Visualisierung und quantitative Analyse der durch Genotoxin induzierten PARP1/PARP2-Aktivierung in Zellen mit einem fluoreszierenden Fusionsprotein-basierten Reporter

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode zur zellbasierten Visualisierung, subzellulären Lokalisierung und quantitativer Analyse von poly(ADP-ribose) (PAR)-angereicherten Fokussen in fixierten Säugetierzellen. Dieser Test ermöglicht die Quantifizierung von Stellen mit DNA-Schaden-induzierter PARP-Aktivierung, einschließlich derjenigen, die mit der Basen-Exzisionsreparatur oder der Reparatur eines Einzelstrangbruchs verbunden sind, in den Kkernen von genotoxin-exponierten Zellen.

Abstract

Poly(ADP-ribose) (PAR) ist ein Polymer von ADP-Ribose, das von vier Mitgliedern der ADP-Ribose-Polymerase-Polymerase-Familie synthetisiert wird – PARP1, PARP2, PARP5a und PARP5b. Allerdings synthetisieren nur PARP1 und PARP2 PAR als Reaktion auf DNA-Brüche. PAR wird als posttranslationale Proteinmodifikation definiert, aber es wird auch gezeigt, dass es als DNA- oder RNA-Modifikation existiert. Die PAR-Spiegel werden weiter durch PARG reguliert, eine PAR-Glykohydrolase, die zusammen mit PARP1 und PARP2 das zelluläre Niveau des durch DNA-Schaden induzierten PAR moduliert. Die dynamische Synthese und Abbau von PAR ist entscheidend für seine regulatorische Rolle bei der DNA-Reparatur und die DNA-Schadensreaktion, die wiederum die Reorganisation, Replikation, Transkription und Zelltod beeinflusst. Die Aktivierung und Akkumulation von PARP1/PARP2 können als Orte der laufenden Basenexzisionsreparatur oder DNA-Einzelstrangbruchreparatur betrachtet werden; zahlreiche PARP1/PARP2-Aktivatoren sind jedoch auch mit Replikationsstress und anderen DNA-Stoffwechselprozessen assoziiert. Einmal gebildet, erleichtern PAR-Ketten die Rekrutierung von DNA-Reparatur- und DNA-Schadensreaktionsfaktoren (DDR) an Stellen mit DNA-Schaden oder genomischer Störung über ihre PAR-bindenden Domänen (PBDs). Zehn verschiedene PBDs erkennen verschiedene Regionen des PAR-Moleküls, darunter das PAR-Bindungsmotiv, den PAR-bindenden Zinkfinger, die WWE-Domäne und die Makrodomäne, neben anderen PBDs. Um die zelluläre Analyse der PAR-Dynamik zu erleichtern, verwendeten wir PBDs, die mit verbessertem grünem fluoreszierendem Protein (EGFP) fusioniert wurden, um die zellbasierte Quantifizierung von PAR-Foci zu optimieren. Wir beschreiben einen Assay, der ein Fragment von RNF146 verwendet, das die PBD/WWE-Domäne kodiert und mit EGFP verknüpft ist, um die Ansammlung von PAR an Stellen genomischer Insults und laufender BER oder SSBR zu visualisieren und zu quantifizieren. Wir beschreiben experimentelle Schritte, darunter die Produktion von lentiviralen Partikeln, die Transduktion der Zielzelllinie, die Behandlung von Säugetierzellen zur Induzierung von genomischen DNA-Schäden, die Erfassung von konfokalen Fluoreszenzmikroskopographien und die halbautomatisierte Quantifizierung der Daten.

Introduction

Dieses Protokoll beschreibt den LivePAR-Assay, der die Visualisierung und quantitative Analyse von Poly (ADP-ribose) (PAR) an Stellen der genomischen Insult ermöglicht, hauptsächlich im Zusammenhang mit der Basenexzisionsreparatur (BER) oder der Einzelsträngbruchreparatur (SSBR), in Säugetierzellen ^1,2,3. BER ist ein entscheidender DNA-Reparaturweg, der beschädigte oder modifizierte Basen aus der DNA entfernt (für Übersichten zu BER und PARylation siehe 4,5,6,7). BER beginnt mit DNA-Glykosylasen, die modifizierte Basen⁴ erkennen und entfernen, wobei eine apurinische/apyrimidinische (AP) Stelle bleibt, zum Beispiel Methylpuringlykosylase (MPG), die methylierte Basen ^8,9 entfernt, oder 8-Oxoguaninglykosylase (OGG1), die 8-OxoG ^9,10 entfernt. AP-Stellen werden dann durch AP-Endonuklease 1 (APE1)11,12,13 gespalten, wodurch eine Kerbe im DNA-Rückgrat entsteht. Eine Polymerase, nämlich DNA-Polymerase β (Polβ)^14,15, passt die Lücke an und füllt die Lücke mit dem unbeschädigten Strang als Vorlage, und schließlich versiegeln DNA-Ligasen den reparierten^{Strang 16,17}, zum Beispiel DNA-Ligase I oder DNA-Ligase III.

Die wichtigsten Akteure in BER und SSBR sind die Poly(ADP-ribose) Polymerasen 1 und 2 (PARP1/PARP2)18,19,20, Enzyme, die DNA-Strängbrüche während BER oder SSBR schnell erkennen. Nach der Erkennung dieser Brüche katalysiert PARP1/PARP2 die Zugabe von ADP-Ribose-Polymeren zu sich selbst und anderen Proteinen – ein Prozess namens PARylation (zur Übersicht, siehe⁶) – durch Hydrolysierung von NAD⁺. Dadurch entsteht ein dynamisches Proteingerüst (PAR), das andere DNA-Reparaturfaktoren an die Stelle des Schadens anzieht und so die Genauigkeit der DNA-Reparatur erhöht. Um dieses dynamische PAR-Gerüst zu steuern, tragen mehrere Proteine zur Hydrolyse und Entfernung von PAR-Ketten bei, darunter ADP-ribose-Akzeptorhydrolase 3 (ARH3), terminale ADP-Riboseglycosylhydrolase 1 (TARG1), Mono-ADP-Ribosylhydrolase 1/2 (MacroD1/2) und Poly(ADP-ribose) Glykohydrolase (PARG)6,21,22,23,24,25,26 . PARG ist jedoch hauptsächlich für diesen Prozess^{verantwortlich und} spielt eine entscheidende Rolle in der DNA-Schadensreaktion (DDR)^28,29.

PARG ist daher kritisch mit der Funktion von PARP1 und PARP2 verknüpft. Während PARP1 und PARP2 die PAR-Polymere erzeugen, wirkt PARG als "Reinigungsenzym", das diese Polymere hydrolysiert und PARylation^30,31 effektiv umkehrt. Dieser Prozess ist unerlässlich, um sowohl BER als auch SSBR abzuschließen und PARP1/PARP2 recyceln zu können, um auf neue DNA-Schäden zu reagieren. Folglich arbeiten PARP1, PARP2, PARylation und PARG koordiniert und gewährleisten eine effiziente und reversible DNA-Reparatur durch BER und SSBR ^4,6.

Das Ausmaß der PARylation kann durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden und spielt eine wesentliche Rolle für die gesamte DNA-Schadensantwort³². Zu diesen Faktoren gehört die Exposition gegenüber Genotoxinen, die Addukte zu DNA-Basen hinzufügen, wie N-methyl-N'-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG), Methylmethansulfonat (MMS), Wasserstoffperoxid (H₂O₂) oder tert-butylhydroperoxid (tBuOOH). Darüber hinaus kann das Ausmaß der PARylation durch Moleküle beeinflusst werden, die den PARylierungsprozess modulieren, wie etwa Dihydronicotinamid-Ribosid (NRH), ein Vorläufer von NAD⁺, das die PARP-Aktivierung durch Erhöhung der NAD⁺-Spiegel erhöht, oder FK866, ein Inhibitor von NAMPT, der die NAD^+-Spiegel senken und die PARP-Aktivierung³ negativ regulieren kann. Schließlich können genetische Mutationen oder kleine Molekülhemmung von Enzymen wie PARP1/PARP2, PARG oder anderen DNA-Reparaturproteinen (z. B. Defekte in BER oder homologe Rekombinationsfaktoren wie BRCA1/BRCA2) die PARP-Aktivierung 33,34,35,36 verändern.

Der LivePAR-Test verwendet ein Fragment des Ringfingerproteins 146 (RNF146), das eine WWE-Domäne (Aminosäuren 100–182) codiert und mit einem verstärkten grünen Fluoreszenzprotein (EGFP)³ verknüpft ist. Die WWE-Domäne ist eine kugelförmige Domäne, benannt nach den konservierten Resten Tryptophan (W) und Glutamat (E) in ihrer Bindungsstelle³⁷. WWE-Domänen binden an iso-ADP-ribose, die kleinste interne strukturelle Einheit innerhalb der PAR-Ketten^38,39. RNF146 ist eine E3-Ubiquitin-Ligase, die Iso-ADP-Ribose^38,40 erkennt und Proteine anvisiert, die an BER beteiligt sind (XRCC1, DNA-Ligase III und PARP1) für den proteasomalen Abbau⁴¹. Die Verknüpfung dieser WWE-Domäne mit EGFP ermöglicht die Visualisierung und Detektion von genotoxininduzierten PARylationsstellen in Säugetierzellen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Entstehung stabiler Zelllinien, die den LivePAR-Reporter exprimieren (Abbildung 1A), die Induktion von DNA-Schäden zur Aktivierung von PARP1/PARP2, die Produktion von PAR sowie die Erfassung und Analyse von konfokalen Fluoreszenzmikroskopiedaten (Abbildung 1).

Das pMD2.g(VSVG)-Plasmid liefert das virale Hüllen-Glykoprotein (VSVG), das den Bereich der Zellen, die das Virus infizieren kann, im Vergleich zum nativen Lentivirus-Hüllenprotein erweitert. Das pRSV-REV-Plasmid liefert das regulatorische Element (REV) Protein, das ein entscheidender Transaktivator ist, der an die virale RNA bindet und die Transkription der viralen Gene aktiviert; Sie ist für eine effiziente virale Replikation unerlässlich. Das pMDLg/pRRE-Plasmid liefert mehrere wichtige interne Verpackungskomponenten, nämlich Gag, das die Matrix (MA), Capsid (CA) und Nukleokapsidproteine (NC) codiert, Pol, das die für die virale Replikation und Integration in das Genom der Wirtszelle benötigten Enzyme codiert, sowie das RNA-regulatorisches Element (RRE), ein RNA-Element, das die Effizienz der viralen RNA-Translation und der genomischen RNA-Verpackung verbessert. Das pLV-EF1A-LivePAR-Hygro-Plasmid (Abbildung 1A) enthält cDNA, das für das verbesserte grüne Fluoreszenzprotein (EGFP) codiert und mit dem C-Terminus der WWE-Domäne von RNF146 (Aminosäuren 100–182) fusioniert ist, einer Proteindomäne, die an Poly- (ADP-Ribose-)Ketten bindet, und der Vektor codiert außerdem eine Hygromycin-Resistenzkassette. Das Virus wird aus dem Zellkultur-Supernatanten isoliert und kann bei -80 °C gespeichert oder sofort zur Transduktion verwendet werden (Abbildung 1B).

Protocol

1. Lentivirus-Produktion

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet ein lentivirales Verpackungssystem der dritten Generation^42,43, um Zellen zu erzeugen, die einen genetisch codierten PAR-Reporter exprimieren. Lentivirale Partikel werden in 293-Fuß-Zellen mit einem Vier-Plasmid-System hergestellt, das aus Hüllen-, regulatorischen und Verpackungskomponenten besteht, zusammen mit dem pLV-EF1A-LivePAR-Hygro-Konstrukt, das eine EGFP-markierte WWE-Domäne RNF146 codiert, welche Poly(ADP-ribose)-Ketten bindet. Das resultierende Virus wird verwendet, um stabile Zelllinien zur Visualisierung und Quantifizierung der PAR-Akkumulation zu erzeugen.

1. Kultivierung von 293 Fuß Zellen in DMEM mit 10 % FBS und 1 % Pen/Strep in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 °C und 5 %_CO2. Stellen Sie sicher, dass die 293 Fuß großen Zellen nicht länger als 3 Wochen in Kultur sind.
   HINWEIS: Wir verwenden routinemäßig 293FT-Zellen mit Passagenzahlen zwischen 3 und 10. 293FT-Zellen wurden durch das SV40-Big-T-Antigen transformiert und unsterblich gemacht. Diese Zellen haben eine hohe Transfektionseffizienz, die für die Produktion rekombinanter Proteine und die Genexpressionsstudien unerlässlich ist. Sie sprechen sowohl auf lipidbasierte Transfektions- als auch auf virale Transduktionsmethoden gut an.
2. Platte 1,7 × 10⁵ Zellen mit 293 Fuß auf eine 60 mm große Gewebekulturschüssel in einem finalen Volumen von 5,5 ml Kulturmedium am ersten Tag. Cellen für 24 Stunden zurück in den Inkubator.
3. Am zweiten Tag (dem Tag der Transfektion) geben Sie 375 μL FBS- und Pen/Strep-freies DMEM-Medium in ein 1,5 ml steriles Mikrozentrifugationsrohr. Anschließend fügen Sie 10 μL eines lipidbasierten Transfektionsreagens, 4 μg des pLV-EF1A-LivePAR-Hygro-Plasmids, 2 μg des pMD2.g(VSVG)-Plasmids, 2 μg des pRSV-REV-Plasmids und 2 μg des pMDLg/pRRE-Plasmids hinzu. Tappen Sie das Mikrozentrifugationsrohr vorsichtig an, um das Medien, das Transfektionsreagenz und Plasmid-DNA zu mischen (Vortexen vermeiden). Inkubieren Sie 15–30 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bildung von DNA-/Transfektionsreagenzkomplexen zu ermöglichen.
4. Gib die Plasmid-/Transfektionsmischung in die 60-mm-Schale mit den 293 Fuß zu transfektierenden Zellen, ohne das Medium tropfenweise zu entfernen. Bringen Sie die Zellen für 48 Stunden zurück in den Inkubator.
   HINWEIS: Dieser Zeitraum ermöglicht die Produktion und Freisetzung der lentiviralen Partikel in das Wachstumsmedium.
5. Am 4. Tag sammeln Sie das Kulturmedium aus den transfektierten 293 Fuß großen Zellen, um die Lentiviruspartikel zu isolieren. Filtern Sie durch einen sterilen 0,45-μm-Filter, um Zellreste von den lentiviralen Partikeln zu trennen.
6. Bestimmen Sie den Lentivirus-Titer mit verfügbaren Reagenzien (optional).
   HINWEIS: Diese Methode liefert in der Regel 10⁵ bis 10⁶ infektiöse Einheiten pro mL (IFU/mL), was bei Anwendung im untenstehenden Transduktionsschritt einer ungefähren Infektionsmultiplizität (MOI) von ~5 entspricht.
7. Aliquot das Medien, das die Lentiviruspartikel enthält, in vier sterile Kryoviale (1,0 mL pro Rohr) und bei -80 °C lagern.

2. Transduktion

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt das lentivirale Transduktionsprotokoll, das zur Einführung eines Transgens in Zelllinien verwendet wird (Abbildung 1B). Es war in unserem Labor 1,3,33,37,44,45 durchgehend wirksam.

1. Kultivieren Sie eine Zelllinie Ihrer Wahl (niedrige Durchgangszahl) in dem entsprechenden Medium in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 °C und 5 %_CO2.
   HINWEIS: Beginnen Sie mit einem frühen Durchgang des benötigten Zelltyps. Ein neues Fläschchen mit Zellen muss mindestens einmal aufgetaut und durchgeführt werden, bevor es zur Transduktion ausgesät wird.
2. Am ersten Tag werden 1 Samen 1 × 10⁵–1,5 × 10⁵ Zellen pro Bohrloch auf jede Welle einer 6-Well-Platte in 2 mL Wachstumsmedium gelegt. Bringen Sie die Zellen für 24 Stunden zurück in den Inkubator.
3. Am zweiten Tag (dem Tag der Transduktion) sollten die Zellen zwischen 20 % und 40 % zusammenfließen. Fügen Sie 1 ml Virus, 1 ml Wachstumsmedium und 2 μL Polybren (2 mg/mL Lager) zu einem 15 ml konischen Rohr hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Inversion (Vortex vermeiden).
   HINWEIS: Polybren wird während der Lentivirustransduktion verwendet, um elektrostatische Abstoßung zwischen den Viruspartikeln und der Zellmembran zu verhindern. Da Polybren positiv geladen ist, interagiert es mit den negativ geladenen viralen Glykoproteinen und neutralisiert deren Ladung. Darüber hinaus bindet Polybren im Zellkulturmedium an Glykosaminoglykane und verhindert so deren Wechselwirkung mit dem Virus. Polybrene verbessert daher die Transduktionseffizienz erheblich.
4. Entferne das Wachstumsmedium von der 6-Well-Platte und gib die Mischung aus Virus/Medien/Polybren zu jedem Brunnen. Platzieren Sie die Zellen mit der Transduktionsmischung in einen Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre bei 32 ^°C und 5 %_CO2 für 16–18 Stunden.
   HINWEIS: Das nächtliche Inkubieren von Zellen bei 32 °C während der lentiviralen Transduktion ist eine gängige, wenn auch nicht wesentliche Praxis, die die Wirksamkeit der viralen Infektionen deutlich erhöht. Eine Temperatursenkung verlangsamt den Zellstoffwechsel, wodurch die zelluläre Abwehr verringert und die Anfälligkeit für Virusinfektionen erhöht wird.
5. Am dritten Tag ersetzen Sie das Medium der virusübertragenen Zellen durch frisches Medium und bringen Sie sie in einen 37 °C Inkubator. Inkubieren Sie 48 Stunden.
   HINWEIS: Diese 2 Tage reichen aus, damit die Zellen das RNF146(100–182)-EGFP-Transgen produzieren und gegen Hygromycin resistent werden.
6. Um die resultierenden polyklonalen stabilen Zelllinien zu entwickeln, die das RNF146(100–182)-EGFP-Transgen exprimieren, beginnt anschließend die Hygromycin-Auswahl nach 2 Tagen Inkubation, wie in Schritt 2.5 angegeben.
   1. Alternativ wird diese Population der transduzierten Zellen ohne Hygromycin erweitert und für die PAR-Analyse über die nächsten 10–14 Tage genutzt (transienten Transduktion), wie zuvor beschrieben¹.
7. Übertragen Sie die Zellen auf eine 100-mm-Platte, sobald sie in Anwesenheit von Hygromycin wachsen, und dehnen Sie sich so stark aus, wie nötig.
8. Bereite die Kryobestände der transduzierten Zellen für den zukünftigen Gebrauch vor.
9. Validieren Sie die Expression des RNF146(100–182)-EGFP-Transgens mittels Konfokalmikroskopie, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Das RNF146(100–182)-EGFP-Transgen wird in der gesamten Zelle exprimiert.
10. Validierung der Expression des RNF146(100–182)-EGFP-Transgens durch Immunblotting, wie an anderer Stelle beschrieben ^1,37.

3. Konfokale Mikroskopie und Analyse

HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls beschreibt die Vorbereitung von Deckzetteln, das Aussäen der LivePAR-exprimierenden Zellen, die Exposition gegenüber Behandlungen (tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi und/oder NRH) sowie die Vorbereitung fixierter Zellen auf Mikroskopobjektträgern für konfokale Bildgebung und PAR-Foci-Analyse (Abbildung 1C). Es beschreibt außerdem die Verwendung der ImageJ-Software und eines eigenen Makros zur halbautomatisierten Quantifizierung von PAR-Fokussen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Faktoren (z. B. kleine Moleküle, BER-Protein-Knockouts) auf DNA-schadensabhängige PARylation zu untersuchen, und wurde in unserem Labor^34,37 erfolgreich eingesetzt.

1. Vorbereitung des Deckmantels
   1. Weichen Sie 20 × 20 mm Deckfolien 20 Minuten lang in Diethyläther in einem Glasbehälter in einem Abzugshaube.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Abzugshaube bei der Arbeit mit Diethyläther aufgrund seiner Entflammbarkeit und möglichen Gefahren.
   2. Entfernen Sie den Diethylether und waschen Sie die Deckblätter bei abnehmenden Ethanolkonzentrationen [100 %, 70 %, 50 %, dann 0 % (ddH₂O)].
   3. Entfernen Sie das Wasser und weichen Sie die Überdeckfolien 20 Minuten in 1 N HCl mit sanftem Rühren ein.
   4. Entfernen Sie die HCl und waschen Sie die Überdeckfolien dreimal mit ddH₂0.
   5. Lagern Sie die Deckblätter bis zum Gebrauch in 70 % Ethanol bei 4 °C.
2. Zellplatten
   1. Setze zwei sterile Deckblätter von 20 × 20 mm in eine 60-mm-Zellkulturschale nebeneinander. Bereite so viele Gerichte vor, wie für das Experiment benötigt wird. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Ethanol verdampft ist, bevor Sie Zellen in die Schale mit den Deckzetteln geben. Waschen Sie eventuelle Reste von Ethanol ab, indem Sie steriles PBS für 10–15 Minuten in die Schale geben; Entfernen Sie PBS, bevor Sie die Zellen aussäen.
   2. Säe 200.000 LivePAR-exprimierende Zellen pro Zellkulturschale. Lassen Sie die Zellen 24–36 Stunden an den Deckfolien haften, konditionieren Sie das Medium und beginnen Sie mit der Vermehrung (Wachstum).
3. Induktion von PAR-Brennpunkten
   1. Setzen Sie die LivePAR-exprimierenden Zellen 100 μM NRH, 10 μM PARGi und 10 μM MNNG bzw. 40 μM tBuOOH aus. Zusätzlich sollte man zur Untersuchung der PARP1/PARP2-abhängigen PAR-Bildung PARP1/PARP2 durch Hinzufügen von 10 μM PARPi hemmen. Fügen Sie Verbindungen direkt in das Medium mit den Zellen auf den Deckblättern hinzu und bewegen Sie das Medium vorsichtig in den Zellkulturschalen, um die Verbindungen zu verteilen. Inkubieren Sie die 60-mm-Schalen bei 37 °C für 60–90 Minuten.
      HINWEIS: NRH wird verwendet, um sicherzustellen, dass ausreichende Mengen zellulären NAD⁺ für eine optimale PARP1/PARP2-vermittelte PARylation 33,46,47 verfügbar sind. PARGi wird verwendet, um zu verhindern, dass die von PARP1/PARP2 synthetisierten PAR-Ketten von PARG zerstört werden. MNNG oder tBuOOH wird verwendet, um die DNA-Basenmodifikationen so zu induzieren, dass BER initiiert wird, was zur Aktivierung von PARP1/PARP2 führt. PARPi wird verwendet, um zu bestätigen, dass das Signal (Foci) aus der Aktivierung von PARP1/PARP2 resultiert.
4. Fixierung der Zellen und Anbringen der Deckblätter
   1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie mit PBS.
      HINWEIS: Das ein- oder zweimalige Waschen mit PBS ist wichtig, da das Medium, das zur Zellkultur verwendet wird, eine hohe Konzentration an Serumproteinen enthält. Das Waschen mit PBS entfernt außerdem eventuelle Restreste von MNNG oder tBuOOH im Medien.
   2. Präfixe 4 % Formaldehyd in PBS für 15 Minuten bei Zimmertemperatur. Wasche die Zellen dreimal mit PBS.
   3. Beheben Sie, indem Sie 3 ml kaltes (-20 ^°C) Methanol: Aceton (7:3) zu den Zellen hinzufügen. Stell die Schalen 9 Minuten lang bei -20 ^°C auf.
   4. Entferne Methanol: Aceton. Waschen Sie dreimal mit PBS.
   5. Pipette 15 μL Antifade-Medium mit DAPI auf den Glasträgern. Befestigen Sie die Deckfolien vorsichtig an der Stelle des Montagemediums, sodass die Zellen nach innen zeigen, um Blasen zu minimieren.
   6. Zentriere, sichern und versiegeln Sie die Seiten des Deckblatts mit einer kleinen Menge Klarlack-Nagelemaille an den Seiten. Legen Sie die Objektträger im Dunkeln, damit der Nagelemaille trocknen kann (~10 Min). Lagern Sie die Objektträger im Dunkeln bei 4 °C, bis sie bereit zum Fotografieren sind.
5. Bildgebende Zellen
   1. Bilde alle Objektträger mindestens 10x bei 63× Vergrößerung mit einem Konfokalmikroskop. Detektieren Sie PAR-Brennpunkte mit dem 488-nm-Laser und Nuklearfärbung (DAPI) mit dem 405-nm-Laser (siehe zum Beispiel Abbildung 2).
6. Analyse von konfokalen Bildern
   1. Erstellen Sie eine Textdatei mit folgendem Text und nennen Sie sie "LivePAR_Macro". Dieses Makro ermöglicht die "automatische" Quantifizierung von PAR-Foci in den Kerne der LivePAR-exprimierenden Zellen:
      macro "DAPI positive Färbung [1]" {
      tit=getTitle();
      run("Duplikat...", "title=DAPI-Duplikat");
      selectWindow("DAPI")
      run("8-Bit");
      run("Split Channels")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      close();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      run("Gaussian Blur...", "Sigma=3");
      setAutoThreshold("Default");
      run("Make Binary");
      run("Invert")
      run("Löcher füllen")
      run("Wasserscheide")
      run("Analyze Particles...", "size=50.00-Infinity circularity=0.00-1.00 show=Outlines, add, exuse, include in_situ");
      umbenennen("DAPI_"+tit);
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      close();
      }
      macro "PAR [2]" {
      setBatchMode (wahr);
      run("8-Bit");
      t=getTitle();
      run("Duplikat...", "title=GB1 duplikat");
      run("Duplikat...", "title=GB20 duplikat");
      selectWindow("GB20")
      run("Gaussian Blur...", "Radius=20 Stack");
      selectWindow("GB1");
      run("Gaussian Blur...", "Radius=1 Stack");
      imageCalculator("Subtract create stack", "GB1", "GB20");
      selectWindow("GB1");
      close();
      selectWindow ("GB20");
      close();
      selectWindow("Ergebnis von GB1");
      umbenennen("Blank_GB1-GB20_"+t);
      title = getTitle();
      run("Split Channels")
      selectWindow("C1-"+Titel);
      close();
      selectWindow("C2-"+title);
      setThreshold(90,255) //der Wert 90 kann geändert werden, um experimentelle Variabilität zu berücksichtigen
      run("Analyze Particles...", "size=0.00-200 circularity=0.00-1.00 show=Masken fassen zusammen");
      nahe ("C2-"+Titel);
      selectWindow("Maske von C2-"+Titel);
      schließen ();
      setBatchMode (falsch);
      }
   2. Lade ImageJ herunter und installiere es auf dem Computer (https://imagej.net/ij/download.html).
   3. Öffnen Sie ImageJ und installieren Sie das Makro (Textdatei: LivePAR_Macro) durch Klicken auf Plugins | Makros | Installieren.
   4. Öffne alle konfokalen Dateien in ImageJ und speichere sie als *.tif-Dateien, um die Originaldateien zu erhalten.
   5. Öffnen Sie ein Tabellenkalkulationsdokument und speichern Sie es als [datum]_[Zelllinie]_Foci Analyse.
   6. Analysiere jeweils eine *.tif Datei. Drücken Sie 1 , um die Kerne zu finden; wenn ein Fenster mit dem Titel ROI Manager geöffnet wird, wählen Sie alle Einträge im Fenster aus und drücken Sie auf Hinzufügen , um den Kernbereich über das Originalbild zu legen. Löschen Sie falsch identifizierte Kerne. Zeichnen Sie den Kern mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug und drücken Sie 2 , um die PAR-Fokuspunkte zu quantifizieren.
      HINWEIS: Schließen Sie keine Kerne ein, die nicht vollständig innerhalb des Rahmens liegen.
   7. Wählen Sie jeden Kern im ROI-Manager einzeln aus und drücken Sie 2. Eine Zählung wird angezeigt, die die Anzahl der Brennpunkte im ausgewählten Kern angibt. Sobald die Fokuspunkte in allen Kernen der Datei markiert sind, kopieren und fügen Sie die Informationen in das offene Tabellenkalkulationsdokument ein.
   8. Wiederhole die Schritte 3.6.6 und 3.6.7 mit allen *.tif-Dateien.
   9. Zeichnen Sie PAR-Fokuspunkte pro Kern in der bevorzugten Software auf (siehe Abbildung 3).

Results

Zellen, die die LivePAR-Sonde exprimieren, können durch die Produktion eines Lentivirus erzeugt werden, das das RNF146(100-182)-EGFP-Fusionsprotein kodiert (Abbildung 1A). Zellen können nach vorübergehender Expression bis zu zwei Wochen nach der Transduktion oder als stabile Zelllinien nach Selektion in Hygromycin untersucht werden (Abbildung 1B)¹. Nach der Genotoxinbehandlung können DNA-schädigende PAR-F...

Discussion

Der LivePAR-Assay wurde entwickelt, um Stellen mit nuklearer genomischer DNA-Schädigung nachzuweisen, an denen PARP1/PARP2 aktiv PAR-Ketten synthetisiert. Um dies zu erreichen, wurde ein Fragment von RNF146, das die WWE-Domäne kodiert (Aminosäuren 100–182), mit EGFP 1,2,3,37 fusioniert. Zusätzliche von uns beschriebene PAR-Sonden kodieren EGFP, die mit den Amin...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenzien, Chemikalien und Peptide
0,45 &Mikro; m Durapore Steriflip-Filter	Sigma-Aldrich	Katze# SE1M003M00
20 x 20 mm Mikroskopabdeckungen	Thermo Fisher Scientific	Kat# 22-170-371
Aceton	Thermo Fisher Scientific	Katze# A18-1
Zellkulturschüsseln, 100 mm	VWR	Kat# 25382-166
Zellkulturschüsseln, 60 mm	Fisher Scientific	Katze# 430166
Zellkulturplatten, 6-Well.	VWR	Kat # 62406-161
Kryovialen, 2 ml	VWR	Kat# 89499-722
Diethylether	Thermo Fisher Scientific	Kat# 60-29-7
Dimethylsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	Katze# BP231-1
Einweg-Sterile Filter, 0,45 & Mikro; m	Sigma-Aldrich	Katze# SE1M003M00
DMEM	Corning	Kat# 15-017-CV
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	Kat# 2701
Glasmikroskop-Objektträger	Thermo Fisher Scientific	Kat# 12-544-4
Hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum	Atlanta Biologika	Katze# S11150
Salzsäure	Thermo Fisher Scientific	Cat# A144-212
Hygromycin	Thermo Fisher Scientific	Katze# 10687010
Große Kim-Feuchttücher	Kimberly-Clark	Kat# 34256
Lenti-X GoStix Plus Kit	Takara	Kat# 631280
Methanol	Thermo Fisher Scientific	Kat# A452SK-4
MNNG	Molport	Katze# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihydroxy-5-(Hydroxymethyl) Tetrahydrofuran-2-yl]-4H-Pyridin-3-Carboxamid)	Marie Migaud or  NuChem Sciences Inc
PARG-Inhibitor (PDD00017273)	Sigma-Aldrich	Katze# SML1781
PARPi-Inhibitor (Veliparib, ABT-888)	MedChemExpress	Katze# HY-10129
Penicillin/Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Polybrene	Sigma-Aldrich	Kat# TR-1003-G
tBuOOH	Thermo Fisher Scientific	Katze# 180345000
TransIT-x2 (Transfektionsreagenz)	Mirus	Katze# MIR-6006
Triton-X100	VWR	Kat# 0694
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	Kat# 25200-056
Vectashield (H-1000) Anti-Fade-Montagemedium	Thermo Fisher Scientific	Katze# NC1695563
Zelllinien
293-FT	Thermo Fisher Scientific	Kat# R70007
(abgeleitet von menschlichen embryonalen Nierenzellen, die mit dem SV40-Big-T-Antigen transformiert wurden)	Thermo Fisher Scientific	Kat# R70007
LN428	Großzügiges Geschenk von	N/A
(Menschliche Glioblastom-Tumorzelllinie)	Dr. Ian Pollack (Universität Pittsburgh)	N/A
RPE-1	ATCC	Kat# CRL-4000
(menschliche hTERT-immortalisierte retinale Pigmentepithelzellen)	ATCC	Kat# CRL-4000
U2OS	ATCC	Katze# HTB-96
(Zelllinie des humanen Osteosarkoms)	ATCC	Katze# HTB-96
Rekombinante DNA
pMDLg/pRRE	Laborbestand #253	Addgene, Kat# 12251
pRSV-Rev	Laborbestand # 254	Addgene, Kat# 12253
pMD2.G	Laborbestand #252	Addgene, Kat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR ist die WWE-Domäne von RNF146, Aminosäurereste 100-182, mit EGFP verschmolzen; enthält eine Hygromycin-Resistenzkassette)	Labormaterial# 1727	Addgene, Cat# 176063
Software and Algorithms
Adobe Illustrator (zur Erstellung von Abbildungen)	Adobe Systems	Version 2024
GraphPad-Prisma	GraphPad	Version 10.5.0  (Mac OS X)
ImageJ	NIH	https://imagej.net/ij/download.html