Synthese, Hämoglobinkapselung und biorthogonale PEGylation in hierarchisch porösen UiO-66-Nanopartikeln für Anwendungen zur Sauerstoffabgabe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Hämoglobin-Einkapselung und Oberflächen-PEGylation hierarchisch poröser UiO-66-Nanopartikel, die für die Sauerstoffabgabe entwickelt wurden. Das Verfahren kombiniert Defekttechnik mit dehnungsgeförderter biorthogonaler Konjugation, um hochdurchlässige und physiologisch stabile Träger zu erzeugen, die für biomedizinische Anwendungen geeignet sind.

Zusammenfassung

Hämoglobinbasierte Sauerstoffträger (HBOCs) sind eine wichtige Plattform zur Sauerstoffabgabe zur Linderung von Hypoxie in mehreren biomedizinischen Kontexten. Allerdings ist freies Hämoglobin (Hb) außerhalb der roten Blutkörperchen instabil und vasoaktiv. Hier präsentieren wir ein reproduzierbares, skalierbares Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung hierarchisch poröser UiO-66-Nanopartikel (HP-UiO-66 NPs), die Hb kapseln und durch bioorthogonale Polyethylenglykol-(PEG)-Schalen stabilisiert werden. Die hierarchische Mesopodosität wird durch Dodekanosäuremodulation und anschließende Säurewäsche eingeführt, wodurch HP-UiO-66-NH₂ NPs mit erhaltener Kristallinität und kombinierten Typ-I/IV-N2-Isothermen entstehen. Oberflächenamine werden in Azide (HP-UiO-66-N₃ NPs) umgewandelt, wodurch katalysatorfreie Strain-Promoted Alkyne-Azide Cycloaddition (SPAAC) Hb@HP-UiO-66-PEG NPs erzeugen kann. Der Arbeitsablauf umfasst: i) Defektengineering von UiO-66-NH₂ NPs, ii) Modulatorentfernung, iii) Azidinstallation, iv) Hb-Ladefunktion in gepufferten wässrigen Medien und v) SPAAC-vermittelte PEGylation. Kritische experimentelle Parameter, Standardfehlerarten und Fehlerbehebungsstrategien werden in jeder Phase detailliert beschrieben, um die reproduzierbare Laborstruktur zu verbessern. Das Protokoll eignet sich für die grammaßstäbliche Produktion von HP-UiO-66-NH₂ NPs pro Charge. Kapselwirkungsgrade von ~35 % (Ladegehalt ~24 Wt%) für Hb werden unter milden Bedingungen erzielt, mit redispersierbaren NPs mit einem hydrodynamischen Durchmesser von ~140 nm und geringer Polydispersität nach der PEGylation. Eine umfassende physikochemische Charakterisierung bestätigt die Integrität des Rahmens, die Mesopodosität, die erfolgreiche Oberflächenchemie und eine diffuse PEG-Korona bis zu ~12 nm Breite. Funktionelle Assays zeigen reversible Sauerstoff- und Sauerstoffentsättigung von gekapseltem Hb, was auf die bewahrte Sauerstofftransportkapazität hinweist. Die PEGylation verbessert die kolloidale und strukturelle Stabilität in Kochsalzlösung, HEPEES und Serum deutlich und verhindert so die phosphatinduzierte Degradierung, die bei nicht-PEGylierten Gegenstücken beobachtet wird. Durch die Integration detaillierter Fehlerbehebungsanleitungen, videounterstützter Visualisierung kritischer Schritte und Skalierungsüberlegungen bietet dieses modulare Protokoll einen robusten und zugänglichen Weg zu metall-organischen Framework-basierten HBOCs. Die Strategie lässt sich leicht an andere Biomakromoleküle oder Enzyme anpassen, die schützende, aber zugängliche Mikroumgebungen für die therapeutische Verabreichung benötigen.

Einleitung

Eine ausreichende Sauerstoffversorgung ist entscheidend für eine effektive Therapie und Gewebeheilung in verschiedenen biomedizinischen Umgebungen¹. Bei Trauma- und chirurgischen Blutungen kann ein schwerer Sauerstoffmangel lebensbedrohlich sein, was die Notwendigkeit sicherer Blutersatzstoffe unterstreicht, wenn Spenderblut nicht verfügbar ist². In der Onkologie begrenzen hypoxische Tumorregionen die Wirksamkeit sauerstoffabhängiger Behandlungen, und eine zusätzliche Sauerstoffversorgung kann die therapeutische Wirksamkeit deutlich steigern 3,4,5,6. Sauerstoff spielt ebenfalls eine zentrale Rolle bei der Wundheilung, wobei eine erhöhte Sauerstoffverfügbarkeit die Angiogenese und Gewebereparatur fördert⁷. Ähnlich können Sauerstoffträger bei ischämischen Bedingungen und Organtransplantationen hypoxische Schäden reduzieren und die Lebensfähigkeit sowie Wiederherstellung des Gewebes verbessern ^8,9.

Synthetische Hämoglobin-(Hb)-basierte Sauerstoffträger (HBOCs) stellen einen vielversprechenden Ansatz zur Bekämpfung von Hypoxie¹⁰ dar. Außerhalb roter Blutkörperchen (RBC) ist Hb jedoch von Natur aus instabil und dissoziiert schnell zu Dimeren, die Nephrotoxizität, oxidative Schäden und Vasokonstriktion durch Stickstoffmonoxid-Scavenging¹¹ verursachen können. Um diese Herausforderungen zu mildern, wurden Kapselungsstrategien entwickelt, um Hb in biokompatiblen Nanoträgern wie Liposomen¹², Polymersomen¹³ und polymeren Nanopartikeln (NPs^{) zu} stabilisieren^. Obwohl diese Systeme die Hb-Stabilität verbessern, bleibt^{es eine Herausforderung}, eine hohe Verkapselungseffizienz bei gleichzeitiger Erhaltung der nativen sauerstoffbindenden Funktion zu erreichen. Darüber hinaus kann die oxidative Umwandlung in Methemoglobin und Häm-Leckage die sauerstofftragende Leistung¹⁹ beeinträchtigen. Schnelle Clearance und vorzeitige Hb-Leckage begrenzen zusätzlich die Zirkulationszeit und klinische Translation²⁰.

Metallorganische Frameworks (MOFs) haben sich kürzlich als vielseitige Nanoplattformen für die Lieferung von Arzneimitteln und Biomakromolekülen etabliert, da sie ihre kristalline Architektur, große Oberfläche und abstellbare Porosität²¹ abstimmen. MOFs bestehen aus Metallknoten, die mit organischen Verbindern koordiniert sind, und ermöglichen molekulare Diffusion und strukturelle Anpassung, was sie für biomedizinische Anwendungen attraktiv macht. Die meisten MOFs besitzen jedoch überwiegend mikroporöse Hohlräume (<2 nm), die die postsynthetische Einkapselung von Makromolekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren oder Enzymen 22,23,24,25 stark einschränken. Ein Ansatz, um diese Einschränkung zu überwinden, ist die in-situ-biomimetische Mineralisierung, bei der Biomoleküle während des MOF-Wachstums als Keimbildungszentren fungieren, wie bei ZIF-8 und ZIF-90 26,27,28 demonstriert wurde. Trotz ihrer Wirksamkeit erfordert diese Strategie milde Synthesebedingungen, die den Bereich kompatibler MOF-Chemikalien ^29,30 einschränken.

UiO-66, ein zirkoniumbasiertes MOF, das aus Zr₆O₄(OH)4-Oktaederknoten und 1,4-Benzendicarboxylat (BDC)-Linkern gebaut ist, zeichnet sich durch seine außergewöhnliche chemische Stabilität und Biokompatibilität³¹ aus. Sein robustes Gerüst widersteht der Zersetzung in wässrigen und physiologischen Umgebungen, was es ideal für biomedizinische^{Anwendungen macht}. Dennoch begrenzt seine intrinsische mikroporöse Struktur seinen Nutzen für die Biomakromolekül-Einkapselung. Hb mit einer Molekulardimension von ~5 nm kann in den inneren Poren des ursprünglichen UiO-66 nicht aufgenommen werden. Dementsprechend haben nur eine begrenzte Anzahl von Studien UiO-66 in Hb-bezogenen Systemen untersucht, bei denen die MOFs hauptsächlich für oberflächenbasierte Hb-Messung und nicht für die Framework-Kapselung^33,34 verwendet werden. Daher bleiben UiO-66-basierte Plattformen für Hb-Verkapselung relativ unterentwickelt.

Ganz kürzlich haben wir einen hierarchisch porösen UiO-66 NP (HP-UiO-66 NP) eingeführt, der diese Porengrößenbeschränkung überwindet, indem er mesoporöse Domänen integriert, die Hb aufnehmen können, und so den funktionalen Anwendungsbereich von UiO-66 für HBOC-Entwicklung³⁵ erweitert. Hierarchische Porosität wird durch Defekttechnik eingeführt, insbesondere durch den Einsatz langkettiger Monocarbonsäuren wie Dodekansäure (DA) als Modulatoren während der Synthese^36,37. Dieser Modulator konkurriert mit dem BDC-Liganden um die Koordination mit Zr⁴⁺, was zur Defektbildung und vergrößerten Mesoporen führt. Die anschließende Entfernung des Modulators ergibt HP-UiO-66 NPs, die koexistierende mikro- und mesoporöse Domänen enthalten, mit abstimmbarer Porengröße durch Modulatorkonzentration oder Kettenlänge³⁶.

Obwohl die Einführung von Mesopodosität die molekulare Zugänglichkeit verbessert, kann sie auch die Integrität des Rahmens in phosphathaltigen Puffern beeinträchtigen. Phosphationen können sich mit Zr-Clustern koordinieren, was zu einer teilweisen oder vollständigen strukturellen Zersetzung^38,39 führt. Dementsprechend sind Oberflächenstabilisierungsstrategien unerlässlich, um die kolloidale und chemische Stabilität unter physiologischen Bedingungen^{zu erhalten 40}. Im Allgemeinen kann die MOF-Oberflächenstabilisierung durch nichtkovalente Wechselwirkungen (z. B. Van-der-Waals-Wechselwirkung und Wasserstoffbrücken^{) erreicht} werden, Koordinationswechselwirkungen mit freiliegenden Metallstellen⁴² oder kovalente Anhaftung an organische Linker⁴³. Unter den verschiedenen Bindern ist Polyethylenglykol (PEG) besonders attraktiv aufgrund seiner breiten Verfügbarkeit und minimalen synthetischen Komplexität⁴⁴. Wichtig ist, dass die PEG-Oberflächenmodifikation, allgemein als PEGylation bezeichnet, mehrere günstige Eigenschaften für Arzneimittelabgabesysteme verleiht, darunter ausgezeichnete Biokompatibilität, reduzierte unspezifische Proteinadsorption sowie eine reduzierte Immunerkennung und Makrophagenaufnahme^45,46. Zusammen reduzieren diese Effekte die immunogenen Reaktionen und verlängern den systemischen Kreislauf⁴⁷.

Traditionelle PEGylierungstechniken basieren oft auf Carbodiimid- oder Malelimidchemie, die typischerweise Katalysatoren oder reaktive Zwischenprodukte erfordern, die empfindliche Biomoleküle wie Hb schädigen können. Um diese Einschränkung zu umgehen, verwenden wir die stammgeförderte Alkyne-Azid-Zykloaddition (SPAAC), eine katalysatorfreie, bioorthogonale Reaktion zwischen azid- und dibenzylcyclooctyn (DBCO)-funktionalisierten Spezies, die eine ortsspezifische Konjugation unter milden wässrigen Bedingungen ermöglicht^35,48. Dieser Ansatz gewährleistet eine effiziente Oberflächenmodifikation, ohne die kapsulierte Hb-Funktion zu beeinträchtigen.

Aufbauend auf unseren zuvor berichteten HP-UiO-66 NPs³⁵, die sich auf strukturelles Design und biofunktionale Validierung konzentrierten, legt das vorliegende Protokoll Wert auf methodische Transparenz und Reproduzierbarkeit, indem es einen detaillierten, schrittweisen experimentellen Workflow mit definierten Parameterbereichen und kritischen Handhabungsaspekten bietet. Fehlerbehebungshinweise sind für Schlüsselstufen der Synthese, der Hb-Verkapselung und der PEGylation mittels SPAAC-Chemie enthalten, was letztlich stabile Hb@HP-UiO-66-PEG-NPs liefert (siehe Abbildung 1).

Der Arbeitsablauf umfasst: (i) Fehlerentwicklung unter Verwendung von DA als Modulator zur Synthese von amino-modifizierten HP-UiO-66-NH₂ NPs; (ii) Azidfunktionalisierung von Oberflächenamingruppen; (iii) Einkapselung von Hb unter milden, wässrigen Bedingungen; (iv) kovalente PEG-Konjugation durch SPAAC.

Für jeden wichtigen Schritt identifiziert dieses Protokoll häufige experimentelle Herausforderungen wie Partikelaggregation, Porenkollaps oder ineffiziente Oberflächenfunktionalisierung und bietet praktische Fehlerbehebungsstrategien zur Verbesserung der reproduzierbaren Labore. Wichtig ist, dass dieser Artikel ausführlich zeigt, dass die Synthese von HP-UiO-66 NPs leicht skalierbar ist, was eine zuverlässige Produktion im grammaßstäblichen Maßstab pro Charge ermöglicht.

Die letzten PEGylierten Nanoträger zeigen eine hohe kolloidale Stabilität in Kochsalzlösung, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazineethan-Sulfonsäure (HEPES) und Serum, während sie die sauerstoffbindende und freisetzende^{Kapazität von Hb von 35} erhalten. Analytische Methoden wie Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR), Kernmagnetresonanz (NMR), Pulver-Röntgenbeugung (PXRD), Stickstoff-(N₂)-Sorption, Zeta-(ζ)-Potentialanalyse, dynamische Lichtstreuung (DLS), Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigen chemische Transformation, Rahmenintegrität, Porosität, nanoskalige Morphologie und erfolgreiche Oberflächenfunktionalisierung.

Durch die Betonung von Reproduzierbarkeit, Skalierbarkeit und operativer Klarheit, unterstützt durch videobasierte Visualisierung technisch sensibler Schritte, bietet diese Methodik einen reproduzierbaren, robusten und zugänglichen Weg zur Herstellung stabiler MOF-basierter Sauerstoffträger. Wichtig ist, dass der Ansatz modular ist und leicht an andere Biomakromoleküle oder Enzyme anpassbar ist, die eine geschützte, aber sauerstoffdurchlässige Mikroumgebung benötigen, um die Funktionalität zu erhalten. Dementsprechend stellen Hb@HP-UiO-66-PEG NPs einen vielversprechenden Schritt zur Entwicklung von HBOCs dar, die Sauerstoff effizient liefern und gleichzeitig dem Abbau in biologischen Flüssigkeiten widerstehen können.

Aus praktischer Sicht kann diese Strategie auf andere Biomakromoleküle jenseits von Hb ausgeweitet werden, vorausgesetzt, sie besitzen Abmessungen unter etwa 20 nm, was der maximal zugänglichen Mesopor-Größe entspricht, und eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweisen: (i) Empfindlichkeit gegenüber harten chemischen Bedingungen, was eine milde Synthese und Oberflächenmodifikation begünstigt; (ii) eine Anforderung für eine hydratisierte, sauerstoffdurchlässige Mikroumgebung zur Aufrechterhaltung der funktionalen Aktivität; und (iii) Anfälligkeit für phosphatinduzierte MOF-Degradation, was Oberflächenstabilisierung notwendig macht. Der Ansatz setzt auf moderate Defektdichten, um die Zugänglichkeit von Mesoporen mit der Integrität des Gerüsts auszubalancieren. Wenn eine katalysatorfreie, ortsspezifische Oberflächenmodifikation erforderlich ist, um die Funktion des Biomoleküls zu erhalten, bietet SPAAC-basierte PEGylation klare Vorteile. Daher eignet sich dieses Protokoll gut für eine effiziente Biomakromolekülbelastung, funktionelle Erhaltung und langfristige kolloidale Stabilität unter physiologischen Bedingungen, während deutlich größere Biomoleküle oder Systeme, die extreme thermische oder säurestabile Stabilität benötigen, alternative MOF-Plattformen benötigen können.

Protokoll

1. Hb-Extraktion (Erwartete Dauer: 2 Tage)

HINWEIS: Die Gewinnung von Hb aus kommerziell erhältlichem Rinderblut (SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK) erfolgt nach unserem zuvor gemeldeten Protokoll⁴⁹.

1. Geben Sie Rinderblut (typischerweise 10 ml pro Extraktion) in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr um. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,9 % (w/v) Kochsalzlösung hinzu, um das Blut zu verdünnen und die Viskosität zu verringern. Mehrmals sanft umdrehen, bis eine homogene Suspension erreicht ist.
2. Zentrifugiere das verdünnte Blut bei 1.500 x g für 20 Minuten bei 4 °C. Nach der Zentrifugation erscheint über einem dichten roten Pellet (RBCs) ein klares gelbes Supernatant (Plasma). Ist das vollständige Pelletieren nicht erreicht, wird die Zentrifugation bei Bedarf fortgesetzt.
3. Lassen Sie die Plasmaschicht vorsichtig dekantieren und entsorgen, ohne die Kugel zu stören. Frische Kochsalzlösung (10 ml) hinzufügen, das rote Blutzuckerpellet durch sanfte Inversion wieder suspendieren und den Zentrifugationsschritt unter identischen Bedingungen wiederholen. Führen Sie insgesamt zwei Waschzyklen durch, um Plasmaproteine und Blutplättchen zu entfernen.
   HINWEIS: Der Waschprozess ist entscheidend, um reine Rotzellen frei von Plasmakontaminanten zu erhalten, die die nachgeschaltete Toluolextraktion beeinträchtigen könnten.
4. Nach der zweiten Wäsche entsorgen Sie den Überschussmittel und suspendieren Sie das gereinigte Rotkörperpellet erneut in einer Mischung aus Toluol, ultrareinem Wasser und Kochsalzlösung im Volumenverhältnis von 1:0,4:1. Zum Beispiel mischen Sie 10 ml Toluol, 4 ml ultrareines Wasser und 10 ml Kochsalzlösung in einen 50 ml separaten Trichter, bevor Sie das Pellet hinzufügen.
5. Den Trichter abschließen und mehrmals vorsichtig umkehren, um die Phasen zu mischen. Stellen Sie den Schornstein über Nacht (~12–16 H) auf 4 °C ein, um eine vollständige Phasentrennung zu ermöglichen. Die Toluolphase extrahiert die Lipidmembranen und hinterlässt eine klare wässrige Phase, die mit Hb angereichert ist.
6. Am folgenden Tag sammeln Sie die untere wässrige Schicht sorgfältig mit dem Sperrhahn des Trenntrichters auf. Diese Schicht erscheint transparent und dunkelrot.
7. Die wässrige Hb-Lösung wird in Zentrifugenröhren übertragen und bei 8.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C gedreht, um eventuelle verbleibende Zellreste oder emulgiertes Material zu entfernen.
8. Filtern Sie den Überstand durch eine Kieselgurfritte mit einem Vakuumfiltersystem. Verwenden Sie nur sanftes Vakuum (vermeiden Sie hohen Unterdruck, der Schäumbildung oder Proteindenaturierung verursachen kann).
9. Sammeln Sie das Filtrat mit stromafreiem Hb. Lagern Sie diesen Fond bei sofortiger Verwendung auf Eis oder Aliquot (~1 mL) und frieren Sie ihn bei −80 °C für langfristige Nutzung ein.
   HINWEIS: Hb-Aliquots können mehrere Monate gefroren gelagert werden, ohne nachweisbare Degradierung.
10. Quantifizieren Sie die Hb-Konzentration mit einem Bicinconinsäure-Protein-Test gemäß dem Protokoll des Herstellers, wobei reines Rinder-Hb als Kalibrierungsstandard verwendet wird. Stellen Sie den End-Hb-Bestand auf die gewünschte Arbeitskonzentration ein (typischerweise 20 mg ^mL-1 in HEPES-Puffer, pH 7,4).
    HINWEIS: Erwarten Sie eine klare, rote Hb-Lösung ohne zelluläres Material.
11. Optional: Messung der UV-Vis-Absorptionsspektren (375–700 nm) des extrahierten Hb, um seine Sauerstoffbindungs- und Freisetzungsfähigkeit zu beurteilen. Zeichnen Sie das anfängliche UV-Vis-Spektrum auf. Fügen Sie Natriumdithionit hinzu und reinigen Sie 10 Minuten mit_N2-Gas , um Sauerstoff freizusetzen, und zeichnen Sie das Spektrum des sauerstoffarmen Hb auf. Anschließend 10 Minuten lang mit Luft reinigen, um eine Wiederoxygenierung zu ermöglichen, und das Spektrum neu aufzeichnen.
    HINWEIS: Das Vorhandensein charakteristischer Soret- und Q-Bänder von sauerstoffreichem (~412 nm für das Soret-Band; ~541 und ~577 nm für Q-Bänder) und sauerstoffarmem (~430 nm für das Soret-Band; ~557 nm für Q-Band) Hb nach dem Purgen mit Luft bzw. N₂ zeigt, dass Hb weiterhin funktionsfähig bleibt (ergänzende Abbildung 1).
    VORSICHT: Führen Sie Toluol vorsichtig in einer Abzugshaube, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen, darunter Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe. In der vorliegenden Studie wurden alle toluolhaltigen Abfallflüssigkeiten gesammelt und als organischer chemischer flüssiger Abfall in ausgewiesenen Behältern (Gruppe C) mit der Bezeichnung "Toluol und Mischung" entsorgt, gemäß den Richtlinien des dänischen Umweltministeriums. Die entsprechende Dokumentation zur Abfallentsorgung ist in Supplementary File 1 bereitgestellt.

2. Herstellung von HP-UiO-66-NH₂ NPs (Erwartete Dauer: 3 Tage)

VORSICHT: HCl (37 %) ist korrosiv; Führe sie in einer Abzugshaube mit Laborkittel, säureresistenten Handschuhen und geeignetem Augenschutz. Gib langsam Säure hinzu und vermeide das Einatmen von Dämpfen.

1. Wiegen Sie ZrCl₄ (400 mg, 1,715 mmol) in eine 250 ml Rundbodenflasche. Langsam DMF (80 mL) und Ultraschall für 5 Minuten hinzufügen, um ZrCl₄ vollständig aufzulösen. Fügen Sie DA (12 g, 60 mmol) hinzu und ultraschallen Sie weitere 30 Minuten, bis eine klare, homogene Lösung vorliegt. Messen Sie das gesamte Lösungsvolumen mit einem abgestuften Zylinder und fügen Sie bei Bedarf DMF hinzu, um das Endvolumen auf 100 ml anzupassen. DA wirkt als kompetitiver Modulator und führt kontrollierte Gitterdefekte ein.
   HINWEIS: Fügen Sie DMF langsam beim Auflösen von ZrCl₄ hinzu, da der Koordinationsprozess exotherm ist und leichte Rauchung verursachen kann; Führen Sie alle Operationen in einer Abzugshaube aus. Berücksichtigen Sie die durch die Einbindung von DA verursachte Volumenzuwachs, indem Sie ein Anfangsvolumen von 80 mL DMF verwenden, um ZrCl₄ und DA aufzulösen, und das Endvolumen erst nach vollständiger Auflösung auf 100 mL einstellen, um eine genaue Konzentrationskontrolle sicherzustellen.
2. Fügen Sie 2-Amino-1,4-Benzoldicarboxylsäure (BDC-NH₂, 155 mg, 0,857 mmol) in dieselbe Flasche hinzu und sonikaten Sie weitere 30 Minuten. Machen Sie weiter, bis eine homogene, blassgelbe Lösung erhalten ist.
3. Übertragen Sie das Gemisch in einen 150-mL Teflon-beschichteten Autoklaven oder ein Rundboden-Druckbehälter, das für die solvothermale Synthese geeignet ist. Dicht abschließen und 18 Stunden in einen vorgeheizten Schallofen bei 120 °C geben. Stören Sie den Reaktor während der Erhitzung nicht, um unkontrollierte Keimbildung zu vermeiden.
4. Nach der Reaktion schalten Sie den Ofen aus und lassen Sie das Gefäß natürlich auf Raumtemperatur (~2 H) abkühlen. Beobachten Sie eine feine gelbe Suspension, die im gesamten Medium gleichmäßig sichtbar ist.
5. Sammeln Sie das Produkt durch Zentrifugation (11.000 x g, 10 min, Raumtemperatur) und entsorgen Sie das Supernatant. Waschen Sie das Pellet dreimal mit DMF (100 mL) unter denselben Zentrifugationsbedingungen, um überschüssigen Liganden und nicht reaktierte DA zu entfernen. Wenn das Produkt nicht vollständig pelletiert ist, verlängern Sie die Zentrifugationszeit bei Bedarf.
6. Bereiten Sie eine Säureentfernungslösung mit DMF (100 mL) vor, die 0,5 mL konzentriertes HCl (37 %) enthält. Tauchen Sie das gewaschene Pellet vollständig in diese Lösung ein und erhitzen Sie es 12 Stunden lang in einem Schallofen bei 90 °C. Dieser Schritt entfernt den DA-Modulator und erzeugt Mesopores innerhalb der Struktur.
7. Nach 12 Stunden zentrifugieren (11.000 x g, 5 min, Raumtemperatur) und entsorgen Sie den Überstandsmittel. Wiederholen Sie die Säurebehandlung mit einer frischen Charge DMF mit 0,5 mL HCl, um die vollständige Entfernung von DA sicherzustellen. Wenn das Produkt nicht vollständig pelletiert ist, verlängern Sie die Zentrifugationszeit bei Bedarf.
8. Waschen Sie das Pellet nacheinander mit DMF, Aceton und Ethanol (100 mL, 11.000 x g, 5 Min, Raumtemperatur), um eventuelle Restsäuren und Lösungsmittel zu entfernen. Wenn der Niederschlag nicht vollständig pelletiert ist, verlängern Sie die Zentrifugationszeit bei Bedarf. Zwischen jedem Waschen wird das Pellet vorsichtig durch Vortexing oder eine milde Sonikation wieder verteilt.
9. Trocknen Sie das Produkt über Nacht in einem Vakuumofen (140 °C) nach dem Trocknen in einer Abzugshaube. Die Endmaterialien (HP-UiO-66-NH₂ NPs) erscheinen als feines gelbes Pulver. Erwarten Sie eine typische Ausbeute von ~428 mg.
10. Bestätigen Sie, dass PXRD-Spitzen bei 2θ = 7,3°, 8,4°, 25,7° weiterhin scharf bleiben (Abbildung 2A), was auf den Erhalt der kristallinen UiO-66-Topologie hinweist. Überprüfen Sie die vollständige Entfernung von DA durch ¹H NMR nach alkalischer (2 M KOH in D₂O) Verdauung (keine Methylenspitzen bei 1,2 ppm) (Abbildung 2B).
11. Charakterisieren Sie die Porosität durch N-2-Adsorption-Desorption bei 77 K⁵⁰. Die Kurve zeigt eine kombinierte Typ-I/IV-Isotherme mit einer Hystereseschleife (Abbildung 2C), die die Bildung von Mesoporen bestätigt.
    HINWEIS: Unvollständige Hochtemperaturtrocknung oder unzureichende Probenmasse führen zu ungenauen Porositätsmessungen mit N2-Adsorptions-Desorptions-Isothermen; Wiederholen Sie den Vakuumtrocknungsprozess bei 140 °C und stellen Sie sicher, dass das Probengewicht 100 mg übersteigt, wenn der Brunauer−Emmett−Teller (BET)-Bereich < 1.000 m^{2 g-1} liegt.
12. Optional: Beurteile die Morphologie der NPs mit SEM. HP-UiO-66-NH₂ NPs zeigen sphärische Morphologie mit einer engen Größenverteilung von ~100 nm (Abbildung 2D).
    HINWEIS: Man sollte mit HP-UiO-66-NH₂ NPs rechnen, die sowohl Mikro- als auch Mesopore besitzen, geeignet für die anschließende Hb-Kapselung.
13. Die Synthese von HP-UiO-66-NH₂ NPs kann durch proportionale Erhöhung aller verwendeten Reagenzien und Lösungsmittel in den Schritten 2.1 - 2.9 und durch mehrere parallele solvotherme Reaktionen erhöht werden. Durch die Aufrechterhaltung der gleichen Molarverhältnisse, Konzentrationen, Reaktionstemperatur und Reaktionszeit sowie durch die Erhöhung der Reagenz- und Lösungsmittelmengen um das 1,5-fache können zwei oder mehr 150-mL-Teflon-ausgekleidete Autoklaven oder Rundboden-Druckbehälter gleichzeitig betrieben werden, was die grammaßstäbliche Herstellung von HP-UiO-66-NH₂ NPs ermöglicht (Abbildung 3).
    HINWEIS: Führen Sie alle organischen Lösungsmittel in einer Dampfhaube, während Sie einen Laborkittel, säureresistente Handschuhe und geeigneten Augenschutz tragen. Sammeln Sie alle DMF-haltigen Abfallflüssigkeiten und entsorgen Sie sie als organische, chemische Flüssigabfälle in ausgewiesenen Behältern (Gruppe C), die gemäß den Richtlinien des dänischen Umweltministeriums mit der Beschriftung "DMF und Mischung" gekennzeichnet sind. Abfalllösungen mit Spuren von ZrCl₄ und HCl wurden entsprechend behandelt. Die entsprechende Dokumentation zur Abfallentsorgung ist in Supplementary File 1 bereitgestellt.

3. Azidfunktionalisierung der HP-UiO-66-NH₂ NPs (HP-UiO-66-N₃ NPs) (Erwartete Dauer: 1 Tag)

VORSICHT: Trimethylsilylazid (TMSN₃) und Tert-Butylnitrit (tBuONO) sind toxisch und flüchtig. Führen Sie alle Schritte in einer Abzughaube mit Laborkittel, Nitrilhandschuhen und Augenschutz durch.

1. Präzise WEIGEN Sie HP-UiO-66-NH₂ NPs (50 mg) in eine 25 ml Flasche mit rundem Boden ab. Füge THF (10 ml) hinzu und ultraschall für 5 Minuten, um die Partikel vollständig zu verteilen. Die Federung wird undurchsichtig, aber gleichmäßig.
   HINWEIS: Eine gleichmäßige Dispersion von NPs nach der Sonikation ist entscheidend für einen effektiven Kontakt mit Reaktanten. Ist die Dispersion unvollständig, erhöhen Sie das Lösungsvolumen und wiederholen Sie die Sonikation.
2. Stellen Sie den Kolben in ein Eiswasserbad (0 °C) auf einem magnetischen Rührer, der auf 400 U/min eingestellt ist. Mit einer Glasspritze gibt man die BuONO(0,4 ml) tropfweise über 5 Minuten hin, während die Temperatur unter 5 °C bleibt.
3. Fügen Sie sofort TMSN₃ (0,35 mL) tropfweise unter denselben kalten Bedingungen hinzu. Ein leichtes Spritzen kann auftreten, was auf einen Nitrosationsfortschritt hinweist. Wickle das Bad mit Alufolie ein, um die Reaktion vor Licht zu schützen...
4. Rühren Sie die Reaktionsmischung über Nacht (~16 H) im Eiswasserbad weiter um, um eine vollständige Azidsubstitution der Amingruppen auf der MOF-Oberfläche zu ermöglichen.
5. Entferne das Eisbad und lass die Suspension Raumtemperatur erreichen. Zentrifuge (11.000 x g, 5 min, Raumtemperatur) zur Sammlung der modifizierten NPs. Wenn der Niederschlag nicht vollständig pelletiert ist, verlängern Sie die Zentrifugationszeit bei Bedarf.
6. Waschen Sie das Pellet dreimal gründlich mit THF (10 mL) und sammeln Sie es nach jeder Wäsche durch Zentrifugation (11.000 x g, 5 min, Raumtemperatur) auf. Anschließend gibt es drei weitere Wascharbeiten mit Aceton (10 ml), die unter denselben Bedingungen zentrifugiert werden, um Restreagenzien und Nebenprodukte zu entfernen. Wenn der Niederschlag nicht vollständig pelletiert ist, verlängern Sie die Zentrifugationszeit bei Bedarf.
7. Trocknen Sie das Produkt (HP-UiO-66-N₃ NPs) über Nacht in einem Ofen (140 °C) unter Vakuum nach dem Trocknen in einer Dampfhaube. Erwarten Sie eine typische Ausbeute von ~45 mg.
8. Verifizieren Sie die chemische Transformation mittels FTIR-Spektroskopie: Eine scharfe asymmetrische Aziddehnung zeigt sich bei ~2122 ^cm-1 (Abbildung 4A). Die Bandintensität korreliert mit der Effizienz der Oberflächensubstitution.
   HINWEIS: Unvollständige Umwandlung kann die nachfolgende Klickkonjugation beeinträchtigen. Wenn das Azidband schwach ist, wiederholt man die Funktionalisierung mit zweifachen Größen von tBuONO und TMSN₃. Erwarten Sie azido-terminierte HP-UiO-66-N₃ NPs mit erhaltener Kristallinität und mesoporoser Architektur (Abbildung 4B-D), bereit für Hb-Kapselung und SPAAC PEGylation.
   VORSICHT: Sammeln Sie alle Abfallflüssigkeiten, die TMSN₃ enthalten, einschließlich Mischungen mit anderen Reagenzien (z. B. tBuONO und THF), gemäß den Richtlinien des dänischen Umweltministeriums in als Gruppe O ausgewiesenen Behältern für gefährliche Abfälle. Kennzeichnen Sie alle Behälter deutlich, um das Vorhandensein von TMSN₃ und seinen Mischungen anzuzeigen. Die relevante Dokumentation zur Entsorgung von Abfällen wird in Supplementary File 1 bereitgestellt.

4. Hb-Ladung und Quantifizierung (Erwartete Dauer: 2 Tage)

1. Übertragen Sie HP-UiO-66-N₃ NPs (5 mg) in ein 2-mL Zentrifugenrohr, gefolgt von ~2 Minuten Sonikation in 0,5 mL HEPES-Puffer (20 mM, pH 7,4). Fügen Sie 0,5 ml HEPES-Puffer mit Hb (20 mg ^mL-1) hinzu und wenden Sie das Rohr vorsichtig mehrmals um, um die NPs vollständig zu verteilen.
2. Setzen Sie das Rohr auf einen Thermoshaker und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur (22–25 °C) unter 1.000 U/min, während Sie 2 Stunden lang schütteln.
3. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie 13.500 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die resultierenden Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs zu pelletieren. Sammeln Sie den Supernatant sorgfältig zur Quantifizierung des nicht eingeschlossenen Hb. Wenn der Niederschlag nicht vollständig pelletiert ist, verlängern Sie die Zentrifugationszeit bei Bedarf.
4. Waschen Sie das Pellet vorsichtig mit ultrareinem Wasser (1 ml), indem Sie es auf und ab pipetten, um locker adsorbierten Hb zu entfernen, und wiederholen Sie das Waschen zweimal. Sammeln Sie vorsichtig das Überlagermittel jeder Wäsche zur Quantifizierung des nicht eingeschlossenen Hb. Suspendieren Sie das endgültige Pellet in 0,5 mL ultrareinem Wasser zur Charakterisierung. Bewahren Sie Proben im Kühlschrank auf (4 °C), um Oxidation zu verhindern.
5. Bestimmen Sie nicht eingeschlossenes Hb in den gesammelten Supernatanten mit dem Natriumlaurylsulfat (SLS)-Hb-Test⁵¹. Pipettieren Sie 10 μL jedes Supernatanten in eine 96-Well-Mikroplatte und fügen Sie 100 μL SLS-Reagenz (0,6 mg ^mL-1 in ultrareinem Wasser) hinzu. Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln und messen Sie dann die Absorption bei 412 nm mit einem UV-Vis-Spektrophotometer.
6. Erstellen Sie eine Standardkurve mit Hb-Stocklösungen (0-10 mg ^mL-1) im HEPES-Puffer, um Absorptionswerte in Konzentration umzuwandeln.
7. Berechnen Sie die Verkapselungseffizienz (EE) und den Ladeinhalt (LC) als:
   EE (%) = [(Anfangs-Hb - Supernatant Hb)/Anfangs-Hb] × 100
   LC (%) = [(gekapselt Hb)/(gekapselte Hb + NP-Masse)] × 100
8. Um die Hb-Verkapselung zu erhöhen, inkubieren Sie 100 mg NPs mit 20 ml Hb-Lösung (10 mg mL⁻¹). Um die Porosität nach der Verkapselung zu beurteilen, werden die resultierenden NPs 24 Stunden lang in Ethanol eingetaucht, dann über Nacht in einem Vakuumofen bei 140 °C getrocknet und die Adsorptions-Desorptionsisotherme N₂ aufgenommen, um die Porosität zu bewerten. Die rote Farbe des Pulvers weist auf eine erfolgreiche Einkapselung von Hb hin (Abbildung 5A), und ein deutlicher Rückgang der_N2-Aufnahme bestätigt die erfolgreiche Befüllung der Mesoporen mit Hb (Abbildung 5B).
9. Messen Sie ζ-Potential mit einem Zetasizer Nano ZS. Die Oberflächenladung nimmt von ~+40 mV (HP-UiO-66-N₃ NPs) auf ~+20 mV (Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs) ab, was mit der Hb-Adsorption übereinstimmt (Abbildung 5C).
10. Optional: SEM-Mikrographie (Abbildung 5D) und PXRD-Diffraktographie (Abbildung 5E) erwerben, um morphologische Integrität und strukturelle Stabilität sicherzustellen.
11. Zeichnen Sie UV-Vis-Spektren (375–700 nm) auf, um die reversible Sauerstoffbindung der NPs zu beurteilen. Fügen Sie Natriumdithionit hinzu und spülen Sie mit N₂ für 10 Minuten, um Sauerstoff freizusetzen, nehmen Sie das Spektrum auf, dann 10 Minuten mit Luft spülen, um eine erneute Bindung zu ermöglichen, und nehmen Sie das Spektrum erneut auf (Abbildung 5F).
    HINWEIS: Das Vorhandensein charakteristischer Soret- und Q-Bänder von sauerstoffreichem (~412 nm für das Soret-Band; ~541 und ~577 nm für Q-Bänder) und sauerstoffarmen (~430 nm für das Soret-Band; ~557 nm für Q-Band) Hb nach der Reinigung mit Luft bzw. N₂ zeigt, dass Hb weiterhin funktionsfähig bleibt.
12. Man kann mit einheitlichen roten Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs rechnen, die funktional aktives Hb mit reversiblem Sauerstoffsättigungsverhalten enthalten.

5. Herstellung von Hb@HP-UiO-66-PEG NPs: PEGylation über SPAAC (Erwartete Dauer: 2 Tage)

1. Bereiten Sie ein 2 mL Zentrifugenrohr vor, das Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs (10 mg) enthält, verteilt in 0,5 mL ultrareines Wasser. Füge DBCO-PEG (Mw ~2.000, 20 mg in 0,5 mL ultrareinem Wasser) hinzu, um ein Verhältnis von 2:1 (w/w) von PEG zu NPs zu erreichen. Vortex vortexen, bis es vollständig gemischt ist.
2. Inkubieren Sie die Mischung auf einem Thermoshaker bei Raumtemperatur und 1.000 U/min für 1 Stunde und geben Sie sie dann in einen Kühlschrank (4 °C) für die Reaktion über Nacht (~16 H). Diese katalysatorfreie SPAAC-Klickreaktion koppelt DBCO kovalent an die Azidgruppen und bildet stabile Triazol-Bindungen.
3. Zentrifugieren Sie mit 12.000 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die PEGylierten Hb@HP-UiO-66-PEG NPs zu pelletieren. Wenn der Niederschlag nicht vollständig pelletiert ist, verlängern Sie die Zentrifugationszeit bei Bedarf. Entsorgen Sie den Supernatant mit nicht reagiertem PEG.
4. Waschen Sie das Pellet dreimal mit ultrareinem Wasser (jeweils 2 ml durch Pipettieren nach oben und unten) unter identischen Zentrifugationsbedingungen. Dies gewährleistet die Entfernung freier PEG-Ketten und kleiner molekularer Nebenprodukte.
5. Die gereinigten Hb@HP-UiO-66-PEG NPs in 2 mL ultrareines Wasser aufhängen und bei 4 °C aufbewahren.
   Das Kolloid erscheint homogen und leicht opalisierend, was auf eine gute Dispersionsstabilität hinweist.
6. Bestätigung der erfolgreichen PEGylation mittels FTIR-Spektroskopie (Abbildung 6A): Verschwinden des Azidbands bei 2122 ^cm-1 und Auftreten von PEG-abgeleiteten Methylen- (−CH₂-)- und Etherbindungssignalen (−O−) bei 2883 bzw. 1097 ^cm-1.
7. Überprüfen Sie mit ¹H NMR (Abbildung 6B) nach alkalischer Verdauung bei 2 M KOH/_{D 2}O; PEGylierte Proben zeigen ein zusätzliches Signal bei δ = 3,53 ppm, entsprechend den Oxyethylenprotonen von PEG.
8. Hydrodynamischen Durchmesser und Polydispersitätsindex (PDI) werden mit DLS gemessen (Abbildung 6C).
   Eine Erhöhung von ~115 nm (PDI ~0,1) auf ~140 nm (PDI ~0,17) bestätigt eine Oberflächenbeschichtung mit einer dünnen Polymerschicht.
9. Optional: Messung des Oberflächen-ζ-Potentials mit einem Zetasizer Nano ZS, um den vernachlässigbaren Effekt der Oberflächen-PEGylation auf die Oberflächenladung zu überprüfen (Abbildung 6D). Eine geringfügige Veränderung nach der PEGylation (von ~+20 mV auf ~+17 mV) zeigt einen minimalen Einfluss auf die Oberflächenladung.
10. Beobachte die Morphologie anhand von TEM (Abbildung 6E). TEM zeigt einen diffusen Rand von ~10–12 nm um die Teilchenkante, der die PEG-Korona repräsentiert.
11. Führen Sie einen Sauerstofffreisetzungstest mit einer Sauerstoffelektrode durch (Abbildung 6F), um zu zeigen, dass die Hb-Funktion nach der PEGylierung intakt bleibt, ähnlich wie in der nicht-PEGylierten Form. Erwarten Sie stabile, rötlich-braun-dispersierte Hb@HP-UiO-66-PEG NPs, die eine starke kolloidale Stabilität und erhaltene sauerstoffbindende Kapazität zeigen, geeignet für langfristige physiologische Tests.
12. Optional: Durchführung von Sauerstoffdissoziationskurven (ODCs) aus freiem Hb und Hb, die in Hb@HP-UiO-66-PEG NPs gekapselt sind, um den partiellen Sauerstoffdruck bei 50 % Hb-Sauerstoffsättigung (p50) und den Hill-Koeffizienten (Hill-n) zu bestimmen (Abbildung 7).

6. Bewertung der Stabilität der NPs (Erwartete Dauer: 7 Tage)

1. Dosieren Sie Hb@HP-UiO-66-PEG NPs (~5 mg) in sieben 2-mL Zentrifugenröhren. Fügen Sie von jedem Medium 2 ml hinzu: ultrareines Wasser, Kochsalzlösung (0,9 % NaCl), HEPES (20 mM), Mausserum, menschliches Plasma, Dulbeccos modifiziertes Eagle's mittelhohe Glukose (DMEM) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Stellen Sie sicher, dass die Zentrifugenröhrenkappen fest geschlossen sind, um eine Verdunstung des Mediums während der Inkubation zu verhindern. CD-1-Mausserum und menschliches Plasma werden bei Innovative Research (Novi, MI, US) gekauft.
2. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C in einem Thermoshaker bei 1.000 U/min für bis zu 7 Tage.
3. Nach 3 und 7 Tagen sammeln Sie die Partikel durch Zentrifugation (12.000 g, 10 min, Raumtemperatur), waschen Sie einmal mit ultrareinem Wasser und trocknen Sie sie für PXRD (Abbildung 8A). Wenn der Niederschlag nicht vollständig pelletiert ist, verlängern Sie die Zentrifugationszeit bei Bedarf.
4. Bei 0, 24, 72 und 168 h werden Aliquots (~50 μL) entfernt und 20-fach verdünnt für die DLS-Analyse (Größe und PDI) (Abbildung 8B).
5. Optional: SEM-Proben nach 48 Stunden in PBS vorbereiten, um die Morphologie visuell zu überprüfen (Abbildung 8C).
   HINWEIS: Die Verdünnung der NP-Suspension (in PBS) mit ultrareinem Wasser ist für die SEM-Analyse unerlässlich, da sie die Hintergrundinterferenz durch Pufferkomponenten reduziert und eine klare Bildgebung der NPs erleichtert.
6. Im Vergleich zu nicht-PEGylierten Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs unter identischen Bedingungen; das schnelle Verschwinden charakteristischer kristalliner Reflexionen und das Auftreten breiter amorpher Streumerkmale deuten auf Instabilität ohne PEG-Beschichtung hin.
   HINWEIS: PEGylierte Proben bleiben nach 7 Tagen in allen Medien strukturell intakt, während nicht-PEGylierte innerhalb von 24 Stunden in PBS oder DMEM zerfallen.

7. Physikalisch-chemische Charakterisierung (Erwartete Dauer: ~15 Tage)

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt die analytischen Methoden, die erforderlich sind, um die Morphologie, Zusammensetzung, Porosität und Hb-Integrität von NPs zu bestätigen. Diese Charakterisierungstechniken validieren gemeinsam die Reproduzierbarkeit der Synthese- und Modifikationsprozesse.

1. PXRD
   1. Trocknen Sie ~5 mg jeder NP-Probe über Nacht in einem Gefriertrockner vor der Messung, um adsorbierte Feuchtigkeit zu entfernen.
   2. Laden Sie die Probe auf einen flachen Siliziumhalter ohne Hintergrund und glätten Sie sie vorsichtig mit einem sauberen Glasträger, um eine dünne, gleichmäßige Schicht zu bilden.
      HINWEIS: Vermeiden Sie zu starkes Drücken, da dies bevorzugte Orientierungseffekte hervorrufen kann.
   3. Zeichnen Sie PXRD-Muster mit einem Tischdiffraktometer auf, das mit Cu Kα-Strahlung ausgestattet ist (λ = 1,5418 Å). Scanneparameter werden auf 2θ = 4-50°, Schrittweite = 0,02° eingestellt, Dwell = 1 s pro Schritt.
   4. Vergleichen Sie die erhaltenen Muster mit der simulierten UiO-66-Struktur, die mit der Mercury-Software auf Basis der zuvor gemeldeten Kristalldaten³¹ erzeugt wurde. Das Vorhandensein scharfer Spitzen bei 7,3°, 8,4° und 25,7° weist auf die kristalline Integrität hin.
2. N₂ Adsorption-Desorption (BET-Oberfläche und Porengrößenverteilung)
   1. Entfetten ~100 mg jeder NP-Probe bei 140 °C unter Vakuum für 24 Stunden mit einem Micromeritics Smart VacPrep-System mit Purging Ultra-High-Purity N₂.
   2. Übertragen Sie die entgasten Proben sofort in den Analyseport eines Micromeritics Tristar-Oberflächenanalysators. Zeichnen Sie_{N2-Isothermen} bei 77 K innerhalb eines relativen Druckbereichs (P/P₀) von 0-1 auf.
   3. Berechnen Sie Oberflächenflächen mit der BET-Methode nach den erweiterten Rouquerol-Kriterien⁵². Berechnung der Porengrößenverteilung mithilfe der nicht-lokalen Dichtefunktionaltheorie, die in der Micromeritics-Software implementiert ist.
   4. Erstellen Sie die Adsorptions-/Desorptionskurven und Porengrößenverteilungsdiagramme mit Origin 2022. Importiere die Adsorptions-/Desorptionsdaten in die Software, mit relativem Druck (P/P₀) auf der X-Achse und dem adsorbierten Volumen von N₂ auf der Y-Achse.
   5. Zeichnen Sie die Porengrößenverteilungsdaten mit der Porenbreite als X-Achse und dem inkrementellen Porenvolumen als Y-Achse dar. Präsentieren Sie die Ergebnisse als "Linie + Symbol"-Graphen. Führen Sie alle Analysen mit den Standardeinstellungen der Software durch.
3. FTIR-Spektroskopie
   1. Mahlen Sie ~5 mg jeder getrockneten Probe mit einem sauberen Agatmörtel zu einem feinen Pulver. Platziere das Pulver auf den ATR-Kristall eines ALPHA-P Bruker^{Spektrometers 53}.
   2. Sammeln Sie Spektren im Bereich von 4.000 bis 400 ^cm-1 mit einer Auflösung von 2 cm^.
   3. Charakteristische Gipfel identifizieren: Das Auftreten der_N3-Dehnung bei ~2122 ^cm-1 bestätigt die Azidbildung (Abbildung 4A). Nach der PEGylation beobachten Sie die −CH₂−- und C-O-C-Bänder bei ~2883 ^cm-1 bzw. ~1097 ^cm-1 sowie das Verschwinden der N 3-Dehnung (Abbildung 6A). Erwarten Sie, dass das Verschwinden des Azidbands und das Auftreten von PEG-abgeleiteten Methylen- (−CH₂−)- und Etherknochensignalen (−O−) die Vollendung der SPAAC-Reaktion bestätigen.
   4. Plotte die FTIR-Kurven mit Origin 2022. Importiere die Rohdaten mit X- (Wellenzahl) und Y (Übertragungswert) in die Software. Erstellen Sie Diagramme im "Line"-Format mit den Standardeinstellungen der Software.
4. ¹H NMR
   1. Fügen Sie ~10 mg NPs zu 0,5 ml 2 M KOH in D₂O in einem Glasfläschchen hinzu und erhitzen Sie es 1-2 Stunden bei 80 °C, um das Gerüst zu verdauen.
   2. Zentrifuge (12.000 x g, 10 min, Raumtemperatur), um die ungelösten Rückstände zu spinnen. Übertragen Sie das Supernatant auf ein 5-mm-NMR-Rohr.
   3. Zeichnen ^Sie1H-NMR-Spektren auf einem 400-MHz-Bruker Avance-Spektrometer auf.
   4. Weisen Sie die charakteristischen chemischen Verschiebungen zu, einschließlich der aromatischen Protonen von BDC-NH₂ (δ = 6-8 ppm) und PEG-Signalen (δ = ~3,53 ppm, Abbildung 6B), mit Hilfe der Software von MestReNova. Analysieren Sie die NMR-Daten mit dem NMR-Verarbeitungsmodul der Software mit den Standardeinstellungen.
5. SEM
   1. Tropfen ~5 μL NP-Suspension auf einen Siliziumwafer abgeben; Lassen Sie es in einem staubfreien Schrank an der Luft trocknen. Falls geladen wird, sputter-codierte mit 5 nm Gold.
   2. Bild auf einem FEI Quanta 200 SEM bei 10-20 kV Beschleunigungsspannung.
   3. Analysieren Sie die Bilder mit ImageJ. Importiere die originalen TIFF-Bilder mit eingebetteten Skalierungsinformationen in die Software und passe Helligkeit und Kontrast ausschließlich zur Visualisierung an. Wenden Sie keine zusätzliche Verarbeitung an, die die dimensionalen Informationen beeinflussen könnte. Generiere die Skalenbalken mit der Analysefunktion der Software.
6. TEM
   1. Bringen Sie ~5 μL NP-Dispersion auf ein Spitzen-Kohlenstoff-Cu-Gitter (300 Gitter). Überschüssiges Papier mit Filterpapier abtupfen und bei Umgebungsbedingungen trocknen.
   2. Untersuchen Sie unter einem FEI Tecnai T20 G2 TEM bei 200 kV.
   3. Analysieren Sie die Bilder mit ImageJ. Die Bildverarbeitung folgt den in Abschnitt 7.5.3 beschriebenen Verfahren.
7. DLS und ζ-Potenzial
   1. Verdünnen Sie NPs ~20-fach in ultrareinem Wasser zur Größen- und PDI-Analyse; für ζ-Potential verdünnen Sie im HEPES-Puffer (20 mM, pH 7,4).
   2. Messen Sie mit einem Zetasizer Nano ZS bei 25 °C. Mindestens drei unabhängige Proben (n = 3) werden vorbereitet, und jede Probe wird im Dreifach vermessen.
   3. Plotten Sie die DLS- und ζ-Potential-Daten mit Origin 2022. Stellen Sie die intensitätsgewichtete Partikelgrößenverteilung als "Linie + Symbol"-Graphen und ζ-Potential-Ergebnisse als "Spalten"-Graphen dar. Geben Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) an. Führen Sie alle Analysen mit den Standardeinstellungen der Software durch.
8. UV-vis-Spektroskopie für Hb-Funktionalität
   1. Verteilt 3 mg freies Hb oder eine entsprechende Menge NPs (d. h. mit einer äquivalenten Menge eingeschlossenes Hb) in 3 ml ultrareines Wasser. Trage die Federungen auf eine Quarz-Cuvette um. Zeichnen Sie UV-Vis-Spektren von 375–700 nm mit einem UV-2600 UV−vis-Spektrophotometer auf.
   2. Gib eine Prise Natriumdithionit zur Hb-Lösung oder NP-Suspension und spüle mit N₂ für 10 Minuten, um die Probe zu deoxygenieren. Zeichnen Sie die Verschiebung des Soret-Bandes von 412 auf 430 nm und die Verschmelzung der Q-Bänder auf. Die Probe wird 10 Minuten lang durch Luftblubbern wieder mit Sauerstoff versorgt, um die Umkehr zu beobachten (Abbildung 5F und ergänzende Abbildung 1).
   3. Plotte die Daten mit Origin 2022. Präsentieren Sie die Spektren als "Linien"-Graphen, mit Wellenlänge auf der X-Achse und Absorption auf der Y-Achse.
9. Quantifizierung des freigesetzten Sauerstoffs
   1. Verteilt 1 mg freies Hb oder eine entsprechende Menge Hb@HP-UiO-66-N₃ und Hb@HP-UiO-66-PEG NPs (mit einer äquivalenten Menge verkapseltes Hb) in 600 μL ultrareines Wasser. Übertragen Sie die Federungen in 2-ml-Glasphiolen und schließen Sie sie fest mit Gummikappen ab.
   2. Führen Sie vorsichtig die Nadelproben der Sauerstoffelektrode durch die Gummikappe in die Suspension ein, um den gelösten Sauerstoffgehalt mit einem Nadeltyp O2-Messgerät zu überwachen.
   3. Fügen Sie schnell K₃[Fe(CN)₆] Lösung (10 Gewichtsprozent in 100 μL ultrareinem Wasser) mit einer Spritzennadel zur Suspension hinzu und dokumentieren Sie kontinuierlich die Veränderung des Sauerstoffgehalts.
   4. Berechnen Sie den freigesetzten Sauerstoff, indem Sie den maximal beobachteten Wert nach der Addition von K₃[Fe(CN)₆] vom Anfangswert vor der Addition subtrahieren. Normalisieren Sie die erhaltenen Werte auf den Sauerstoff, der aus derselben Menge freies Hb freigesetzt wird (Abbildung 6F) mit Origin 2022. Messen Sie drei unabhängige Stichproben (n = 3) für freies Hb oder jedes NP.
      HINWEIS: Hb@HP-UiO-66-N₃ und Hb@HP-UiO-66-PEG NPs zeigen vergleichbare Sauerstofffreisetzung, wobei jeder ~60 % des freigesetzten Sauerstoffs freisetzt.
10. Messung der ODCs und Berechnung von p50 und Hill-n
    1. Bereiten Sie freie Rinder-Hb oder Hb@HP-UiO-66-PEG NPs mit einer Endkonzentration von ~1 mg ^mL-1 in 3 mL HEPES-salinhaltigem Puffer (20 mM HEPES, 0,9 % (w/v) NaCl, pH 7,4) vor). Übertragen Sie die Probe in eine Quarz-Cuvette, die mit einer magnetischen Rührstange ausgestattet ist.
    2. Stecke die Cuvette in einen Hämoxienanalysator. Stellen Sie die Messtemperatur auf 37 °C ein und lassen Sie das System unter kontinuierlichem Rühren ausgleichen, bis eine stabile Basislinie erreicht ist.
    3. Erfassung der ODCs durch schrittweise Deoxygenierung über einen Partialdruckbereich von 1–148 mmHg. Verwenden Sie die vorinstallierte Hemox-Analysator-Software, um ODCs zu messen und p50 sowie Hill-n mit den Standard-Analyseeinstellungen zu berechnen. Messen Sie für jede Probe drei unabhängige Stichproben (n = 3).
    4. Exportieren Sie die verarbeiteten Daten und zeichnen Sie die ODCs mit Origin 2022 im Standardformat "Line"-Graphen auf.

8. Reproduzierbarkeit und statistische Analyse

1. Führen Sie alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren mindestens dreimal unabhängig durch. Berichte die Ergebnisse als typische Ergebnisse über diese Wiederholungen hinweg. Halten Sie die wichtigsten experimentellen Parameter wie Reaktionszeiten und Temperaturen innerhalb eines angemessenen Bereichs, um Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit für andere Nutzer sicherzustellen.
2. Präsentierte strukturelle Charakterisierung (PXRD, N₂ Adsorption-Desorption, FTIR, ¹H NMR, SEM, UV-vis) als repräsentative Daten für qualitative Bestätigung ohne statistische Analyse.
3. Berichte quantitative Messungen (DLS, ζ-Potential, p50, Hill-n) als Mittelwert ± SD (n ≥ 3). Bestimmen Sie die statistische Signifikanz mit ungepaartem zweiseitigem Welch-t-Test oder Einweg-ANOVA, je nach Zweck. Geben Sie die Signifikanzstufen als ns (kein signifikant), * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001 an.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Synthese der HP-UiO-66-NH₂ NPs wurde durch PXRD bestätigt (Abbildung 2A), das die charakteristischen Beugungsspitzen bei 2θ = 7,3°, 8,4° und 25,7° aufwies, was gut mit der simulierten UiO-66-Struktur³⁶ übereinstimmt. Die leichte Spitzenerweiterung im Vergleich zum simulierten Muster wurde den nanoskaligen Dimensionen der Partikel zugeschrieben und bestätigte die Erhaltung der kristallinen Integrität nach

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen robusten und reproduzierbaren Weg zur Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von HP-UiO-66 NPs, die für Hb-Verkapselung und Sauerstoffzufuhr entwickelt wurden. Durch die Anwendung eines Inside-Out-Engineering-Ansatzes schafft diese Arbeit einen verallgemeinerbaren Rahmen für die Entwicklung von MOF-NPs für biomedizinische Anwendungen, einschließlich Biomakromolekül- und Arzneimittelabgabe. Obwohl das zugrundeliegende Materialkonzept und die funkt...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-Amino-1,4-Benzoldicarbonsäure	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	381071-25G
4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-Ethanesulfonsäure	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	H3375-100G
Aceton (99 %)	VWR International (Sø borg, DK)	23J244030
Bicinconinsäure-Protein-Assay	Thermo Fisher Scientific (Roskilde, DK)	23235
Rinderblut	SSI Diagnostica A/S (Hillerø d, DK)	77667
Zentrifugenröhre
Zentrifuger	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, USA)	75009903	Megafuge ST Plus Serie
Deuteriumoxid	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	151882
Dibenzocyclooctyn-Polyethylenglykol	BroadPharm	BP-23949
Dodekansäure	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	L556-1KG
Dulbecco' s modifizierte Adler' s medium− hoher Glukose 	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	11965092
Ethanol (100 %)	VWR International (Sø borg, DK)	24L044013
Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie	Bruker (Billerica, USA)
Hämatoxanalysator	TSC Scientific Crp (PA, USA)
Humanes zitratetes Plasma	TebuBio	SER-PLP25
Salzsäure (37 %)	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	320331-500ML
ImageJ-Software	National Institutes of Health (USA)		Version 1.47t
Lacey-Carbon-Cu-Gitter (300 Mesh)	Agar Scientific Ltd. (Stansted Essex, Großbritannien)	AGS166-3H
Magnetischer Rührer	IKA-Werke GmbH & Kompanie KG (,DE)	Ident. Nein: 0010011496
MestReNova sofeware	Mestrelab Forschung (Spanien)		Version 12
Micromeritics Tristar-Oberflächenanalysator	Thermo Fisher Scientific Inc.	ASAP 2020 Plus
Mini-Zentrifuge	Eppendorf Nordic (Hø rsholm, DK)	Katalognummer & nbsp; 5452000010
Mausserum	Innovative Forschung (Novi, MI, USA)	IGMSCD1SER10ML
Muffle Furnace	Nabertherm GmbH (Bremen, DE)	Schalldämpferofen LE 6/11
N,N&prim;-Dimethylformamid (99,9 %)	VWR International (Sø borg, DK)	250131a008
Nanodrop 2000c-Geräte	Thermo Fisher
Kernresonanz	Bruker (Billerica, USA)
O2 meter	PreSens (Regensburg, Deutschland)
Origin 2022 Software	OriginLab Corporation (MA, USA)		Version 2022
Sauerstoffsensor	PreSens (Regensburg, DE)	OXY-1 ST-Spur
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	P4417-50TAB
Plattenleser	Tecan Group Ltd.  (Mä nnedorf, CH)
Kaliumhexacyanoferrat	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	60299-100G
Kaliumhydroxid	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	221473-500G
Pulver-Röntgenbeugung	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Großbritannien)		Modell: Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD für Pulvermessungen (veröffentlicht 2020)
Rundboden-Druckbehälter	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	SYNP170004-1EA
Rasterelektronenmikroskopie	FEI-Kompanie (Hillsboro, USA)	Dual Beam FEI Helios Nanolab 600
natriumclorid	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	71376
Natriumdithionit	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	71699-250G
Natriumdodecylsulfat	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	L4509-100G
Synthware & Handel; Rundboden-Druckbehälter	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	SYNP170003
Tert-Butylnitrit	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	20370-100ml-F
Tetrahydrofuran (99,7 %)	VWR International (Sø borg, DK)	201022A004
Thermoshaker	Grant Instruments (Cambridge) Ltd (Großbritannien)	PHMT-PSC18 (01012015020119)
Transmissionselektronenmikroskopie	FEI-Kompanie (Hillsboro, USA)	FEI Tecnai T20
Trimethylsilylazid	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	155071-10G
TSC HEMOX DAQ System	TSC Scientific Crp (PA, USA)		Hemox Analyzer Software
Ultrosound Sonicator	Branson Ultrasonics Corporation (Danbury, USA)	SKU: 2410240003
UV-Vis-Spektrophotometer	Shimadzu (Kyoto, JP)
Vakuumofen	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, USA)
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Großbritannien)	Seriennummer. MAL1188530
Zirkonium(IV)chlorid	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	357405-100G