Methodenartikel

Ein optimiertes Protokoll für Candida albicans-Infektion in Schmidtea mediterranea zur Untersuchung der Pilzpathogenese und der Wirtsabwehr

DOI:

10.3791/70500

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17. April 2026

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1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Health Sciences Research Institute, University of California, Merced, 4Center for Cellular and Biomolecular Machines, University of California, Merced

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet einen optimierten, detaillierten Leitfaden zur Verwendung des Planarius Schmidtea mediterranea als Modellsystem zur Untersuchung der Wirts-Pathogen-Interaktionen während einer Pilzinfektion. Die Methode baut auf dem vorherigen Verfahren zur Infektion von Planarians mit dem menschlichen Pilzkrankheitserreger Candida albicans auf und bietet detaillierte Anleitungen zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit und experimentellen Konsistenz.

Zusammenfassung

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Candida albicans ist ein häufiger opportunistischer Pilzpathogen, der die meisten Menschen asymptomatisch besiedelt. Obwohl sie typischerweise eine gutartige Kommensal ist, kann Dysbiose durch Antibiotikaeinfuhr, Immunfunktionsstörungen oder Störung der Epithelbarriere Pilzüberwucherung und Infektionen auslösen, die von oberflächlichen Schleimhauterkrankungen bis hin zu lebensbedrohlicher systemischer Candidiasis reichen. Neue präklinische Infektionsmodelle sind erforderlich, um die Pathogenese von C. albicans in vivo über unterschiedliche Infektionsstadien und mit unterschiedlich messbaren Wirtsergebnissen zu analysieren. Der Planarian Schmidtea mediterranea wurde zuvor als wirbelloser Wirt zur Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen während der C. albicans-Infektion etabliert. S. mediterranea ist vollständig auf konservierte angeborene Immunmechanismen angewiesen, die in der Lage sind, Infektionen mit pathogenen Mikroorganismen, einschließlich Bakterien und Pilzen, zu überwinden. Die bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit der Planarier und die zugänglichen Stammzellpopulationen machen diesen Organismus zu einem handhabbaren Modell zur Analyse früher Immunantworten, Gewebereparatur und Pathogenbeseitigung in vivo. Dieses Modell unterstützt die gleichzeitige Analyse der pilzvirulenten Aktivität und der transkriptionellen Reaktionen des Wirts und liefert wertvolle Einblicke in die Infektionsdynamik. Hier wurde ein aktualisiertes Protokoll mit detaillierten Modifikationen, standardisierten Verfahren und optimierten Schritten zur Infektion von S. mediterranea mit C. albicans vorgestellt, das darauf ausgelegt ist, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und systematische Studien zur Pilzpathogenese und Wirtsabwehr zu ermöglichen.

Einleitung

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Candida albicans ist ein häufiger opportunistischer Pilzpathogen, der asymptomatisch 50–70 % der Menschen besiedelt. Typischerweise kann ein harmloser Kommensal, C. albicans, unter Bedingungen wie Mikrobiota-Ungleichgewicht, Antibiotikaeinfuhr, Immunsuppression, Störung der Epithelbarriere oder dem Vorhandensein von medizinischen Geräten überwachsen, was zu Krankheiten von oberflächlichen Schleimhautinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen systemischen Candidiasis 4,5 führt. Bei immungeschwächten Personen – einschließlich HIV/AIDS, Patienten mit Chemotherapie oder immunsuppressiven Therapien, Personen mit chronischen Erkrankungen oder Intensivstationen – können die Sterblichkeitsraten 70 % übersteigen, was die erhebliche öffentliche Gesundheitsbelastung durch invasive Candidiasis 6,7,8 unterstreicht. Weltweit betreffen invasive Pilzinfektionen jährlich mehr als 6,5 Millionen Menschen, wobei die direkten Gesundheitskosten allein in den Vereinigten Staaten jährlich 8 Milliarden Dollar für Candida-bezogene Infektionen bei 9,10 Dollar betragen. Trotz verfügbarer antimykotischer Behandlungen sind die Morbiditäts- und Sterblichkeitsraten im Zusammenhang mit C. albicans-Infektionen seit Jahrzehnten weitgehend unverändert geblieben, was den dringenden Bedarf unterstreicht, die Wirts-Pathogen-Interaktionen bei Pilzerkrankungen besser zu verstehen.

C. albicans verwendet ein vielfältiges Repertoire an Virulenzfaktoren, die Kolonisierung, Persistenz und Pathogenese in verschiedenen Wirtsumgebungen unterstützen. Dazu gehören Adhäsion an Wirtsgewebe, Immunausweichung, Zellwandremodellierung, Sekretion hydrolytischer Enzyme, morphologische Plastizität und Biofilmbildung 11,12,13,14,15,16. Zusammen ermöglichen diese Eigenschaften C. albicans, sich an verschiedene Wirtsnischen anzupassen, Immunantworten zu modulieren und Antimykotentherapienzu widerstehen. Die Aufklärung, wie diese Prozesse die Infektionsergebnisse beeinflussen – einschließlich Morbidität, Mortalität und Krankheitserregerbeseitigung des Wirts – ist entscheidend, um wirksamere präventive und therapeutische Strategien zu entwickeln.

Um diese Wirts-Pathogen-Dynamik zu untersuchen, entwickelten wir ein Modellsystem mit dem planaren Schmidtea mediterranea als Wirt 22,23,24. Dieses Modell dient als vielseitige Plattform zur Untersuchung der multisystemischen Wirtsreaktion auf Pilzinfektionen und nutzt eine auf dem Einweichen basierende Infektionsmethode, die eine synchrone Exposition von Tieren gegenüber C. albicans ermöglicht. Der folgende Abschnitt stellt aktualisierte Schritt-für-Schritt-Verfahren vor, die dieses Protokoll verfeinern, die Reproduzierbarkeit verbessern und eine konsistente Umsetzung in Laboren ermöglichen.

Planarier sind freilebende wirbellose Tiere mit außergewöhnlicher Regenerationsfähigkeit, die in der Lage sind, Gewebe, das durch Verletzungen oder Infektionen verloren ging, schnellzu ersetzen. Ihnen fehlt ein adaptives Immunsystem und sie verlassen sich vollständig auf konservierte angeborene Abwehrmechanismen – darunter Mustererkennungsrezeptoren, antimikrobielle Peptide, Schleimsekretion und phagozytische Zellen –, um bakterielle und pilzbedingte Krankheitserreger innerhalb der Tage 26,27,28,29 zu beseitigen. Da die angeborene Immunität die erste Verteidigungslinie bei Eukaryoten darstellt und außerhalb der Säugetiersystemenoch wenig erforscht ist, bieten Planarien die Möglichkeit, diese Prozesse in vivo mit zellulärer und molekularer Auflösung zu untersuchen. Ihre Regenerationsfähigkeit wird durch adulte pluripotente Stammzellen, sogenannte Neoblasten, angetrieben, die etwa 30 % der adulten Zellen ausmachen und zur Genesung nach einerInfektion beitragen. Diese Merkmale machen S. mediterranea zu einem leistungsstarken Modell zur Analyse der Virulenz von Krankheitserregern und der Wirtsabwehr auf genetischer, zellulärer, Gewebe- und Organismenebene, sodass wir Fragen klären können, die oft schwer mit traditionellen Säugetiersystemen zu untersuchen sind.

Darüber hinaus unterstützen die geringe Größe der Planarier (typischerweise einige Millimeter Länge), die niedrigen Kosten und die einfache Wartung groß angelegteExperimente 31 und vermeiden dabei die finanziellen, ethischen und regulatorischen Einschränkungen, die Wirbeltiermodellen innewohnen. Wie C. albicans ist S. mediterranea genomisch handhabbar, mit einem vollständig sequenzierten und annotierten Genom und unterstützt fortschrittliche molekulare und zelluläre Techniken – darunter transkriptionelle Profilierung, hochauflösende Immunhistochemie und Histologie sowie robuste RNA-Interferenz (RNAi)32,33,34,35,36,37,38. Diese Werkzeuge ermöglichen eine parallele Analyse der Wirts- und Erregerreaktionen während der Infektion.

Mehrere alternative präklinische Modelle wurden zur Untersuchung von Pilzinfektionen verwendet. Wirbellose Wirte wie Galleria mellonella (Wachsmotte), Caenorhabditis elegans (Spulwurm) und Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) sowie das Wirbeltier Danio rerio (Zebrafisch) bieten jeweils unterschiedliche experimentelle Vorteile, haben aber auch bemerkenswerte Einschränkungen. Diese Systeme verlassen sich oft auf das Überleben als primären Endpunkt, da Infektionen schnell den Wirttod verursachen und so eine detaillierte Bewertung von Morbidität, Genesung und multisystemischen Reaktionen verhindern – Merkmale, die das planarianische Modell leicht erfasst.

Säugetiermodelle wie Mus musculus (Maus), Rattus norvegicus (Ratte), Oryctolagus cuniculus (Kaninchen) und Cavia porcellus (Meerschweinchen) wiederholen die menschliche Physiologie näher, sind jedoch durch hohe Kosten, kleine Kohortengrößen, ethische und regulatorische Anforderungen sowie die Herausforderung, angeborene von adaptiven Immunreaktionen zu unterscheiden, eingeschränkt. Darüber hinaus konzentrierte sich jahrzehntelange Forschung zur Pilzpathogenese bei Mäusen überwiegend auf eine systemische Infektion im späten Stadium, wobei frühe Ereignisse wie die Zerstörung der Epithelbarriere und das Überwuchern der Schleimhaut – die häufigsten Initiationswege der Pilzkrankheit beim Menschen – oft übersehen wurden.

Die Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen ist daher unerlässlich, um die biologischen Prozesse zu verstehen, die der Pilzvirulenz, der Wirtsabwehr und dem Krankheitsverlauf zugrunde liegen. Invasive Pilzinfektionen stellen eine zunehmende globale Bedrohung dar, da mehrere Arten nun Resistenzen gegen alle wichtigen Antipilzmedikamentenklassen zeigen. Schätzungsweise mehr als 1 Milliarde Menschen sind von Pilzinfektionen betroffen, und Faktoren wie Klimawandel, weitverbreiteter Einsatz von antimikrobiellen Medikamenten und die zunehmende Zahl immungeschwächter Personen beschleunigen das Entstehen von antimykotioresistenten Krankheitserregern 47,48,49,50. Das Verständnis, wie pathogene Pilze ihre Wirte kolonisieren und mit ihnen interagieren, ist entscheidend für die Entwicklung neuer präventiver und therapeutischer Strategien.

Im Folgenden wird ein überarbeitetes und standardisiertes systemisches Infektionsprotokoll für Interaktionen von S. mediterranea-C. albicans beschrieben, das darauf ausgelegt ist, die Reproduzierbarkeit zu fördern und eine systematische Untersuchung der Pilzpathogenese und der Abwehrmechanismen des Wirts zu ermöglichen. Das ursprüngliche Protokoll wurde in früheren Veröffentlichungen 22,23,24 befolgt. Tabelle 1 fasst die wichtigsten Aktualisierungen zusammen, die in dieser überarbeiteten Version enthalten sind, darunter Verbesserungen der Pilzimpfungsverfahren, reduzierte Brunnenvolumen, definierte Einschlusskriterien für Tiere, Bestimmung der infektiösen und tödlichen Dosierungen sowie aktualisierte Empfehlungen zur Tierhaltung. Dieser Workflow bietet detaillierte Hinweise zur Kultivierung von C. albicans, zur Infektion von Planarians durch Einweichexposition sowie zur Bewertung der pilzbedingten Virulenz und Wirtsreaktionen anhand qualitativer und quantitativer Messungen unter symptomatischen und tödlichen Dosierungsbedingungen (Abbildung 1). Die hier vorgestellten optimierten Verfahren berücksichtigen empirisch identifizierte Variablen, die als Schlüsselfaktoren für Infektionsdynamik und Wirtsergebnisse identifiziert wurden, wodurch die Reproduzierbarkeit verbessert und eine systematische Bewertung der Wirt-Pathogen-Interaktionen ermöglicht wird.

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Protokoll

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Dieses Protokoll baut auf den vorherigen Methoden22, 23, 24 auf und etabliert klare, standardisierte Verfahren, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern und eine systematische Untersuchung der Pilzpathogenese und der Wirtsreaktionen im südlichen Mittelmeer zu ermöglichen. Zu den wichtigsten Protokollverbesserungen gehören vordefinierte Ein- und Ausschlusskriterien für Tiere, standardisierte mikrobielle Präparation und umfassende Bewertung der Endpunkte des Wirts.

Alle Verfahren müssen mit geeigneten sterilen und aseptischen Biosicherheitstechniken der Stufe 2 durchgeführt werden. Standard-Laborschutzausrüstung (PSA), einschließlich Handschuhen, Laborkittel und geschlossenen Schuhen, sollte jederzeit getragen werden. Verfahren mit dem Planarian S. mediterranea wurden gemäß institutionellen Richtlinien für den ethischen Umgang mit Wirbellosen durchgeführt.

Alle Protokollverbesserungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Alle Reagenzien, kritische Geräte sowie Medien, Puffer und Immunfärbungsrezepte sind in der Materialtabelle und Tabelle 2 aufgeführt.
HINWEIS: Alle Verfahren mit dem wirbellosen Tiermodell S. mediterranea sollten durchgeführt werden, um die höchsten Tierschutzstandards sicherzustellen. S. mediterranea sollte unter optimierten Bedingungen untergebracht werden, die natürliche Lebensräume simulieren. Die Experimente sollten so gestaltet werden, dass potenzielle Schmerzen oder Belastungen minimiert werden, um eine ethische Behandlung während der gesamten Studie sicherzustellen.

1. Pilzkultivierung

  1. Informationen zum C. albicans-Stamm
    1. Der Standard-Laborstamm C. albicans SN25051 wurde als Wildtyp-Stamm für alle Experimente verwendet und ist öffentlich im Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/) verfügbar. SN250 stammt aus dem klinischen Isolat SC5314, das ursprünglich aus einer Blutkultur eines Patienten mit disseminierter Candidiasis52 gewonnen wurde.
    2. C. albicans-Stämme werden als 25%ige Glycerolbestände bei −80°C aufbewahrt.
  2. Kultivierung von C. albicans-Stämmen zur Infektion
    1. Streifen von kryogenem Material
      1. Mit einem sterilen Applikator wird die gewünschte Sorte von −80°C Fond auf Agarplatten (YPD) (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Glukose; pH 6,8) gestrichen.
      2. Inkubieren Sie statisch bei 30°C für 72 Stunden.
  3. Vorbereitung von Übernachtkulturen
    1. Impfen Sie eine einzelne Kolonie in 4 mL flüssiges YPD in sterilen Borosilikat-Glaskulturröhrchen (18 mm × 150 mm) mit einem sterilen Applikatorstab.
    2. Fügen Sie unter identischen Bedingungen ein Negativkontrollrohr mit unimpftem YPD ein.
    3. Die Röhren locker abdecken, um die Belüftung zu ermöglichen, und über Nacht (16 H) bei 30 °C mit Schütteln bei 220 U/min (Orbital) in einem Schüttelinkubator inkubieren.
      HINWEIS: Wenn mikrobielles Wachstum in der negativen Kontrolle auftritt, brechen Sie das Experiment ab und beginnen Sie mit neuem Medium und steriler Technik neu.
  4. Entnahme- und Waschzellen
    1. Mit aseptischer Technik werden Kulturen in markierte 15-mL-Zentrifugenröhren übertragen.
    2. Zentrifugiere Kulturen für 5 Minuten bei ~3.000 × g , um die Zellen zu pelletieren.
    3. Entferne vorsichtig den YPD-Überschussmittel, ohne das Pellet zu stören.
    4. Suspendieren Sie das Pellet in planarischem Wasser (siehe Tabelle 2 zur Zusammensetzung) in einem Volumen, das dem verwendeten YPD entspricht.
    5. Gründlich mischen durch Vortexen.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2-1.4.4 noch zweimal, um das Wachstumsmedium vollständig zu entfernen.
    7. Nach der letzten Wäsche wird das Zellpellet durch Vortex in frischem planarialem Wasser wieder suspendiert.
  5. Quantifizierung der Zellkonzentration von C. albicans
    1. Verdünnung für die OD-Messung
      1. Bereiten Sie drei sterile 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren mit einer Verdünnung von 1:20 (50 μL Kultur + 950 μL planarisches Wasser) oder einem alternativen gewählten Verdünnungsfaktor vor. Gründlich mischen.
      2. Bereiten Sie ein Leerrohr mit 1000 μL planarialem Wasser vor.
    2. Spektrophotometrie
      1. Stellen Sie das Spektrophotometer so ein, dass es die optische Dichte bei 600 nm (OD600) misst.
      2. Blende das Spektrophotometer mit planarischem Wasser aus.
      3. Messen Sie OD600 für jede verdünnte Stichprobe und Datensatzwerte.
      4. Die drei Messwerte werden gemittelt und mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert, um den OD600 der Bestandskultur zu bestimmen. Konvertiere OD600 in Zellkonzentration.
        HINWEIS: Der optische Dichte-Umwandlungsfaktor sollte empirisch für jedes Spektrophotometer bestimmt werden. Basierend auf der verwendeten spezifischen Instrumentierung entspricht ein OD600 von 1 ungefähr 2 ×107 C. albicans-Zellen /mL53.
  6. Bestimmung experimenteller Inokulumkonzentrationen
    1. Bereiten Sie für jede experimentelle Bedingung die gewünschte Inokulumkonzentration vor.
      HINWEIS: Führen Sie mindestens drei biologische Replikationen durch, um die effektive Dosis für die Planarian-Kolonie zu bestimmen, insbesondere bei infektiösen oder tödlichen Endpunkten. Eine repräsentative Berechnung zur Herstellung infektiöser und tödlicher Inokulumkonzentrationen ist in Supplementary File 1 bereitgestellt.

2. Planarische Arten und Pflege

  1. Planarische Arten und Pflege
    1. Verwenden Sie für alle Experimente die CIW4-asexuelle klonale Linie der planaren S. mediterranea .
    2. Planarian-Kolonien in klaren, lebensmitteltauglichen Kunststoffbehältern mit 1.500–2.000 mL 1× planarischem Wasser aufrechterhalten.
    3. Bewahren Sie Behälter bei 20 °C im Dunkeln auf, mit locker geschlossenen Deckeln, um den Gasaustausch zu ermöglichen.
    4. Behandeln Sie Planarien nicht mit Antibiotika.
  2. Koloniepflege und Nahrungsaufnahme
    1. Füttere Kolonien einmal pro Woche frisches, abgeseibtes Rinderleberpüree.
    2. Mach Behälter zweimal pro Woche sauber.
    3. Halten Sie die Planariandichte bei 200–400 Tieren pro Behälter aufrecht. Frühere Arbeiten zeigen detaillierte Verfahren zur Kolonievorbereitung und langfristigen Pflege31.
  3. Prä-experimentelle Konditionierung
    1. Vor der experimentellen Infektion sollten Planarians 7–12 Tage lang ausgehungert werden, um die Stoffwechsel- und Größenbedingungen zu standardisieren.
    2. Verwenden Sie Gruppen von 5–10 Tieren pro Brunnen für jede experimentelle Bedingung. Stellen Sie unter allen Bedingungen eine gleiche Anzahl von Tieren sicher, einschließlich positiver und negativer Kontrollen.
  4. Tiergrößenauswahl
    1. Ausgewählte Planarien von etwa 5 mm Länge, was ~5 × 105 Wirtszellen proTier entspricht, 54.
    2. Vermeiden Sie die Verwendung von Planarien, die kleiner als 5 mm sind, da Tiere dieser Größe Exemplare mit Blastemas oder unvollständiger Entwicklung enthalten können, die inkonsistente Ergebnisse erzielen können.
    3. Vermeiden Sie die Verwendung von Planarien, die größer als 5 mm sind, da größere Tiere weniger für fluoreszenz-Immunfärbung geeignet sind.
    4. Verwenden Sie Planarians von etwa 5 mm Länge bei der Festlegung der infektiösen Dosis (ID50) und der Letaldosis (LD50).
      HINWEIS: Um eine einheitliche Größenauswahl zu erleichtern, drucken Sie ein 5 mm × 5 mm großes Referenzgitter und legen Sie es in eine Kunststoffhülle unter dem transparenten Planariumsbehälter. Stellen Sie sicher, dass Planarien vollständig ausgefahren sind, bevor Sie die Länge messen.
  5. Gesundheit und Einschlusskriterien
    1. KRITISCHER SCHRITT: Untersuchen Sie alle Planarien vor der Anwendung unter einem Stereomikroskop.
    2. Tiere mit sichtbaren Schäden oder Verletzungen ausschließen, einschließlich der folgenden Bedingungen:
      1. Vorkommen von Blastemas (Gewebe ohne Pigmentierung) oder unvollständiger Pigmententwicklung.
      2. Abnormale Pigmentierung, wie deutlich dunklere Bereiche.
      3. Fehlendes oder beschädigtes Gewebe.
      4. Läsionen oder Narben.
      5. Offene Wunden.
      6. Morphologische Auffälligkeiten oder Deformitäten.
      7. Jede chronische oder nicht heilende Erkrankung.
    3. Tiere mit Entwicklungsstörungen ausschließen.
      1. Gespaltene oder doppelte Kopf- oder Schwanzregionen.
      2. Verformte oder asymmetrische Körpermorphologie.
      3. Falsche Anzahl von Photorezeptoren (nur ein beidseitiges Paar ist akzeptabel).
      4. Ungewöhnlich positionierten Pharynx.
      5. Defekte Ziliation, die zu beeinträchtigter Beweglichkeit oder unregelmäßigem Gleitverhalten führt.
    4. Beziehen Sie nur Tiere ein, die etwa 5 mm lang, vollständig entwickelt und frei von sichtbaren Verletzungen oder Auffälligkeiten sind.
  6. Plattenvorbereitung
    1. Übertragen gesunde Planaria, die alle Einschlusskriterien erfüllen, in 2 ml frisches planarisches Wasser pro Brunnen in einer nicht-gewebskulturbehandelten, 6-Well-Polystyrolplatte.
      HINWEIS: Tiere einen Tag vor der Infektion übertragen, um die Anpassung an die neue Umgebung und Populationsdichte zu ermöglichen.
    2. Weisen Sie Bohrlöcher für die folgenden experimentellen Bedingungen zu:
      1. Negative Kontrollen: uninfizierte oder künstlich behandelte Tiere.
      2. Positive Kontrollen: Tiere, die mit Wildtyp C. albicans infiziert sind.
    3. Entfernen und ersetzen Sie das gesamte Wasser durch 2 ml frisches planarianisches Wasser, um eine Gleichmäßigkeit über die Brunnen zu gewährleisten.

3. Infektionsaufbau

  1. Impfung vorbereiten (siehe Supplementary File 1 für die Beispielberechnung)
    1. Mit der aseptischen Technik entfernen Sie vorsichtig das gesamte Wasser von der 6-Well-Platte, indem Sie die Platte zum Benutzer hin kippen.
    2. Addiere das berechnete Volumen des planarischen Wassers zu jedem Brunnen.
      HINWEIS: Nehmen Sie einen Brunnen nach dem anderen, um ein Austrocknen der Tiere zu verhindern.
    3. Fügen Sie das berechnete Volumen der C. albicans-Kultur zu jedem Brunnen hinzu.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, Tiere über längere Zeit der Luft auszusetzen, da das Austrocknen Stress verursachen und die Infektionsverläufe beeinflussen kann.
  2. Experimentelle Platteninkubationsbedingungen
    1. Stelle die inokulierte 6-Well-Platte an einen dunklen, statischen Ort bei Raumtemperatur.
    2. Halte Versuchsplatten in einem separaten Bereich von uninfizierten Planarian-Kolonien auf, um Kreuzkontamination zu verhindern.
    3. Notieren Sie Datum und Uhrzeit der Impfung (angegeben als Zeit 0 h).
      HINWEIS: Vermeiden Sie stark frequentierte oder vibrationsanfällige Bereiche (z. B. Schubladen, Instrumentenoberflächen oder belebte Arbeitsflächen), da Bewegung Tiere belasten und die Ergebnisse verschlechtern kann.
    4. Inkubieren Sie Planarien mit C. albicans bis zu 72 Stunden lang, abhängig vom gewünschten Endpunkt.
  3. Resuspendierung von Pilzzellen
    1. Zu jedem Zeitpunkt werden gesetzte C. albicans-Zellen sanft wieder aufgehängt, ohne die Planarianer zu stören.
      HINWEIS: Zeit (Stunden [h] oder Tage [d] nach der Infektion) bezeichnet die vergangene Zeit seit der ersten Exposition (Zeit 0).
    2. 24 Stunden nach der Infektion (HPI)
      1. Mit einer sterilen 3-mL-Transferpipette neigen Sie die Platte leicht zum Benutzer hin.
      2. Saugen Sie das planarische Wasser ab und geben Sie es vorsichtig in einen Bereich des Brunnens, der frei von Tieren ist, um die abgesetzte Pilzschicht zu mischen.
      3. Wiederholen Sie diesen Schritt 5–10 Mal pro Bohrloch, um die abgesetzte Pilzschicht aufzulösen und direkten Kontakt mit Planarien zu vermeiden.
      4. Beobachten Sie die Ablagerung von Pilzen vor einem dunklen Hintergrund für die beste Sichtbarkeit vor und nach den Wiederschwenkstufen.
      5. Nicht infizierte Kontrollbrunnen unter identischen Bedingungen wieder suspendieren.
    3. Mit 48 PS
      1. Wiederholen Sie das oben beschriebene Resuspensionsverfahren.
      2. Führen Sie alle Umschwemmungsschritte innerhalb ± 1 Stunde nach dem festgelegten Zeitpunkt aus.
  4. Ende der Belichtung (72 hpi)
    1. Bei 72 hpi werden die Planarier vorsichtig auf eine neue 6-Well-Platte übertragen, die pro Bohrloch 2 ml frisches planarisches Wasser enthält.
    2. Minimieren Sie den Transfer von Pilzkulturen durch die Verwendung des kleinstmöglichen Flüssigkeitsvolumens.
    3. Sobald die Tiere versetzt sind, entfernen Sie das gesamte Wasser und ersetzen Sie es durch frisches planarisches Wasser.
      HINWEIS: Behandeln Sie Tiere und Gewebefragmente vorsichtig, um mechanische Verletzungen oder zusätzlichen Stress zu vermeiden.

4. Bewertung des Endpunkts des Wirts

  1. Aufzeichnung von Host-Ergebnissen
    1. Beginnen Sie mit der Bewertung der Wirtsergebnisse 1 Tag nach der Infektion (DPI) und setzen Sie täglich fort, bis zum gewünschten experimentellen Endpunkt.
    2. Quantifizieren Sie den Wirtsschaden mit dem standardisierten 0–3-Bewertungssystem (Abbildung 2).
      Punktzahl 0: Keine Veränderung von nicht infizierten Kontrollpersonen (gesund, asymptomatisch).
      Punktzahl 1: Leichte Symptome.
      Punktzahl 2: Schwere Symptome.
      Punktzahl 3: Tod.
  2. Kriterien für die Bewertung der Wirtssymptome
    1. Punktzahl 0 (Asymptomatisch):
      1. Identifizieren Sie Tiere, die normale Morphologie, Pigmentierung, Verhalten und Reaktionsfähigkeit zeigen, ohne sichtbare Veränderungen im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen.
    2. Punktzahl 1 (Leicht):
      Weisen Sie einen milden Wert zu, wenn mindestens eines der folgenden Symptome im Vergleich zu asymptomatischen Kontrollgruppen beobachtet wird.
      1. Verringerte Bewegungsgeschwindigkeit oder abnormales Gleitverhalten.
      2. Teilweise oder vollständiger Verlust der phototaktischen Reaktion.
      3. Anhaltende oder wiederholte Körperkontraktionen.
      4. Abnormale oder nicht gleichmäßige Pigmentierung (hellere oder dunklere Bereiche).
      5. Rückschritt des Kopf- oder Schwanzgewebes.
    3. Punktzahl 2 (Schwer):
      Setzen Sie eine schwere Punktzahl zu, wenn eines oder mehrere der folgenden Symptome auftreten, während die Tiere noch am Leben sind.
      1. Augenfilm oder Verlust eines oder beider Augen.
      2. Vollständiger Kopfverlust oder deutliche vordere Gewebeschädigung.
      3. Großer Gewebeverlust im präpharyngealen Bereich.
      4. Fragmentierung in mehrere Körperregionen (Kopf-, Pharyngeal- oder hintere Segmente).
      5. Offene Wunden mit oder ohne Schleimsekret oder innerem Leck.
      6. Teilweise Gewebelyse führt zu einem Verlust der strukturellen Integrität.
      7. "C-förmige" Körperhaltung, Lähmung oder schwere Beweglichkeitsbeeinträchtigung.
    4. Punktzahl 3 (Tod):
      Identifizieren Sie den Tod anhand eines oder mehrerer der folgenden Kriterien.
      1. Vollständige Gewebe- oder Ganztier-Lyse.
      2. Totaler Verlust der Reaktion auf Reize.
      3. Versäumnis, sich zu erholen oder zu regenerieren.
        HINWEIS: Abbildung 2 bietet repräsentative Bilder und definierende Merkmale für jeden Score, um eine konsistente Klassifikation des Wirt-Phänotyps sicherzustellen.

5. Bestimmung des Überlebens des Wirts nach Pilzexposition

  1. Bei 3 dpi werden die Planarien vorsichtig auf eine neue 6-Well-Platte mit 2 ml frischem planarischem Wasser pro Bohrloch übertragen, wodurch der Transfer der restlichen Pilzkultur vermieden wird.
  2. Beobachten Sie Tiere mittels Lichtmikroskopie (≥ 10x-Objektiv).
  3. Erfassen Sie die Ergebnisse des Hosts mit dem standardisierten Bewertungsblatt, das in Supplementary File 2 bereitgestellt wird.
  4. Bestimmung lebender Tiere
    1. Identifizieren Sie lebende Tiere anhand eines oder mehrerer der folgenden Kriterien.
      1. Negative Fototaxis.
      2. Reaktion auf sanfte Übertragungs-Pipettenstörung.
      3. Intakte Karosseriestruktur.
      4. Stabile Befestigung an der Platte.
  5. Bestimmung toter Tiere
    1. Identifizieren Sie tote Tiere anhand eines oder mehrerer der folgenden Kriterien.
      1. Vollständige Lyse oder Desintegration (nur Restreste).
      2. Durchsichtiger oder ausgeweideter Körper.
      3. Abwesenheit von Bewegung oder Reaktion auf Reize.
      4. Versäumnis bei der Regeneration (Fehlen von Blastema-Formation).
  6. Entfernung toter Tiere
    1. Entfernen Sie tote Tiere und Ablagerungen erst, nachdem sie unter Mikroskopie die Nichtlebensfähigkeit bestätigt haben.
    2. WICHTIGER SCHRITT: Entfernen Sie tote Tiere sofort, um Kreuzkontamination oder veränderte Überlebensmessungen zu verhindern.
    3. Wenn Rückstände oder Pilzreste zurückbleiben, werden überlebende Tiere erneut auf eine frische Platte mit sauberem Planarialwasser überführt, um das Wiederaussäen oder die Bildung von Biofilmen von C. albicans zu verhindern.
      HINWEIS: Platzieren Sie während der Sichtinspektion 6 Bohrlochplatten auf einen dunklen Hintergrund, um den Kontrast zu verbessern und die Phänotypbewertung zu erleichtern.

6. Bewertung der Pilzbelastung

  1. Quantifizierung der koloniebildenden Einheit (CFU)
    1. Zu den gewünschten Infektionszeitpunkten sammeln Sie Planarians (5–10 Tiere pro Erkrankung und Tag). Fügen Sie abgestimmte uninfizierte/Mock-Kontrollen und Wildtyp-Infizierte Kontrollen ein.
    2. Spülen Sie die Brunnen vorsichtig zweimal mit 2 ml frischem Planarianwasser ab, um die Hintergrundzellen von C. albicans zu entfernen.
    3. Übertragen Sie Planarien in sterile und etikettierte 1,7 mL oder 5,0 mL Mikrozentrifugenröhren und entfernen Sie sämtliches Restwasser.
    4. Gib jedem Rohr 300 μL frisches Planarianwasser hinzu.
    5. Homogenisieren Sie Tiere mit einem sterilen Stößel, bis keine großen Fragmente mehr übrig sind (etwa 30–45 Sekunden).
    6. Führen Sie serielle Verdünnungen des Homogenats durch (z. B. 1:10, 1:100, 1:1000).
    7. Platte 100–200 μL jeder Verdünnung auf YPD-Agarplatten, ergänzt durch jeweils 50 μg/mL Ampicillin, Rifampicin, Streptomycin und Neomycin. Gleichmäßig mit sterilen Glasperlen oder einem sterilen Zellstreuer verteilen.
    8. Lassen Sie die Platten nach dem Anrichten 5–10 Minuten aufrecht auf der Werkbank stehen, damit die Flüssigkeit in den Agar aufgenommen werden kann.
    9. Bereiten Sie für jede Verdünnung und jeden Zustand dreifache Platten vor.
    10. Inkubieren Sie Platten bei 30 °C für 48 Stunden.
    11. Zählen Sie CFUs und multiplizieren Sie sie mit dem Verdünnungsfaktor.
    12. Normalisiere CFU-Werte auf die Anzahl der Planarianer, um durchschnittliche CFUs pro Planarier und Bedingung zu berechnen. Wenn beispielsweise 100 Kolonien bei einer Verdünnung von 10 × aus einem Homogenat von 5 Tieren beobachtet werden, beträgt der berechnete Wert 200 CFUs pro Tier.

7. Immunfluoreszenz-Anti-Candida-Färbung

  1. Allgemeine Überlegungen zur Färbung
    1. Führen Sie alle Schritte mit sanftem Orbitalschaukeln (100–140 U/min) bei Raumtemperatur aus, sofern nicht anders angegeben. Siehe Supplemental File 1 für Details zu Antikörpern und Reagenzienquellen.
      VORSICHT: Formaldehyd, Natriumdodecylsulfat (SDS) und Wasserstoffperoxid sind gefährliche Chemikalien und müssen gemäß institutionellen Sicherheitsvorschriften behandelt werden. Formaldehyd ist giftig und als Karzinogen eingestuft; SDS ist ein Reizstoff; und Wasserstoffperoxid ist ein starker Oxidator, der Verbrennungen verursachen kann. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Nitrilhandschuhe, geschlossene Schuhe und Schutzbrille). Durchführung von Verfahren mit flüchtigen Reagenzien in einer zertifizierten chemischen Abzugshaube und Entsorgung von Abfällen gemäß den institutionellen Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien.
  2. Probenentnahme
    1. Sammeln Sie Tiere aus jedem experimentellen Zustand und Zeitpunkt.
    2. Überführen Sie die Tiere in beschriftete 20-mL-Szintillationsfläschchen mit 2 mL Planarianwasser.
    3. Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit, spülen Sie einmal mit 2 ml frischem Planarianwasser und dann noch einmal mit der gesamten Flüssigkeit.
  3. Fixierung und Permeabilisierung
    1. Opfere Tiere in 7,5 % N-Acetylcystein (NAC) in 1× PBS für 3 Minuten.
    2. Entferne die Lösung und fixiere die Tiere 15 Minuten lang in 4 % Formaldehyd in 0,3 % PBSTx.
    3. Proben zweimal mit 1× PBS abspülen.
    4. Permeabilisiere Proben in 1 % SDS für 15 Minuten.
    5. Proben dreimal mit 1× PBS abspülen.
  4. Bleichen
    1. Bleichmittelproben in 6 % Wasserstoffperoxid in 1× PBS unter hellem LED-Licht für 4–12 Stunden.
      HINWEIS: Wenn das Bleichen nicht sofort erfolgen kann, lagern Sie feste Proben bis zu einer Woche in 1× PBS bei 4 °C oder dehydrieren Sie die Proben in 100 % Methanol für die Langzeitlagerung.
  5. Blockierung und Antikörperinkubation
    1. Transferiere die Tiere auf 24-Brunnenplatten mit 1× PBS.
    2. Blockieren Sie die unspezifische Bindung in 2,5 % PBS-TB (PBS enthält Triton X-100 und Rinderserumalbumin) für 4 Stunden bei Raumtemperatur oder 8 Stunden bei 4 °C.
    3. Inkubieren Sie Proben mit dem primären Anti-Candida-Antikörper (1:500 in PBS-TB) für 4 Stunden bei Raumtemperatur oder 8 Stunden bei 4 °C.
    4. Primäre Antikörper entfernen und Proben achtmal alle 20 Minuten mit 0,3 % PBSTx (insgesamt ~2,5 Stunden) abwaschen.
    5. Inkubieren Sie Proben mit Alexa-568-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern (1:800 in PBS-TB) für 4 Stunden bei Raumtemperatur oder 8 Stunden bei 4 °C.
      HINWEIS: Schützen Sie Proben vor Licht, um Photobleaching zu verhindern. Antikörperlösungen können wiederverwendet werden.
    6. Sekundäre Antikörper entfernen und Proben achtmal alle 20 Minuten mit 0,3 % PBSTx waschen.
  6. Optionale Schlittenmontage
    1. Setzen Sie die Tiere auf einen Objektträger mit allen Tieren nach vorne nach oben ausgerichtet.
    2. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit einer Transferpipette.
    3. Saugen Sie vorsichtig die restliche Flüssigkeit an den Rändern mit dem Rand eines Papiertuchs auf.
    4. Geben Sie tropfweise 150–175 μL Gelvatol-Montagemedium (Tabelle 2 für die Zusammensetzung), bis die Tiere vollständig bedeckt sind.
    5. Legen Sie vorsichtig einen Deckdeckel über die Probe und vermeiden Sie Luftblasen.
    6. Lass Gelvatol mindestens 2 Stunden vor der Bildnahme fest werden.
    7. Lagerobjekte an einem kühlen, dunklen Ort zur langfristigen Erhaltung.
  7. Bildgebung
    1. Bildproben mit gelb-grüner Anregung (~578 nm) und beobachten orange-rote Emission (~603 nm).
    2. Verwenden Sie eine 2x-Objektivlinse, um ganze Tierfarbungsmuster zu visualisieren.

8. Fehlerbehebung

  1. Wenn die Infektionsergebnisse uneinheitlich sind, wird eine Dosis-Titrationskurve mit Wildtyp-SN250 oder einem anderen Basisstamm in Schritten von 5–10 × 107 Zellen /ml durchgeführt.
  2. Führen Sie mindestens drei biologische Replikationen mit 5–10 Tieren pro Gruppe durch.
  3. Beziehen Sie negative und positive Kontrollgruppen ein, um potenzielle Probleme wie Kreuzkontamination, Versagen der aseptischen Technik, Stabilitätsprobleme oder schlechte Tiergesundheit zu identifizieren.
  4. Nach Abschluss des Dosis-Titrations-Experiments repliziert der Pool, um das mediane Überleben pro Gruppe zu bestimmen.
  5. Analysieren Sie Überlebensunterschiede mit der Mantel–Cox-log-Rang-Paarweise Analyse.
  6. Verwenden Sie die Kaplan–Meier-Überlebensanalyse, um Unterschiede in der Zeit bis zum Tod zwischen Stämmen oder Behandlungen zu bewerten.
  7. Bei subletalen oder infektiösen Dosiszuständen sollten die symptomatischen Wirtsergebnisse (z. B. leichte oder schwere Phänotypen oder Pilzbesiedlung) statt des Überlebens analysiert werden.
  8. Vergleichen Sie die Wirtsreaktionen zwischen den Dosierungsgruppen, um den geeigneten infektiösen oder tödlichen Dosisbereich für nachfolgende Experimente zu bestimmen.

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Ergebnisse

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Ein aktualisiertes Protokoll zur Infektion von Planarians mit C. albicans (Abbildung 1) und zur systematischen Quantifizierung von Wirtsergebnissen (Abbildung 2) wird präsentiert. Dieser verfeinerte Arbeitsablauf unterstützt eine robuste Bewertung mehrerer Infektionsparameter, darunter Morbidität (symptomatische Krankheitsschwere), Überlebensrate (Lethalität), Pilzbelastung (CFUs) und räumlich-zeitliche Dynamik der Path...

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Diskussion

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Die Variation der infektiösen Dosis des Wildtyps C. albicans erzeugt reproduzierbare, dosisabhängige Unterschiede in der Morbidität bei S. mediterranea, was die Sensitivität des Modells für die quantitative Bewertung der pilzvirulenzen Unterstreichung unterstreicht. Dieses Protokoll skizziert Strategien zur Festlegung von infektiösen und tödlichen Basisdosen in laborgetreuen planarialen Kolonien und stellt Kriterien zur Bestätigung einer erfolgreichen systemischen Infek...

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Offenlegungen

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C.J.N. ist Mitbegründer von BioSynesis, Inc., einem Unternehmen, das Diagnostik und Therapeutika für Biofilminfektionen entwickelt. Alle anderen Autoren geben keine konkurrierenden Interessen an.

Danksagungen

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Die Autoren danken allen Mitgliedern der Nobile-, Oviedo- und Hernday-Labore für aufschlussreiche Diskussionen über das S. mediterranea-C. albicans-Infektionsmodell und sind Edelweiss Pfister für das Labormanagement und die Planarianpflege dankbar. Diese Arbeit wurde durch Vergaben des National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) unterstützt, die R35GM156045 und R35GM124594 an C.J.N. sowie R35GM158501 und R01GM132753 an N.J.O. vergeben wurden. Diese Arbeit wurde auch von der Familie Kamangar in Form eines gestifteten Lehrstuhls für C.J.N. N.M.S. unterstützt. Das Center for Cellular and Biomolecular Machines (CCBM) der National Science Foundation (NSF) Center of Research Excellence in Science and Technology (CREST) Stipendien erhielt die Stipendien NSF-HRD-1547848 und NSF-EES-2112675.

Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Planung der Studie, Datenerhebung und -analyse, Interpretation der Daten, der Erstellung des Manuskripts oder der Entscheidung zur Veröffentlichung der Ergebnisse. N.M.S. erkennt die Nutzung von ChatGPT zur Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts an (Überprüfung von Rechtschreibung, Grammatik, Formatierung und Satzstruktur).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,7 mL Mikrozentrifugenröhren VWR/Genemate490004-436-BOXOF500Frei, Schachtel mit 500 Stücken
20-mL Scintillon-FläschchenFisher Scientific12-100-006Klare Glasflaschen zur Immunfärbung
24-Well-unbehandelte PolystyrolplattenFisher Scientific08-772-51Immunfärbung
5,0 mL Mikrozentrifugenröhren Eppendorf/Sigma AldrichEP0030119487-200EAKlar, Kiste mit 200 Stücken
6-Well-unbehandelte PolystyrolplattenFisher Scientific08-772-49Infektionstests
AgarVWR89405-066Bakteriologische Klassifizierung für YPD-Medium
ApplikatorstäbeThermofischer/Puritaner22-029-491C. albicans Kultivierung
BioRenderBioRender Inc.N/AFigurendesign-Software, die zur Erstellung von Schaltplänen verwendet wird
Calciumchlorid (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GPlanarisches Wasser/1x Montjuï C-Salze
Candida albicans polyklonale Antikörper-Anti-Kaninchen-Antikörper, IgGThermo FisherPA1-27158Immunfärbung
ZentrifugenröhrenVWR89039-664< >C. albicans Ernte
Kulturröhren Borosilikatglas 18x150 mmVWR47729-583C. albicans Kultivierung
CuvettenFisher Scientific14-955-127Zur Messung der optischen Dichte von Kulturen
Dextrose (D-Glukose)Fisher ScientificD16-3YPD-Medium
GlycerolFisher ScientificG33-4Molekularbiologische Qualität zur Ergänzung für die kryogene Speicherung von C. albicans 
Grafik- und DatenvisualisierungstoolGraphPad/PrismStatistische Software und Vizualisierungstool. Verison 10.6.1.
GraphenwerkzeugRStatistische Software. Verison 4.4.3.
Inkubator-SchüttlerEppendorfEPM1282-0004-1EANew Brunswick Innova 44/44R for C. albicans Kultivierung
Magnesiumchlorid (MgCl2)SigmaM8266-100GFür planarisches Wasser  (1x Montjuï C-Salze)
Magnesiumsulfat (MgSO4)Sigma-AldrichM7506-500GFür planarisches Wasser  (1x Montjuï C-Salze)
Mikroskop-ObjektträgerVWR16004-368
Multizoom-MikroskopNikonNikon AZ100 
N-Acetyl-L-CysteinSigma AldrichA7250-50GMukolytische und Opferreagenz  Fixierung
Paramaldehyd, 16% Lösung, molekularbiologische QualitätElektronenmikroskopiewissenschaften15710Fixatives Reagenz
Pellet-Stößel-AkkumotorFisher Scientific12-141-361Planarische Homogenisierung
Pepton, bakteriologische QualitätHIMEDIA/VWR89129-480YPD-Medium
StößelFisher Scientific12-141-368RNase-freies Einwegpellet für planariane Homogenisierung
Petrischalen, 100 x 15 mmVWR25384-342
Poly (Vinylalkohol)Sigma-AldrichP-8136 Für Gelvatol
Kaliumchlorid (KCl)Sigma Life ScienceP9541-500GPlanarisches Medium/Wasser  (1x Montjuï C-Salze)
Sekundärer Antikörper Ziegen-Antikaninchen, IgG, Alexa Fluor 568Fisher ScientificA-11011Immunfärbung
SN250Stockzentrum für PilzgenetikWildtyp C. albicans stamm (https://www.fgsc.net/)
NatriumazidFisher ScientificS227-100Für Gelvatol
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KGPlanarisches Medium/Wasser  (1x Montjuï C-Salze)
Natriumchlorid (NaCl)Sigma Life ScienceS3014-500GPlanarisches Medium/Wasser  (1x Montjuï C-Salze)
SpektrophotometerAgilent26354BioTek Epoch 2 Mikroplatte zur Messung der optischen Dichte
Statischer BrutkastenFisher Scientific15-015-2634<>C. albicans kultivierung
TransferpipettenFisher Scientific13-711-9CMSterile einweggraduierte Pippettes für den Transfer von Planarians
Tris BaseSigma-Aldrich252859Für Gelvatol
HefeextraktThermo Fisher212750YPD-Medium

Referenzen

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Planarienmodellangeborene ImmunantwortPilzkolonisationImmunf rbungWirt Pathogen InteraktionHochdurchsatz Screening

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