/(μL/min).

6. Systemausstattung und Einhaltung der Vorschriften

1. Anlagenmessung
   1. Perfundieren Sie das System mit PBS. Dichten Sie das System mit einem Dreifachventil ab.
   2. Üben Sie Druckstufen von 6, 8, 10, 12, 14 und 16 mmHg an.
   3. Nimm P und Q für 10 Minuten pro Schritt auf. Berechnen Sie die Durchschnittswerte der letzten 5 Minuten.
   4. Führe lineare Regression durch. Interpretiere die Steigung als Systemanlage.
2. Validierung
   1. Wiederhole die Messungen dreimal.
   2. Bestätigen Sie, dass die Systemanlage unter 0,2 nL/min/mmHg liegt.
3. Compliance-Messung
   1. Führen Sie einen 35 cm langen Silikonschlauch in das System ein.
   2. Misse die Einhaltung mit und ohne Teflon-Schlauch.
   3. Berechnen Sie die Volumenänderung mit der diskreten Volumen-Methode¹⁴.
   4. Bestimmen Sie die Systemkonformität mit 4 nL/mmHg.
4. Sensitivitätsprüfung
   1. Bestätigen Sie, dass die nachweisbare Systemkonformität größer als 9,9 nL/mmHg beträgt.

7. Enukleation

1. Eliminieren Sie Mäuse mit_CO2 bei einer Durchflussrate von 0,7 L/min für 3 Minuten.
   VORSICHT: CO2-Euthanasie muss den institutionellen Richtlinien folgen, um humane Endpunkte zu gewährleisten.
2. Sezieren Sie extraokulare Muskeln und Sehnerven mit sterilen Instrumenten. Enukleiere die Augäpfel.
3. Sofort ein Auge im Halter bei 35,5 °C montieren.
4. Das gegenseitliche Auge bei 4 °C aufbewahren.
5. Misse beide Augen mit demselben System.

8. Kanülierung

1. Nadeleinstich
   1. Führe die Nadel in einem Winkel von 45° durch die zentrale Hornhaut.
   2. Schieben Sie die Nadel auf eine Tiefe von 0,3–0,5 mm in die vordere Kammer vor.
2. Validierung
   1. Stabilisiere das System. Bestätigen Sie die Druckschwankung ≤ 0,4 mmHg in den letzten 5 Minuten.

9. Okulare C_r

1. Stabilisiere das Auge bei 8 mmHg für 30 Minuten.
2. Üben Sie Druckstufen von 6, 8, 10, 12, 14 und 16 mmHg an.
3. Wenden Sie einen letzten Schritt bei 8 mmHg an.
4. Datenerhebung
   1. Stellen Sie die maximale Durchflussrate auf 4 μL/min ein.
   2. Nimm P und Q für 10 Minuten pro Schritt auf.
5. Analyse
   1. Zeichnen Sie P–T- und Q–T-Kurven dar. Berechnen Sie die Mittelwerte der letzten 5 Minuten.
   2. Passen Sie die Daten an das Potenzgesetz-Modell²⁷ an:
      
6. Definieren Sie C_r (nach Abzug der Systemanlage) als okulare Ausflussanlage.
7. Setze P_r = 8 mmHg.
8. Definieren Sie β als den nichtlinearen Koeffizienten.

10. Ocular Φ_r

1. Analysieren Sie die P–T- und Q–T-Kurven während der Drucksteigerungen. Identifizieren Sie den Durchflussanstieg auf Q_Max und die anschließende Verzögerung.
2. Berechnen Sie die Volumenänderung zwischen t_p und t_max mit der diskreten Volumen-Methode³⁰.
3. Anpassungsdaten an die modifizierte Friedenwald-Gleichung³⁰:
   
4. Setze P_r = 13 mmHg. Definieren Sie Φ_r (nach Subtragung der Systemcompliance) als okulare Compliance Φ_r,eye und γ als Materialparameter.

Ergebnisse

Die Leistung des optimierten Spritzenpumpensystems wurde durch den Vergleich von C und φ bei fünf Monate alten Mäusen mit zuvor veröffentlichten Werten aus druckkontrollierten Augenperfusionsstudien bewertet. Die Normalität der Datensätze in Abbildung 2F wurde mit dem Shapiro–Wilk-Test bewertet, und statistische Vergleiche wurden mit einem zweiseitigen gepaarten Studenten-t-Test durchgeführt.

Wie in Abbildung ...

Diskussion

Diese Studie präsentiert ein optimiertes Spritzenpumpensystem zur Schätzung der Ausflussanlage und der Augencompliance in Mausaugen und liefert Werte, die mit denen berichtet werden, die mit druckgesteuerten Augenperfusionssystemen übereinstimmen. Der derzeitige Ansatz verbessert die Genauigkeit spritzenbasierter Messungen, während ein einfaches und zugängliches experimentelles Setup erhalten bleibt. Diese Kombination aus methodischer Verfeinerung und Zugänglichkeit könnte eine breitere ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz	1& Times; PBS-Puffer	Thermo Fisher Scientific	10010023
Isoflurane	Shenzhen Rewoode Life Sciences Co., Ltd., China	R640
Material	100 & mu; L Hochpräzisionsspritze	Hamilton	1710
Borosilikatglas	Sutter, Novato, CA	BF100-50-10
Einweg-sterile Spritze	Fenglin Medical Devices Co., Ltd. Jiangxi, China	10 ml
Drucksensor	IcuMedical	PX26-015G
Silikonröhre	Runze Fluid Co., Ltd, Nanjing, China;	N/A
Transparentes PTFE-Rohr	Runze Fluid Co., Ltd, Nanjing, China;	N/A
Ausrüstung	Flammende/Brauner Pipettenzieher	Sutter, Novato, CA	P-97
Manueller Mikromanipulator	Weltpräzisionsinstrumente (WPI)	M3301
Metallbad	Biberbiologie, Suzhou, China	2016C
MicroForge	Narishige Wissenschaftliches Instrumentenlabor, Tokio, Japan	MF830
Mikropipettenmühle	MPInstrument Co., Ltd., Wuhan, China	KDG-02
PZMIII Stereo-Zoom-Fernglasmikroskop	Weltpräzisionsinstrumente (WPI)	PZMIII
Spritzenpumpe	Weltpräzisionsinstrumente (WPI)	AL-1000