Validierung der zufälligen Transgenintegration und -expression in Eimeria-Parasiten

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine standardisierte Methode zur Validierung der Integration und Expression fremder Gene in transgenen Eimeria-Parasiten vor. Durch die Integration genomischer und proteinbezogener Analysen bestätigt dieser Workflow stabile Geninsertion und -expression. Dieser Ansatz erleichtert die Entwicklung transgener Eimerien für Forschung und Impfstoffanwendungen.

Zusammenfassung

Die Validierung transgener Eimeria-Parasiten ist entscheidend, um eine stabile genomische Integration und Expression exogener Gene zu bestätigen. Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Arbeitsablauf zur Überprüfung der Transgen-Einfügung und Proteinexpression in Eimeria tenella. Das Verfahren beginnt mit der genomischen DNA-Extraktion aus sporulierten Oozysten, gefolgt von einer PCR-Amplifikation, um das Vorhandensein des Zielfragments vorläufig zu überprüfen. Um die genomische Integration weiter zu bestätigen, wird eine vollständige Genom-Resequenzierung durchgeführt, um Einfügungsstellen zu identifizieren und die Stabilität des integrierten Konstrukts im Parasitengenom zu bewerten. Die Proteinexpression wird anschließend durch westliche Blotting von Lysaten untersucht, die aus gereinigten Sporozoiten hergestellt werden, was den Nachweis des Zielrekombinanten Proteins ermöglicht. Zusätzlich wird die intrazelluläre Lokalisierung durch einen indirekten Immunfluoreszenz-Test (IFA) mit infizierten Wirtszellen visualisiert. Zusammen bieten diese Assays einen robusten und reproduzierbaren Rahmen zur Validierung transgenerischer Eimeria-Linien . Dieser Workflow ermöglicht eine zuverlässige Bestätigung der genomischen Integration und Proteinexpression und unterstützt somit nachgelagerte Anwendungen in der genetischen Manipulation, funktionellen Genomik und der Impfstoffentwicklung, die auf Eimeria-Parasiten abzielen.

Einleitung

Kokkidiose, verursacht durch Eimeria-Arten, stellt eine der wirtschaftlich bedeutendsten parasitären Krankheiten bei Geflügel dar und führt zu geringerer Gewichtszunahme, schlechter Futterumstellung und globalen finanziellen Verlusten, die jährlich in Milliarden von Dollar^geschätzt werden^{: 1,2,3}. Die genetische Manipulation von Eimeria-Parasiten ist zu einem mächtigen Werkzeug sowohl für Grundlagenforschung als auch für die Entwicklung von Impfstoffen^geworden. ^4,5,6. Stabile Transfektion ermöglicht die Integration und Expression exogener Gene wie fluoreszierende Reporter oder Schutzantigene, was eine Echtzeitvisualisierung der Parasitenentwicklung und eine gezielte Bewertung von Impfstoffkandidaten^ermöglicht.

Eine frühere Veröffentlichung von Duan et al. bot ein standardisiertes Protokoll für die Nukleofektion und in vivo-Vermehrung transgener Eimerie und etablierte eine effiziente Methode zur Erzeugung und Anreicherung rekombinanter Parasitenlinien¹⁰. Es existiert jedoch derzeit kein einheitlicher Workflow zur Bestätigung stabiler genomischer Integration und funktioneller Expression von Transgene. Eine solche Validierung ist entscheidend, um die Authentizität, Stabilität und Reproduzierbarkeit transgener Linien sicherzustellen, die für nachgelagerte biologische Studien oder Impfstoffanwendungen verwendet werden.

Dieser Artikel präsentiert ein vollständiges, schrittweises Protokoll zur Validierung der Transgenintegration und -expression in Eimeria tenella, wobei eine transgene E. tenella-Linie verwendet wird, die das Antigen des infektiösen Bursal-Virus (IBDV) VP2 (Et-VP2) als Modell¹¹ exprimiert. Das Expressionsplasmid p5′AMic2linkerVP2m3′A, das das VP2-Gen und einen mCherry-Reporter trägt, wurde in wilde E. tenella-Sporozoiten (Et-WT) transfiziert. Rote fluoreszierende Oocysten wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert und in kozidienfreien Hühnern nacheinander durchführt. Dieser Workflow zeigt Verfahren zur genomischen DNA-Extraktion, PCR-basierter vorläufiger Integrationsanalyse, Ganzgenom-Resequenzierung zur Identifizierung von Einfügungsstellen, Western Blotting zur Überprüfung der Proteinexpression und indirekter Immunfluoreszenz-Assay (IFA) zur Visualisierung der intrazellulären Lokalisierung des rekombinanten Proteins. Zusammen bieten diese Methoden einen reproduzierbaren und umfassenden Rahmen zur Bestätigung der Echtheit transgener Eimeria-Linien und ermöglichen so deren zuverlässige Anwendung in der funktionellen Genomikforschung und Impfstoffentwicklung.

Protokoll

Alle Tierversuche mit Hühnern wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der China Agricultural University genehmigt (Genehmigungsnummer: CAU20160628-2). Alle Pflege- und experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der China Agricultural University durchgeführt und entsprachen den Internationalen Leitprinzipien für biomedizinische Forschung mit Tieren. In dieser Studie wurden sieben Tage alte männliche spezifische, pathogenfreie (SPF) White Leghorn-Hühner verwendet. Die Vögel wurden während der gesamten Versuchsphase unter standardisierten Pflegebedingungen gehalten, mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Extraktion von genomischer DNA aus sporulierten Oocysten von Eimeria spp.

1. Übertragen Sie 1 ml einer Oozystensuspension (≥1 × 10⁷/mL) in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 1 mm Glasperlen hinzu, die dem Oocystenpellet entsprechen. Stören Sie die Oocysten mit einem Gewebehomogenisierer, indem Sie 5 Minuten lang kräftig mit 60 Hz schlagen, bis die Oozystenwände vollständig gebrochen sind und der Inhalt freigesetzt wird.
2. Sammeln Sie die Mischung (ohne die Glasperlen) in ein neues Rohr und zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 1 Minute. Entsorgen Sie das Supernatant, fügen Sie 500 μL CTAB-Puffer und 40 μL Proteinase K hinzu und inkubieren Sie das Gemisch bei 60 °C für 30 Minuten.
3. Fügen Sie 500 μL Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1), Vortex für 10 Sekunden hinzu und zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 5 Minuten. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Rohr.
   HINWEIS: Schließen Sie das Rohr mit der organischen Schicht fest ab und entsorgen Sie, um eine Verunreinigung der Umwelt zu verhindern. (Optional) Wenn die Proteinkontamination hoch bleibt, wiederhole Schritt 1.3 1–2 weitere Male.
4. Füge 500 μL Chloroform hinzu: Isoamylalkohol (24:1), Vortex für 10 s und Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 Minuten. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues Rohr und fügen Sie ein gleiches Volumen Isopropanol hinzu. Mischen Sie durch Inversion, bis DNA-Ausfällungen erscheinen.
   HINWEIS: Niederschlag bei −20 °C für ≥1 Stunden oder über Nacht erhöht den Ertrag.
5. Zentrifugiere mit 12.000 x g für 10 Minuten, um DNA zu pelletieren. Wasche das Pellet mit 70 % Ethanol, zentrifugiere bei 12.000 x g für 5 Minuten und entsorge das Supernatant. Entfernen Sie die Restflüssigkeit vorsichtig mit einer Vakuumpumpe und lassen Sie das Pellet bei Raumtemperatur oder 37 °C an der Luft trocknen.
6. Lösen Sie das getrocknete DNA-Pellet in einem RNase-haltigen ddH_2O- oder TE-Puffer auf. Inkubieren Sie bei 37 °C für ≥1 Stunde oder über Nacht bei 4 °C, um Rest-RNA zu entfernen. Lagere die gereinigte DNA bei −20 °C.
   HINWEIS: Für die Langzeitkonservierung können ungelöste DNA-Pellets direkt bei −20 °C oder −80 °C gelagert werden. Bewerten Sie die DNA-Integrität und -Konzentration mittels Agarosegel-Elektrophorese, bevor sie nachgelagert angewendet werden.

2. PCR-Verifikation des Vorhandenseins des Et-VP2-Konstrukts im Parasitengenom

1. Design-Primer-Paare (Tabelle 1) zur Überprüfung der genomischen Integration des Et-VP2-Konstrukts.
   HINWEIS: Die Primer-Sequenzen wurden mit Primer-BLAST entworfen, mit typischen Parametern von 18–24 bp Primerlänge, einer Schmelztemperatur von etwa 55–60 °C und minimaler Sekundärstrukturbildung. Die Spezifität jedes Primerpaares wurde weiter anhand des Eimeria tenella-Genoms überprüft, um eine unspezifische Amplifikation zu vermeiden.
2. Bereiten Sie eine 50 μL Reaktionsmischung vor, die 25 μL 2× Taq Master Mix, 21 μL ddH₂O, je 1 μL Vorwärts- und Rückwärtsprimer sowie 2 μL DNA-Vorlage enthält.
3. Durchführung einer Verstärkung unter den folgenden thermischen Zyklusbedingungen: erste Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten; 30 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 1 Minute; gefolgt von einer letzten Verlängerung bei 72 °C für 10 Minuten.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien vor dem thermischen Zyklus gründlich gemischt sind. Verwenden Sie frisch vorbereitete DNA-Vorlagen, um eine optimale Amplifikationseffizienz zu erreichen.

3. Resequenzierung der transgenen Parasitenlinie (Et-VP2)

1. Beispieleinreichung und Bibliotheksaufbau
   1. Reichen Sie eine 1 mL Oozystensuspension (≥1 × 10⁷/mL) bei einem kommerziellen Sequenzierungsdienstleister für eine Analyse der nächsten Generation ein.
   2. Nach der Qualitätsbewertung der genomischen DNA wird die DNA durch mechanische Zerstörung mittels Ultraschall fragmentiert. Reinigen Sie die fragmentierte DNA, führen Sie Endreparaturen durch, fügen Sie den 3′-Enden eine Adenin-(A)-Base hinzu und Ligatensequenzierungsadapter.
   3. Wähle DNA-Fragmente der gewünschten Größe mittels Agarosegel-Elektrophorese aus und führe eine PCR-Amplifikation durch, um die Sequenzierungsbibliothek zu erstellen.
   4. Unterziehen Sie die errichtete Bibliothek einer Qualitätskontrolle. Führen Sie eine gepaarte Endsequenzierung auf der Illumina NovaSeq-Plattform mit einer Leselänge von 150 bp durch. Halten Sie eine Sequenztiefe von 100 × ein, um die Datengenauigkeit zu gewährleisten, und erzeugen Sie mindestens 6 GB Rohdaten mit einem Mindestqualitätswert von Q20 >90 %.
      HINWEIS: Behandeln Sie alle Reagenzien und DNA-Proben mit aseptischen Techniken, um eine Kontamination zu verhindern. Überprüfen Sie, ob die Sequenzierungsparameter die erforderlichen Tiefen- und Qualitätskennzahlen erfüllen, bevor Sie mit der Datenanalyse beginnen.
2. Datenanalyse
   1. Filtern Sie die Rohsequenzierungsdaten mit der Fastp-Software (v0.23.2) nach folgenden Kriterien:¹²:
      1. Entferne die Adaptersequenzen.
      2. Setze die Schwelle für niedrige Qualität auf Q20 und entfern Lesewerte, bei denen niedrigqualitative Basen mehr als 30 % der Gesamtleselänge ausmachen.
      3. Entfernen Sie Werte kürzer als 50 bp.
   2. Richten Sie die qualitätskontrollierten Lesungen mit der Bowtie2-Software (v2.4.5)¹³ auf das E. tenella-Referenzgenom (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) aus. Die Zufälligkeit der Next-Generation-Sequenzierungsdaten wird anhand von Abdeckungstiefe und Einheitlichkeit bewertet.
   3. Stellen Sie sicher, dass die Sequenzierungswerte auf die transgene Vektorsequenz ausgerichtet sind. Entfernen Sie die Reads, die die T-DNA-Region nicht abbilden, um chimäre Reads zu erhalten, bei denen ein Ende auf die T-DNA und das andere Ende auf das E. tenella-Referenzgenom abgebildet wird.
   4. Basierend auf den Sequenzen der chimärischen Reads wird die Ausrichtung mit ToxoDB (Release 64) durchgeführt, um den genauen Standort potenzieller T-DNA-Einfügungsstellen zu bestimmen. Analyse der Sequenzierungstiefe über homologe Regionen zwischen dem Vektor und dem Eimeria Genom (d. h. den 5′- und 3′-Regulationsregionen) mit der Mosdepth-Software (v0.3.3)¹⁴.
   5. Identifizieren Sie potenzielle Integrationsstellen des transgenen Plasmids im E. tenella-Genom und verifizieren Sie sie mittels PCR mit dem in Schritt 2.1 beschriebenen Reaktionssystem.
      HINWEIS: Stellen Sie die konsequente Verwendung von Softwareversionen und Parametereinstellungen während der gesamten Analyse sicher, um die Datengenauigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

4. Westliche Blottung transgener Eimeria-Proteine

1. Sammeln Sie eine PBS-Suspension mit mindestens 5 × 10⁶ Sporozoiten in einem 1,5-ml-Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie mit 2500 x g für 5 Minuten. Setzen Sie das Pellet in einen 100 μL RIPA-Lysepuffer wieder auf und inkubieren Sie 1 Stunde auf Eis. Gib 20 μL 6× Proteinladepuffer hinzu und erhitze die Mischung bei 100 °C für 10 Minuten.
2. Bereiten Sie SDS-PAGE-Gels mit einer 1,5-mm-Glasplatte vor. Passen Sie die Acrylamidkonzentration entsprechend dem Molekulargewicht des Zielproteins an. Während der Polymerisation wird das Trenngel mit destilliertem Wasser überlagert, um eine gleichmäßige Oberfläche zu gewährleisten, bevor das Stapelgel hinzugefügt wird.
3. Zentrifugiere das Lysat bei 10.000 x g für 5 Minuten und gib 40 μL Überstandsmittel in jede Probenbahn. Lade 10 μL Proteinmarker in eine separate Spur und fülle alle verbleibenden Spuren mit 40 μL 1× Ladepuffer als Steuerung.
4. Elektrophorese wird in 1× laufendem Puffer bei 70 V für 20 Minuten durchgeführt, gefolgt von 120 V für 60–90 Minuten, bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
5. Entfernen Sie das Gel entsprechend der erwarteten Proteingröße. Eine PVDF-Membran in Methanol für 1 Minute voraktivieren und das Transfersandwich in folgender Reihenfolge zusammensetzen: Schwamm, Filterpapier, Gel (Kathodenseite), PVDF-Membran, Filterpapier, Schwamm. Entferne alle Luftblasen und transferiere Proteine bei 70 V für 3 Stunden im Transferpuffer.
6. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST (jeweils 5 Minuten) und blockieren Sie mit 5 % fettarmer Milch für 1 Stunde bei Zimmertemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Membran zweimal mit PBST, um die restliche Blocklösung zu entfernen.
7. Die Membran wird mit primären Antikörpern inkubiert, die im Antikörperpuffer verdünnt sind: mauspolyklonales Anti-Flag (1:2000) und mausmonoklonales Anti-GAPDH (1:2000). Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur oder über Nacht bei 4 °C mit sanftem Schütteln. Sammeln Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Membran fünfmal mit PBST (jeweils 5 Minuten).
8. Inkubieren Sie die Membran mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:2000) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wasche die Membran fünfmal mit PBST (jeweils 5 Minuten).
9. Bereite ein ECL-Substrat vor, indem du gleiche Mengen von Lösung A und B mischst. Trage das Substrat gleichmäßig auf die Membran auf und detektiere Proteinsignale mit einem chemilumineszenzbildenden System.
   HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit Proteinproben auf Eis aus, sofern nicht anders angegeben. Behandle Methanol- und ECL-Substrate in einer Abzugshaube, während du Handschuhe und Schutzbrillen trägst.

5. Intrazellulärer indirekter Immunfluoreszenz-Assay (IFA) transgener Eimeria

1. Reinigung von Sporozoiten mit einer Chromatographiesäule
   1. Verbinden Sie die Chromatographiesäule mit einer peristaltischen Pumpe und stellen Sie die Durchflussrate auf 50–60 Hz ein. Waschen Sie die Säule mit destilliertem Wasser und Glycinlösung.
   2. Fügen Sie der Säule DE-52-Cellulosesuspension hinzu und geben Sie kontinuierlich eine Glycinlösung, bis das Zellulosebett etwa 1 cm Höhe erreicht.
   3. Lade Sporozoite, die mit der Percoll-Methode gereinigt wurden, auf die Säule. Halten Sie eine Durchflussrate von 30–40 Hz unter Verwendung einer Glycinlösung und sammeln Sie den Durchfluss in einem 50-mL-Zentrifugenrohr.
   4. Überwachen Sie das Eluat, indem Sie Tropfen auf einen Glasträger zur mikroskopischen Beobachtung legen. Wenn keine Sporozoiten festgestellt werden, stoppen Sie die Pumpe. Zentrifugieren Sie die gesammelte Fraktion bei 2.500 x g für 5 Minuten, entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet erneut in PBS.
      HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen durch, um eine mikrobielle Kontamination zu verhindern. Entsorgen Sie Glycin und Percoll-Abfälle gemäß institutionellen Biosicherheitsvorschriften.
2. Sporozoit-Infektion von HFF-Zellen
   1. Samen 1 × 10⁶ Sporozoite in 24-Brunnenplatten mit HFF-Zellmonoschichten. Penicillin-Streptomycin zu einer Endkonzentration von 1 × (100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin) hinzufügen, vorsichtig mischen und 4–6 Stunden bei 37 °C inkubieren, um eine Invasion zu ermöglichen. Entferne das Medium, wasche einmal mit 1 mL PBS und entsorge das Supernatantant.
   2. Entfernen Sie vorsichtig die Glasabdeckungen aus den Brunnen mit steriler Pinzette und übertragen Sie sie auf eine frische 24-Bohrloch-Platte. Die Proben in 1 ml 4%-Paraformaldehyd für 30 Minuten fixieren, einmal mit 1 ml PBS waschen und das Überlagerungsmittel entsorgen.
   3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 1 ml von 0,25 % Triton X-100 für 30 Minuten. Waschen Sie einmal mit 1 mL PBS und entsorgen Sie das Supernatantant.
   4. Blockiere die Proben mit 1 ml 3% BSA für 30 Minuten. Waschen Sie einmal mit 1 mL PBS und entsorgen Sie das Supernatantant.
   5. Verdünne den monoklonalen Anti-Flag-Antikörper der Maus (1:200) in 3 % BSA. Tropfen des verdünnten Antikörpers auf die Dichtungsfolie legen und die Deckfolien (Zellseite nach unten) auf die Tropfen umdrehen. Inkubieren Sie die Deckdeckel in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C für 1 Stunde. Waschen Sie dreimal mit 1 mL PBS (jeweils 5 Minuten).
   6. Verdünne FITC-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:200) und Hoechst 33258 (1:100) in 3 % BSA. Lege Tropfen der Farbmischung auf Dichtfolie und drehe die Überdeckfolien auf die Tropfen. Inkubieren Sie 1 Stunde lang in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C und waschen Sie dann fünfmal mit 1 mL PBS (jeweils 5 Minuten).
   7. Montieren Sie die Deckfolien, indem Sie 5 μL Antifade-Montagemedium auf einen Glasschlitten anbringen. Kippe den Deckdeckel (Zellseite nach unten) auf den Tropfen, vermeide Luftblasen, und versiegele die Kanten. Bewahren Sie die montierten Objektträger in einer befeuchteten Kammer bei 4 °C auf, bis zur Bildaufnahme.
      HINWEIS: Handhabt Paraformaldehyd und Triton X-100 in einer chemischen Abzugshaube und trägt Handschuhe und Augenschutz. Die in diesem Verfahren verwendeten Reagenzienformulierungen sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Ergebnisse

Die genomische PCR-Analyse bestätigte das Vorhandensein des Zielfragments in den transgenen Parasiten, während in der Wildtyp-Kontrollgruppe keine entsprechenden Bänder nachgewiesen wurden (Abbildung 1A). Die Resequenzierung des gesamten Genoms zeigte zudem, dass das linearisierte Plasmid stabil in das Parasitengenom integriert war und der vorhergesagte Integrationsstandort durch PCR-Amplifikation über die Junction-Region validiert wurde (

Diskussion

Dieses Protokoll etabliert einen umfassenden Workflow zur Validierung der genomischen Integration, der Proteinexpression und der intrazellulären Lokalisierung exogener Gene im transgenen E. tenella. Anstatt auf einen einzelnen Test zu setzen, kombiniert der Ansatz genomische und proteinbezogene Evidenz und stellt sicher, dass die Transgen-Einschleusung sowohl strukturell bestätigt als auch funktional exprimiert ist.

Mehrere entscheidende Schritte in d...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antifade Mounting Medium	MCE	HYK1042	Fluoreszierendes Mounting-Medium zur Verhinderung von Photobleichung
BSA (3%)	Beyotime	ST023	Blocking-Puffer und Antikörper-Verdünnungspuffer für IFA; Blockieren bei Raumtemperatur für 30 min
Chloroform:Isoamylalkohol (24:1)	Sigma	C0549	Reagenz zur Entfernung von Phenolresten bei der genomischen DNA-Extraktion
Coccidia-freie Hühner	Boehringer-Ingelheim	SPF	Verwendet für die in vivo Passage und Amplifikation transgener Stämme; genehmigt vom Ethikkomitee (Zulassungsnummer: CAU20160628-2)
CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid)	Merck KGaA	H5882	Komponente des genomischen DNA-Extraktionspuffers; Formulierung: 3 g CTAB + 12,27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0,5 mol/L EDTA, auf ein Endvolumen von 150 mL mit ddH2O eingestellt
DE-52 Cellulose	Solarbio	C8350	Ionenaustausch-Chromatographiemedium für Sporozoitenreinigung; sequenziell behandelt mit NaOH, HCl und destilliertem Wasser, dann in Glycinlösung equilibriert
ECL-Substrat (Lösung A + Lösung B)	thermofisher	32106	Chemilumineszent-Nachweisreagenz; mischen Sie vor Gebrauch gleiche Volumina von Lösung A und B
FITC-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG	Sigma	AP124F	Fluoreszierende sekundäre Antikörper für IFA, Verdünnungsverhältnis 1:200
Glasperlen	Sigma	Z250473-1PAK
Glycin-Lösung	Sigma	67419	Equilibrierungs- und Elutionspuffer für Chromatographiesäulen; Formulierung: 0,75 g Glycin + 7,9 g NaCl gelöst in 500 mL destilliertem Wasser, pH auf 7,4-7,6 eingestellt, autoklaviert
Hoechst 33258	Sigma	94403	Kernfärbemittel, Verdünnungsverhältnis 1:100; verwendet für IFA-Lokalisierung
HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG	Sigma	12-349	Sekundärantikörper für Western Blotting, Verdünnungsverhältnis 1:2000
Illumina NovaSeq-Sequenzierungsplattform	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China)		Next-Generation-Sequenzierungsplattform; Paired-End-Sequenzierung (150 bp Read-Länge), Sequenzierungstiefe 100×, generiert ≥6 GB Rohdaten (Q20>90%)
Niedrige Drehzahlzentrifuge	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE	DT5-2
Maus-Monoklonaler Anti-Flag-Antikörper	Sigma	F1804	Primärantikörper, Verdünnungsverhältnis 1:200; verwendet für IFA-Nachweis von Flag-markiertem Fusionsprotein
Maus-Monoklonaler Anti-GAPDH-Antikörper	Sigma	G8795	Primärantikörper, Verdünnungsverhältnis 1:2000; verwendet als Loading-Control für Western Blotting
Magermilch (5%)	Beyotime	P0216	Blocking-Puffer für Western Blotting; blockieren bei Raumtemperatur für 1 h oder 4°C über Nacht
Paraformaldehyd (4%)	Merck KGaA	30525	Zellfixierlösung; fixieren bei Raumtemperatur für 30 min
PBS	Solarbio	P1010
Penicillin-Streptomycin (100×)	Yeasen	60162ES76	Antibiotikum für Zellkultur; hemmt mikrobiellen Befall
Percoll (DG-Gradientenstamm	GE Healthcare	17-0891-09
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1)	Merck KGaA	77617	Reagenz zur Proteinentfernung bei der genomischen DNA-Extraktion
Protein-Loading-Puffer (6×)	Beyotime	P0015F	Proteinelektrophorese-Loading-Puffer; Formulierung: 100 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 2 mM EDTA, 2% Glycerin, 6 M Harnstoff; mischen Sie vor Gebrauch mit 50 μL 2 M DTT und 50 μL 5% Bromphenolblau
Proteinase K	Merck KGaA	39450-01-6	200 mg gelöst in 10 mL ddH2O, verwendet für Proteinverdauung bei der genomischen DNA-Extraktion
PVDF-Membran	thermofisher	88518	Proteintransfermembran; aktivieren Sie mit Methanol für 1 min vor Gebrauch
RIPA-Lysis-Puffer	Yeasen	20101	Lysis-Puffer für Sporozoitenprotein-Extraktion
RNase A	Merck KGaA	9001-99-4	25 mg gelöst in 2,5 mL 0,01 mol/L NaAc, bei 100°C 10-15 min erhitzt, pH mit 1 mol/L Tris-HCl auf 7,4 eingestellt; verwendet für RNA-Entfernung aus DNA-Proben
SDS-PAGE-Gel-Reagenzien (Acrylamide, Bis-acrylamide, Tris, SDS, APS, TEMED)	Bio	101	Reagenzien zur SDS-PAGE-Gel-Vorbereitung; Acrylamid-Konzentration angepasst an das Molekulargewicht des Zielproteins
Natriumtaurodeoxycholat-Hydrat	Sigma	T0875
Lösung)
Taq Master Mix (2×)	Vazyme	P112-01/02/03	PCR-Amplifikations-Vormischung mit Taq-Polymerase, dNTPs usw.
Triton X-100 (0,25%)	Merck KGaA	9036	Zellpermeabilisierungslösung; inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min
Trypsin	Solarbio	T8150
Vortex-Mischer	Beijing North TZ-Biotech	HQ-60-II
Wasserbadthermostat	Grant Instruments (Cambridge)	GD120,GM0815010