Methodenartikel

Eine effiziente und schnelle HPLC-QQQ-MS-Methode zur Quantifizierung von Tropanalkaloiden in Heilpflanzen

DOI:

10.3791/70510

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12. Juni 2026

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1College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Studie entwickelte eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie in Kombination mit der Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (HPLC-QQQ-MS) zur Identifizierung und Quantifizierung von Tropanalkaloiden (Hyoscyamin, Anisodamin, Scopolamin) in Anisodus tanguticus. Die Methode erwies sich als schnell, präzise und zuverlässig für Hochdurchsatzanalysen von Heilpflanzen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anisodus tanguticus ist eine wichtige tibetische Heilpflanze. Die Tropanalkaloide (TAs), wie Hyoscyamin, Anisodamin und Scopolamin, weisen bedeutende analgetische und beruhigende pharmakologische Wirkungen auf, was diese Art zu einer wertvollen natürlichen Quelle zur Gewinnung dieser bioaktiven Verbindungen macht. Die chemische Zusammensetzung von A. tanguticus ist jedoch sehr komplex. Es enthält eine große Anzahl von Verbindungen ohne erläuterte Strukturen, was eine systematische Identifikation und strukturelle Charakterisierung seiner aktiven Bestandteile besonders wichtig macht. Obwohl die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) weit verbreitet zur Trennung von Extrakten aus dieser Anlage eingesetzt wird, bleiben viele unbekannte Komponenten selbst mit spektraler Datenbankabgleichung schwierig zu identifizieren.

Diese Studie etablierte eine analytische Methode auf Basis von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie in Kombination mit Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (HPLC-QQQ-MS) zur Bestimmung von Tropanalkaloiden in A. tanguticus. Die Methode umfasst eine Reihe systematischer Verfahren, darunter standardisierte Probenpräparation, massespektrometrische Parameter-Konfiguration, LC-Vorausgleich, Methodenaufbau, Erfassung von MS-Daten, mehrstufiges Massenspektrometrie-(MSⁿ)-Scannen und manuelle Dateninterpretation. Mit dieser Strategie konnten wir erfolgreich drei repräsentative Tropanalkaloide in A. tanguticus identifizieren: Hyoscyamin, Anisodamin und Scopolamin. Darüber hinaus validiert sie die Präzision der etablierten HPLC-QQQ-MS-Methode und bestätigt, dass die Methode schnell, sensibel, machbar und genau für die quantitative Bestimmung von Tropanalkaloiden (TAs) in A. tanguticus ist. Der etablierte Ansatz zeigt gute Vielseitigkeit und Zuverlässigkeit und eignet sich für die Hochdurchsatz-Identifikation und Quantifizierung von Tropanalkaloiden in A. tanguticus und anderen Heilpflanzen.

Einleitung

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Die therapeutische Wirksamkeit der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) hängt weitgehend von ihren sekundären Metaboliten ab, wie Alkaloiden, Flavonoiden, Terpenoiden und anderen aktiven Bestandteilen 1,2,3. Folglich ist die präzise und sensible qualitative und quantitative Analyse spezifischer Zielmetaboliten in diesen komplexen Gemischen ein entscheidender Schritt zur Sicherstellung der Qualität der TCM, zur Aufklärung der materiellen Grundlage ihrer Wirksamkeit und zur Förderung moderner Forschung3. Die Vielfalt und Komplexität der TCM-Komponenten zusammen mit den extrem niedrigen Konzentrationen vieler wichtiger Wirkstoffe stellen jedoch erhebliche Herausforderungen für eine effiziente und genaue Detektion dar.

Anisodus tanguticus (Maxim.) Pascher stellt eine wichtige botanische Quelle für Tropanalkaloide (TAs)4 dar, bekannt für ihren reichen Gehalt an pharmakologisch aktiven Tropane-Typ-Verbindungen5. Wichtige charakteristische Alkaloide sind Anisodamin, Scopolamin und Hyoscyamin, die einen gemeinsamen Tropankern teilen, aber unterschiedliche funktionelle Gruppensubstitutionen aufweisen (Abbildung 1), was zu divergenten pharmakologischen Profilen 6,7,8 führt. Obwohl ihre strukturellen Ähnlichkeiten die chromatographische Auflösung erschweren, bieten sie auch ein wertvolles Modell für vergleichende phytochemische und metabolische Untersuchungen. Neuere Studien haben die chemische Zusammensetzung und geografische Variationen von A. tanguticus mithilfe von Metabolomik und Netzwerkpharmakologie-Ansätzenuntersucht 9,10. Aktuelle analytische Ansätze für A. tanguticus-Metaboliten basieren überwiegend auf Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)11. Dennoch können die Tropanalkaloidwerte im Sämlingsstadium A. tanguticus so niedrig wie 0,01 % (ein Teil pro zehntausend) liegen, und herkömmliche HPLC-Methoden sind oft durch begrenzte Auflösung, Empfindlichkeit und analytischen Durchsatz eingeschränkt. Diese Einschränkungen erschweren die vollständige Trennung strukturell analoger Alkaloidhomologe und erschweren den Nachweis von Spurenbestandteilen, was die analytische Genauigkeit beeinträchtigt und die Unterstützung für fortgeschrittenere Forschungsanwendungen einschränkt. In den letzten Jahren haben Fortschritte im HPLC in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie leistungsstarke Werkzeuge bereitgestellt, um diese analytischen Engpässe zu beseitigen. Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie – Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (HPLC-QQQ-MS) bietet insbesondere eine deutlich verbesserte chromatographische Auflösung, Trenneffizienz und außergewöhnliche Empfindlichkeit 12,13,14. Diese Technologie hat sich als hochmoderne Plattform zur Untersuchung sekundärer Metaboliten in der TCM etabliert und ermöglicht eine effiziente und genaue Qualifikation und Quantifizierung von Spurenzielanalyten innerhalb komplexer biologischer Matrizen 11,15,16,17. Als solches bietet es eine solide technische Grundlage für eine umfassende chemische Profilierung und Qualitätsbewertung von Heilpflanzen wie A. tanguticus. In dieser Studie behandeln wir die anhaltenden Herausforderungen beim Nachweis von Tropanalkaloiden in A. tanguticus mit Schwerpunkt auf der genauen Identifikation und Quantifizierung von Spurenbestandteilen. Durch systematische Optimierung chromatographischer und massenspektrometrischer Bedingungen entwickelten und validierten wir eine neuartige HPLC-QQQ-MS-Methode zur gleichzeitigen Bestimmung mehrerer wichtiger Tropanalkaloide. Der optimierte Ansatz erhöht die Sensitivität, Selektivität und methodologische Robustheit erheblich und überwindet damit die üblichen Einschränkungen konventioneller Massenspektrometrie-basierter Assays – wie unzureichende Sensitivität, Matrixeffekte und Co-Elutionsinterferenz, die häufig bei der Analyse von Spurenalkaloidverbindungen auftreten.

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Protokoll

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1. Probenvorbereitung

  1. Herstellung von Standardlösungen
    1. Wiegen Sie jeweils 10,0 mg Hyoscyamin, Anisodaminhydrobromid und Scopolaminhydrobromid-Referenzstandards genau mit einer Analysebilanz von einem Zehntausendstel und platzieren Sie sie jeweils in separate 10-ml-Volumenkolben.
    2. Fügen Sie der markierten Linie chromatographisches Methanol hinzu und lösen Sie die Standards gründlich mittels Ultraschallbehandlung auf, um Einzelstandardlösungen mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml herzustellen.
    3. Füllen Sie die Brühlösung in braune Reagenzflaschen und lagern Sie sie bei 4 °C im Dunkeln.
      HINWEIS: Die verwendeten Alkaloide sind hochgiftig. Treffen Sie Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit den Standardproben. Alle Lösungen wurden frisch vor der Analyse vorbereitet und bei 4 °C im Dunkeln gelagert, um Zerfall zu vermeiden.
  2. Herstellung gemischter Arbeitslösungen
    1. Pipettieren Sie 100 μL jeder genannten Grundlösung in eine 10-mL Volumenkolben und verdünnen Sie auf die markierte Linie mit chromatographischem Methanol, um eine gemischte Standardzwischenlösung von 10 μg/mL herzustellen.
    2. Gemäß den Anforderungen des linearen Bereichs wird die Zwischenlösung schrittweise mit Methanol weiter verdünnt, um eine Reihe gemischter Arbeitslösungen zu erhalten.
    3. Nehmen Sie jeweils 50 μL, 200 μL und 500 μL. Erziele Konzentrationen von 0,5 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL und 10 μg/mL. Frisch vorbereiten, bevor man es verwendet.
    4. Übertragen Sie 100 μL der 10 μg/mL Zwischenlösung in einen 1 ml großen Volumenkolben, um eine 1 μg/mL verdünnte Lösung herzustellen.
    5. Dann werden 100 μL der 1 μg/mL Lösung in einen weiteren 1-mL Volumenkolben übertragen und mit Methanol auf das Volumen verdünnt.
  3. Beispiel-Vorbehandlung
    1. Führen Sie das Gefriertrocknen von frischen Materialien von Sophora flavescens durch und pulverisieren Sie anschließend mit einer Hochgeschwindigkeitsmühle zu einem homogenen Pulver.
    2. Siebe das Pulver durch ein 0,25-mm-Standardtestsieb. Wiegen Sie genau 20 mg dieses Pulvers, geben Sie es in eine 100-ml-Volumenkolben und fügen Sie chromatographisches Methanol nahe der markierten Linie hinzu.
    3. Führen Sie eine Ultraschallextraktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten durch. Nach der Extraktion nehmen Sie den Volumenkolben heraus, lassen Sie ihn bei Raumtemperatur auf 25 °C abkühlen, füllen chromatographisches Methanol bis zur markierten 100-mL-Linie auf und mischen Sie sich 2 Minuten lang vortex.
    4. Pipettieren Sie 1 ml des oben genannten Extrakts in eine 100-ml-Volumenkolben und verdünnen Sie auf die markierte Linie mit Methanol (100-fache Verdünnung). Nach gutem Schütteln dient es als Mutterlösung für die HPLC-Injektion (Abbildung 2).
      HINWEIS: Beim Betrieb der Hochgeschwindigkeitsschleifmaschine ist es unerlässlich, Schutzbrillen und eine Staubmaske zu tragen; Kontrolliere die Mahlmenge und -dauer, um Überhitzung zu vermeiden.
  4. Probenfiltration und -lagerung
    1. Bereiten Sie eine 1 ml einwegnadelfreie Spritze (chromatographie-spezialisiert, nicht adsorptiv) und eine 0,22 μm organische Mikroporöse Membran vor.
    2. Aspiriere 1,2 ml der Mutterlösung zur Injektion und drücke langsam zur Filtration.
    3. Sammeln Sie das anschließende Filtrat in ein 2-mL-Probefläschchen mit einem Inneneinsatz und schließen Sie es fest mit einer Kappe ab.
      HINWEIS: Die Frequenz des Ultraschallreinigers ist auf 40 kHz festgelegt. Vermeiden Sie das Lockern des Volumenkolbendeckels während der Extraktion, um eine Verflüchtigung durch Lösungsmittel zu verhindern. Passen Sie den Verdünnungsfaktor entsprechend der Spitzenantwort der Stichprobe im Vorexperiment an, um sicherzustellen, dass die Zielspitzenfläche im linearen Bereich der Standardkurve liegt. Alle Proben müssen sofort im Kühlschrank bei 4 °C gelagert werden.

2. HPLC-Vorlauf, Methodenaufbau und MS-Übernahme

  1. Vorbereitung mobiler Phasen
    1. Bereite mobile Phase A vor: Messe 1000 mL ultrareines Wasser ab, gib 1,0 mL chromatographische Ameisensäure (Volumenanteil: 0,1 % v/v) hinzu und mische 10 Minuten lang gleichmäßig mit einem magnetischen Rührer.
    2. Bereite mobile Phase B vor: Verwenden Sie chromatographisches Methanol direkt ohne zusätzliche Behandlung.
    3. Die mobilen Phasen A und B werden jeweils in Ultraschallentgasungsgeräte gegossen und 15 Minuten lang mit 40 kHz Ultraschallentgasung durchgeführt.
    4. Übertragen Sie die entgasten mobilen Phasen nach der Entgasung sofort auf Lösungsmittelflaschen, versiegeln Sie sie und verbinden Sie sie mit den entsprechenden A- und B-Lösungsmittelleitungen des HPLC-Systems.
      HINWEIS: Alle Lösungsmittel sind chromatographischer Qualität und müssen vor der Verwendung durch eine 0,45 μm organische mikroporöse Membran gefiltert werden. Überwachen Sie den Systemdruck regelmäßig. Wenn die Druckschwankung ±±5 % übersteigt, prüfe auf mögliche Säulenverstopfungen oder Luftblasen in der Pipeline.
  2. Festlegung der HPLC-Bedingungen
    1. Verwenden Sie eine C₁₈-Säule (2,1 mm × 100 mm, 2,7 μm) für die chromatographische Trennung. Die Säule mit Methanol:Wasser = 80:20 (v/v) für 30 Minuten vor der Nutzung ausgleichen, mit einer Durchflussrate von 0,3 mL/min während der Gleichgewichtung. Stellen Sie die Temperatur des Säulenofens auf 30 °C ein und beginnen Sie 10 Minuten im Voraus mit dem Vorheizen.
    2. Optimieren Sie ein Gradienten-Elutionsprogramm wie folgt: 0–10,0 Min, 5 % bis 10 % B; 10,0–15,0 Min, 10 % bis 35 % B; 15,0–20,0 Min, 35 % bis 60 % B; 20,0–25,0 Min, 60 % bis 95 % B. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,60 mL/min, das Einspritzvolumen auf 2 μL und die Detektionswellenlänge auf 210 nm ein.
  3. Massenspektrometrische Bedingungen
    1. Durchführung von Massenspektrometrie-(MS)-Detektion mit einem Triple-Quadrupol-(QQQ)-Massenspektrometer, das mit einer Elektrosprüh-Ionisationsquelle (ESI) im positiven Ionisationsmodus (ESI+) betrieben wird.
    2. Stellen Sie die Betriebsparameter wie folgt ein: Verneblerdruck: 15 psi; Kapillarspannung: 4000 V; Gastemperatur: 300 °C; und Gasdurchfluss: 11 L/min.
    3. Optimiert systematisch die MS/MS-Parameter für jeden Analyten.
      1. Erstens: Identifizieren Sie Vorläuferionen, indem Sie einzelne Standardlösungen direkt im MS2-SCAN-Modus infusieren.
      2. Optimieren Sie die Fragmentorspannung für jedes Vorläufer-Ion auf maximale Signalintensität im MS2-SIM-Modus.
      3. Anschließend wird der Produktionenscan-Modus verwendet, um die charakteristischen Produktionen zu bestimmen. Systematische Optimierung der Kollisionsenergie (CE) für das Vorläuferion, um die Produkt-Ionen-Signalintensität zu maximieren.
      4. Wählen Sie das intensivste Produktion zur Quantifizierung aus und verwenden Sie das zweitintensivste Ion zur qualitativen Bestätigung.
        HINWEIS: Identifizieren Sie Vorläuferionen durch direkte Infusion einzelner Standardlösungen im MS2-SCAN-Modus. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration der Standardlösung angemessen ist, um eine Signalsättigung zu vermeiden. Kalibrieren Sie das Instrument regelmäßig, um Parameterabweichungen zu vermeiden.
  4. Methodenvalidierung
    1. Spezifität
      1. Injizieren Sie Blanklösungsmittel (Methanol), gemischte Standardarbeitslösung und Probeextrakt separat und vergleichen Sie die Chromatogramme.
      2. Stellen Sie sicher, dass folgende Anforderungen erfüllt sind: Keine störenden Spitzen im Blanklösungsmittel; Die Retentionszeit der Zielkomponenten in der Probe entspricht der des Standards (Abweichung ≤ ±±0,1 Min); Das Spitzenflächenverhältnis von Quantor-Ion zu Qualifikator-Ion entspricht dem des Standards (Abweichung ≤ ±±10%).
    2. Linearität
      1. Injizieren Sie die Reihe der gemischten Arbeitslösungen, die in Schritt 1.1 (0.1, 0.5, 2, 5, 10 μg/mL) hergestellt wurden, nacheinander unter den genannten HPLC-MS-Bedingungen mit 3 Injektionen pro Konzentration.
      2. Zeichnen Sie die Standardkurve mit der Konzentration (x, μg/mL) jeder Komponente als Abscissa und der durchschnittlichen Spitzenfläche (y) des Quantor-Ions als Ordinat. Führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, wobei ein Korrelationskoeffizient (R2) ≥ 0,995 erforderlich ist.
    3. Präzision und Genauigkeit
      1. Intraday-Präzision (Wiederholbarkeit): Analysieren Sie 6 Replikate von Qualitätskontrollproben (QC) bei drei Konzentrationsniveaus (2 μg/mL, 5 μg/mL und 10 μg/mL) innerhalb eines Tages und berechnen Sie die relative Standardabweichung (RSD%).
      2. Interday-Präzision (mittlere Präzision): Unabhängige Herstellung von QC-Proben aus derselben Charge getrockneten Pflanzenrohmaterials und Analyse durch verschiedene Bediener an drei aufeinanderfolgenden Tagen. und berechnet RSD%. Stellen Sie sicher, dass RSD% ≤ 10 % für beide Fälle sind.
      3. Bewerten Sie die Genauigkeit mit einem Spike-Recovery-Test und drücken Sie sie als Erholungsrate (%) aus. Stellen Sie sicher, dass die durchschnittliche Rückgewinnungsrate bei niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen zwischen 85 % und 115 % liegt, wobei RSD-% ≤ 5 % liegen.
        HINWEIS: Der lineare Bereich muss den erwarteten Konzentrationsbereich der Zielkomponenten in tatsächlichen Proben (einschließlich niedriger, mittlerer und hoher Konzentration) abdecken, um die praktische Anwendbarkeit widerzuspiegeln. Alle Validierungsexperimente wurden dreifach durchgeführt, und die Ergebnisse wurden als Durchschnittswert angegeben.

3. Datenerfassung

  1. Führen Sie Datenerfassung im Mehrfachreaktionsüberwachungsmodus (MRM) durch. Siehe Tabelle 1 für die optimierten MRM-Parameter – einschließlich Vorläuferion, Produktionenübergänge, Fragmentorspannung und Kollisionsenergie (CE) – für jeden Analyten.
  2. Berechnen Sie die Verweilzeit, um eine ausreichende Anzahl von Datenpunkten über jeden chromatografischen Peak für jeden Übergang sicherzustellen, während eine angemessene Zykluszeit beibehalten wird.

4. Datenanalyse

  1. Starten Sie die qualitative Analysesoftware, klicken Sie auf Datei > Daten importieren und importieren Sie alle gesammelten Datendateien (.d-Format).
  2. Extraktion extrahierter Ionenchromatogramme (EICs): Im Quantitationsmodul wählen Sie MRM Transition, geben die Vorläuferionen-Produkt-Ionenpaare jeder Komponente ein und extrahieren die entsprechenden EICs.
  3. Peak-Validierung und Integration: Überprüfen Sie die Peak-Symmetrie und die Konsistenz der Retentionszeit (Abweichung ≤ ±±0,1 Minuten im Vergleich zum Standard) der Zielpeaks in jedem EIC.
  4. Die Software führt standardmäßig eine automatische Integration durch; Wenn Basisdrift- oder Störspitzen bestehen, passen Sie die Integrationsparameter (Integrationsstart- und Endpunkte) manuell an, um eine genaue Integration sicherzustellen.
  5. Berechnen Sie die Konzentration jeder Komponente in unbekannten Proben mit der Standardkurve. Klicken Sie auf Bericht > Bericht generieren, wählen Sie das Excel-Format, um den Bericht zu exportieren. Der Bericht enthält den Verbindungsnamen, die Retentionszeit, die Spitzenfläche, die Konzentration, RSD% usw.

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Ergebnisse

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HPLC-QQQ-MS chromatographische Trennung und Identifikation von TAs
Ein typisches MRM-Chromatogramm, das aus der Analyse einer Standardmischung und eines A.tanguticus-Wurzelextrakts gewonnen wird, ist in Abbildung 3 und Abbildung 4 dargestellt. Unter den optimierten HPLC-Bedingungen wurden alle drei Zieltropanalkaloide: Hyoscyamin, Anisodamin und Scopolamin, innerhalb von 20 Minuten erfolgreich getren...

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Diskussion

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Mit dem wachsenden Interesse an sekundären Pflanzenmetaboliten haben analytische Techniken zur Alkaloiddetektion erhebliche Aufmerksamkeit erregt. Obwohl ein grundlegendes chromatographisches System zur Analyse von Tropanalkaloiden (TAs) etabliert wurde18, unterstreichen jüngste Fortschritte wie die Einführung der Kapillarelektrophorese (CE), verbesserte instrumentelle Leistungsfähigkeit bei GC–MS und HPLC–MS sowie die Identifikation neuartiger Strukturverbindunge...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wird von der Provinzverwaltung für traditionelle chinesische Medizin in Sichuan (Nr. 2024MS562) und dem Xinglin-Talentprogramm der Chengdu-Universität der TCM (Nr. MPRC2022035). Wir haben die Unterstützung des Innovativen Instituts für Chinesische Medizin und Pharmazie, der Chengdu Universität für Traditionelle Chinesische Medizin, sehr geschätzt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agilent MassHunter SoftwareAgilent Technologies
Agilent ZORBAX SB-C18-SäuleAgilent Technologies880975-902C18-Reversed-Phase-Säule, 4,6 × 250 mm, 5 µm
Anisodamin-HydrobromidChengdu glip Biotechnology Co., Ltd101-31-5HPLC>98%
AmeisensäureSigma-Aldrich5.33002
LyophilisatorEYELA, Tokyo, JapanFDU-2110
Hochgeschwindigkeits-UniversalmühleTaisite Instrument Co., Ltd., Tianjin, China6010210100FW-100, 24.000 U/min, 100 g Kapazität, 80 Mesh
HyoscyaminChengdu glip Biotechnology Co., Ltd55449-49-5HPLC>98%
MethanolThermo Fisher Scientific022909.K2
Mikroporöse Membran 0,22 μmMilliporeSLGV033RB
Milli-Q Direct 8 WassersystemMilliporeSigma, Burlington, MA, USAZRQSVP0JP
Skopolamin-HydrobromidChengdu glip Biotechnology Co., Ltd114-49-8HPLC>98%

Referenzen

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