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Methodenartikel

Entstehung und einzellige transkriptomische Analyse von hepatozellulären Karzinom-Organoiden nach medikamentöser Behandlung

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DOI:

10.3791/70511

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26. Mai 2026

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Erzeugung von hepatozellulären Karzinom-Organoiden, zur Anwendung einer medikamentösen Behandlung und zur Durchführung einer Einzelzell-RNA-Sequenzierung vor und nach der Behandlung, um therapieassoziierte transkriptionale Veränderungen zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Das hepatozelluläre Karzinom ist weltweit eine Hauptursache für krebsbedingte Sterblichkeit und zeichnet sich durch eine ausgeprägte intratumorale Heterogenität aus, die zu variablen Behandlungsreaktionen, Tumorrückfällen und Krankheitsprogression beiträgt. Ein tieferes Verständnis darüber, wie sich Tumorzellen auf Transkriptionsebene vor und nach der Behandlung verändern, ist daher unerlässlich, um therapeutische Strategien zu verbessern. Praktische experimentelle Arbeitsabläufe, die organoidbasierte Arzneimittelbehandlung mit nachgelagertem Single-Cell-Transkriptom-Profiling verbinden, bleiben jedoch begrenzt. In dieser Studie wird ein standardisierter Workflow zur Erzeugung von hepatozellulären Karzinom-Organoiden, zur Anwendung definierter medikamentöser Behandlung und zur Durchführung von Einzelzell-RNA-Sequenzierungen an vor und nach der Behandlung entnommenen Proben entwickelt. Das Protokoll umfasst die Wiederbelebung und Expansion von Organoiden, die Qualitätsbewertung vor der Behandlung, die Medikamentenexposition, die Vorbereitung von Organoiden zur Einzelzell-Dissoziation, den Aufbau einer Bibliothek sowie eine grundlegende vergleichende Analyse einzelzelliger Transkriptomdaten. Kritische technische Vorsichtsmaßnahmen werden getroffen, um die Reproduzierbarkeit und Probenqualität zu verbessern. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht eine parallele Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung und der transkriptionellen Veränderungen im Zusammenhang mit der medikamentösen Behandlung bei hepatozellulären Karzinom-Organoiden. Das Protokoll ist robust, skalierbar und anpassungsfähig über verschiedene organoide Systeme hinweg und bietet eine praktische Plattform, um behandlungsassoziierte Genexpressionsänderungen bei Einzelzellauflösung zu untersuchen.

Einleitung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist der häufigste primäre Leberkrebs bei Erwachsenen und weltweit eine Hauptursache krebsbedingter Todesfälle 1,2,3. Das schlechte klinische Ergebnis ist auf eine signifikante intratumorale Heterogenität zurückzuführen, die zu Behandlungsresistenz und Rückfällenführt. Eine aktuelle Studie zeigt, dass Entwicklungsvielfalt und Zellzustandsplastizität, angetrieben durch wichtige Transkriptionsprogramme wie die FOXM1/CEBPB-Achse, zur therapeutischen Resistenz in HCC5 beitragen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit zu verstehen, wie Tumorzellpopulationen sich unter anhaltendem Behandlungsdruck anpassen und zwischen Zuständen übergehen. Die meisten präklinischen Modelle erfassen jedoch nicht ausreichend die dynamische, kontinuierliche Natur dieser behandlungsassoziierten Zustandsübergänge, was die mechanistische Untersuchung der Tumoranpassung und des therapeutischen Versagens einschränkt.

Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) bieten für diesen Zweck eine nützliche Plattform, da sie wichtige genomische Veränderungen und zelluläre Heterogenität des ursprünglichen Tumors6 erhalten. HCC-Organoide können in Langzeitkultur erhalten bleiben, während wichtige Gewebemerkmaleerhalten bleiben 7, was sie besonders geeignet für Behandlungs-Wirkungs-Studien macht. Darüber hinaus haben organoidbasierte Studien die Machbarkeit der Verwendung von Leberkrebsorganoiden für Medikamententests und zur Erfassung interpatienter und intratumoraler Unterschiede in der therapeutischen Sensitivität gezeigt, was ihren Wert als präklinische Modelle für die Behandlungs-Response-Forschunguntermauert 8,9. Die meisten organoidbasierten Arzneimittelstudien stützen sich jedoch weiterhin hauptsächlich auf Endpunkt-Viabilitätsmessungen oder konzentrieren sich hauptsächlich auf bulk-phänotypische Reaktionen, wodurch nur begrenzte Informationen über heterogene zelluläre Antworten und behandlungsassoziierte transkriptionelle Veränderungen geliefert werden. Parallel dazu unterstreicht die rasche Entwicklung RNA-basierter therapeutischer Strategien für HCC zusätzlich die Notwendigkeit präklinischer Systeme, die Behandlungsantworten bei Einzelzell-Auflösung10 genau vorhersagen und mechanistisch analysieren können.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglicht eine hochauflösende Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung und der Transkriptionszustände innerhalb von Organoidmodellen11. Wird scRNA-seq auf vor und nach der Behandlung gesammelte Organoide angewendet, kann es Veränderungen in der Genexpression, Veränderungen in Zellpopulationen und heterogene Reaktionen aufzeigen, die nicht durch Massenanalysen erfasst werden. Dieser Ansatz stellt daher eine praktische und wirkungsvolle Strategie zur Untersuchung therapieassoziierter transkriptioneller Remodellierung bei HCC-Organoiden dar. Ein praktischer, reproduzierbarer Workflow, der HCC-Organoidkultur, medikamentöse Behandlung sowie vor- und nachbehandlungsbasierte Einzelzell-RNA-Sequenzierung integriert, fehlt jedoch. Ein solcher Arbeitsablauf ist am effektivsten, wenn die Integrität der Organoide während der Arzneimittelexposition erhalten bleibt und genügend lebensfähige Zellen für nachgelagerte Einzelzellprofilierungen wiederhergestellt werden. Wie bei anderen organoidbasierten Ansätzen sind wichtige Einschränkungen eine unvollständige Darstellung stromaler, vaskulärer und immuner Komponenten der Tumor-Mikroumgebung sowie ein möglicher Selektionsfehler bei längerer In-vitro-Kultur.

Ein integrierter experimenteller Workflow wird beschrieben, um HCC-Organoide zu erzeugen, definierte medikamentöse Behandlungen anzuwenden und organoide Proben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung vor und nach der Behandlung zu verarbeiten. Dieser Arbeitsablauf umfasst die Wiederbelebung und Expansion von Organoiden, die Qualitätsbewertung vor der Behandlung, kontrollierte Arzneimittelexposition sowie die nachgelagerte Sequenzierung von abgestimmten Proben durch einzelne Zell-RNA. Der Ansatz bietet einen praktischen Rahmen für den Vergleich bei Einzelzellauflösung behandlungsassoziierte Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung und Genexpressionsprogrammen in HCC-Organoiden.

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Protokoll

Studien mit menschlichem Gewebe wurden von den Komitees für ethische Überprüfung der Forschung der Guangzhou Medical University überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer GYZL-2024-KY31). Alle Verfahren mit menschlichen Proben wurden gemäß den institutionellen Richtlinien für die Forschung am Menschen durchgeführt. Von allen Patienten wurde eine schriftliche informierte Zustimmung für die Verwendung ihrer klinischen Proben für medizinische Forschung eingeholt. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Dieser Arbeitsablauf umfasst die Wiederherstellung und Erweiterung von kryokonservierten hepatozellulären Karzinom-Organoiden, mit geringfügigen Anpassungen für nachgelagerte therapeutische Störungen und Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Ziel ist es, Organoidkulturen von ausreichender Qualität und Konsistenz für nachfolgende Arzneimittelbehandlungsexperimentezu erzeugen 12.

1. Etablierung und Ausweitung von HCC-Patienten-abgeleiteten Organoiden

  1. Auftauen und Bergung kryopreservierter Organoide
    1. Zubereitung vor dem Auftauen
      1. Ein Wasserbad auf 37 °C vorwärmen. Eine 24-Well-Platte mindestens 1 Stunde in einem 37 °C-Inkubator vorausgleichen, bevor sie anplattiert wird.
      2. Bereiten Sie im Voraus ein vollständiges Organoid-Kulturmedium vor und bewahren Sie den Basalmembranextrakt (BME) bis zur Anwendung auf Eis auf. Die Zusammensetzung des vollständigen Organoid-Kulturmediums ist in Ergänzungstabelle 1 dargestellt.
    2. Auftauen von Organoiden
      1. Entferne Kryoviale mit gefrorenen HCC-Organoiden aus dem Flüssigstickstofflager und lege sie sofort in ein 37 °C Wasserbad.
      2. Bewegt das Fläschchen vorsichtig und stoppt das Auftauen, wenn nur noch ein kleiner Eiskristall übrig bleibt.
    3. Entfernung des Kryoprotektors
      1. Pipette die aufgetaute Suspension vorsichtig einmal, um den Inhalt wieder aufzuhängen.
      2. Übertragen Sie die Suspension in ein 15 ml konisches Rohr mit 3–5 ml vollständigem Organoid-Kulturmedium.
      3. Zentrifugiere mit 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Saugen Sie vorsichtig ein und entsorgen Sie das Überlagermittel, ohne das Pellet zu stören.
  2. Einbettung und Neubeschichtung von Organoiden
    1. Herstellung der Rückgewinnungsmischung
      1. Das organoide Pellet wird in einem vollständigen organoiden Kulturmedium wieder suspendiert. Die Zusammensetzung des vollständigen Organoid-Kulturmediums ist in Ergänzungstabelle 1 dargestellt.
      2. Mischen Sie vorsichtig mit einem gleichen Volumen eiskalten BME, um die Anrichtmischung zu erzeugen.
        HINWEIS: Halten Sie die Mischung auf Eis, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern.
    2. Panzerung organoider Kuppeln
      1. Geben Sie 50 μL des Organoid-Matrix-Gemisch in jede Mulde einer vorgewärmten 24-Well-Platte.
      2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten, um die Matrixverfestigung zu ermöglichen.
      3. Fügen Sie 500 μL vollständiges organoides Kulturmedium hinzu, ergänzt mit 20 μM Y-27632, zu jedem Bohrloch entlang der Wand des Bohrlochs.
        HINWEIS: Beschränken Sie die Nutzung von Y-27632 auf die ersten 2–3 Tage nach Auftauen oder Durchlaufen. Stellen Sie sicher, dass jede Kuppel kompakt bleibt und am Boden des Brunnens befestigt bleibt, ohne sich nach außen auszubreiten.
  3. Organoidkultur und -ausbreitung
    1. Bedingungen der Erholungskultur
      1. Organoide bei 37 °C mit 5 %CO2 halten.
      2. Verwenden Sie in den ersten 2–3 Tagen nach dem Auftauen ein Medium mit 20 μM Y-27632.
    2. Medium-Ersatz
      1. Ersetze das Kulturmedium alle 3–4 Tage mit sanfter Aspiration.
      2. Fügen Sie frisches Medium entlang der Wand jedes Bohrlochs hinzu, um eine Störung der Matrizenkuppeln zu vermeiden.
      3. Halten Sie in allen Bohrlöchern innerhalb desselben Experiments denselben Medium-Ersatzplan bei.
    3. Wachstumsüberwachung
      1. Überwachen Sie die Wiederherstellung und Expansion der Organoide mit einem Hellfeldmikroskop mit konstanten Bildeinstellungen.
      2. Zeichnen Sie repräsentative Bilder zu definierten Zeitpunkten während der Erholung und Expansion auf.
      3. Bestätigen Sie eine erfolgreiche Wiederherstellung, wenn die Mehrheit der Strukturen intakt bleibt, Organoide eine runde bis ovale Morphologie mit glatten Rändern aufweisen, eine fortschreitende Vergrößerung im Laufe der Zeit beobachtet wird und minimale Ablagerungen oder kollabierte Strukturen vorhanden sind.
      4. Bohrungen mit weniger als 10 intakten Organoiden werden von der nachgelagerten quantitativen Analyse ausgeschlossen.
    4. Verabschiedungs- und Erweiterungskriterien
      1. Passageorganoide nach stabiler Expansion werden beobachtet.
      2. Stabile Ausdehnung durch reproduzierbare Zunahmen der Organoidgröße oder der Gesamtfläche mit erhaltener Morphologie zu bestätigen.
      3. Verwenden Sie konsistente Bildabdrucksintervalle, Vergrößerungs- und Einschlusskriterien in allen Experimenten.
      4. Erstellen Sie repräsentative Wachstumskurven basierend auf der Organoidfläche oder Zählungen, um die Stabilität zu bestätigen.
    5. Kriterien für nachgelagerte Experimente
      1. Verwenden Sie organoide Linien, die stabiles dreidimensionales Wachstum zeigen, keine Kontamination oder ausgedehnte Kollaps zeigen und ausreichend Ertrag für parallele experimentelle Bedingungen bieten.
      2. Kulturen werden mindestens 7–10 Tage nach dem Auftauen oder bis zum Abschluss der Erholung und einem Expansionszyklus aufbewahrt.
      3. Führen Sie nur organoide Linien vor, die eine konsistente Morphologie über Replikationsbrunnen hinweg zeigen.

2. Herstellung von Organoiden für therapeutische Störungen

  1. Qualitätsbeurteilung vor der Behandlung
    1. Morphologiebasierte Bewertung
      1. Bestätigen Sie, dass die Organoide rund bis oval in der Morphologie sind.
      2. Bestätigen Sie, dass Organoide glatte und klar definierte Ränder zeigen.
      3. Überprüfen Sie minimale Zellrückstände in der Kuppel.
      4. Kulturen mit umfangreicher Fragmentierung, dunkler Lumen, weit verbreitetem Kollaps oder offensichtlicher Kontamination werden ausgeschlossen.
    2. Ausdehnungszustandsbewertung
      1. Verwenden Sie nur Organoidkulturen, die sich vollständig erholt und stabil ausgebaut haben.
      2. Bestätigen Sie eine fortschreitende Vergrößerung im Laufe der Zeit.
      3. Bestätigen Sie die konsistente Morphologie über die Replikationsbrunnen.
  2. Neubeschichtung von Organoiden zur medikamentösen Behandlung
    1. Rückgewinnung von Organoiden aus der Matrix
      1. Organoide Kuppeln auf Eis mit 1 ml eiskalter Zellrückgewinnungslösung pro Bohrloch für 15–20 Minuten auflösen.
      2. Pipette während der Inkubation alle 5 Minuten sanft.
      3. Zentrifugieren Sie die zurückgewonnene Suspension bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
      4. Das Pellet wird in einem vollständigen organoiden Kulturmedium neu suspendiert.
    2. Standardisierung vor Neubeschichtung
      1. Standardisieren Sie die anfängliche Organoidlast in den Brunnen vor der medikamentösen Behandlung.
      2. Bestimme die lebensfähige Zellanzahl nach partieller Dissoziation, wenn möglich.
      3. Normalisiere die Proben auf die gleiche Anzahl von Eingabezellen pro Well.
      4. Platte etwa 1.000–5.000 lebensfähige Zellen pro Bohrloch in einem 24-Well-Format.
      5. Wenn keine direkte Zellzählung durchgeführt wird, normalisieren Sie die Normierung, indem eine vergleichbare Anzahl morphologisch intakter Organoide pro Bohrloch und eine ähnliche Größenverteilung über die Gruppen hinweg gewährleistet wird.
      6. Erfassen Sie die anfängliche Anzahl der Organoiden und die Ausgangsmorphologie jedes Brunnens vor der Behandlung.
      7. Verwenden Sie identische Einschlusskriterien und Beschichtungsstrategien für alle Brunnen innerhalb desselben Experiments.
    3. Neubeschichtung zur medikamentösen Behandlung
      1. Mischen Sie gewonnene Organoide mit eiskalten Basalmembranmatrix bei einer Endkonzentration von 30 %–50 %.
      2. Dosieren Sie 50-μL-Kuppeln in jede Mulde einer 24-Well-Platte.
      3. Inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten, um die Polymerisation zu ermöglichen.
      4. Fügen Sie pro Bohrloch entlang der Wand des Brunnens 500 μL vollständige Organoidkultur hinzu.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass jede Kuppel kompakt bleibt und am Boden des Brunnens befestigt ist, ohne sich nach außen auszubreiten. Verwenden Sie identisches Kuppelvolumen und die Matrixkonzentration in allen Bohrlöchern desselben Experiments.
  3. Genesung vor der Medikamentenbehandlung
    1. Bergung nach Neubeschichtung
      1. Organoide können sich unter normalen Kulturbedingungen über Nacht erholen.
      2. Die Behandlung wird erst eingeleitet, nachdem die intakte Morphologie in neu plattierten Kuppeln wiederhergestellt wurde.
    2. Zugangskriterien für die Arzneimittelbehandlung
      1. Die medikamentöse Behandlung wird nur eingeleitet, wenn die Organoide nach der Neubeschichtung intakt bleiben, kein weitverbreiteter Kollaps oder übermäßiger Ablagerungen vorhanden sind und die Organoidbelastung in allen Brunnen vergleichbar ist.
      2. Zeichnen Sie vor der Behandlung Ausgangsbilder von Hellfeldbildern für alle experimentellen Gruppen auf.
      3. Behalten Sie die identische Anfangsbelastung des organoiden Organismus, die Erholungszeit nach der Neubeschichtung und die Behandlungsbeginnzeit über alle Kontroll- und Behandlungsbrunnen hinweg.
  4. Sicherheitsaspekte
    1. Führen Sie alle Verfahren mit menschlich abgeleiteten Organoiden unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und Biosicherheitsmaßnahmen durch.
    2. Behandle enzymatische Dissoziationsreagenzien vorsichtig, um Haut- oder Augenexposition zu vermeiden.
    3. Entsorgen Sie flüssige und feste biologische Abfälle gemäß institutionellen Biosicherheitsvorschriften.

3. Medikamentöse Behandlung von HCC-Organoiden

  1. Medikamentenvorbereitung und -behandlung
    1. Arzneimittelzubereitung
      1. Bereiten Sie die Lenvatinib-Fondlösung in DMSO gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
      2. Verdünnen Sie die Fondlösung in vorerwärmtem Kulturmedium unmittelbar vor der Verwendung auf die vordefinierte Arbeitskonzentration.
      3. Halten Sie die gleiche End-DMSO-Konzentration in allen Bohrlöchern (≤ 0,1 %).
      4. Bereiten Sie genügend Volumen vor, um in jedem Bohrloch ein gleiches Endbehandlungsvolumen zu gewährleisten.
    2. Drogenbehandlung
      1. Fügen Sie Lenvatinib-haltiges Medium (20 μM) entlang der Wand jedes Bohrlochs hinzu, um Störungen der Matrizenkuppeln zu vermeiden.
      2. Fügen Sie eine Fahrzeugsteuerung mit derselben endgültigen DMSO-Konzentration hinzu.
      3. Organoide unter Standardkulturbedingungen für die vordefinierte Behandlungsdauer inkubieren.
      4. Ersetzen Sie das medikamentenhaltige Medium alle 48–72 Stunden für Behandlungsdauern länger als 72 Stunden.
      5. Verwenden Sie denselben Medium-Ersatzplan für alle Brunnen im Experiment.
      6. Zeichnen Sie vor der Behandlung Basisbilder von Hellfeldbildern auf.
      7. Aufnahmen Sie Bilder in festen Abständen während der Behandlung mit identischen Mikroskopeinstellungen, Vergrößerungen und Feldpositionen.
  2. Bewertung der Behandlungsreaktion
    1. Morphologiebasierte Bewertung
      1. Bewerten Sie die Behandlungsansprache anhand folgender bildbasierter Anzeigen: Wachstumskurve der Organoidfläche, mittlerer Organoiddurchmesser und überlebende Organoidzahl.
      2. Verwenden Sie für alle Bilder identische Belichtungseinstellungen, Vergrößerungs- und Analyseschwellen.
      3. Messen Sie die Wachstumskurve der Organoidflächen, indem Sie die gesamte Organoidfläche pro Bohrloch oder Feld zu jedem Zeitpunkt berechnen und auf die Ausgangslinie normalisieren.
      4. Messen Sie den mittleren Organoiddurchmesser, indem Sie den Durchmesser einzelner intakter Organoide bestimmen und den Mittelwert pro Bohrloch berechnen.
      5. Bestimmen Sie die erhaltene Anzahl der organoiden Organoide, indem morphologisch identifizierbare intakte Organoide gezählt und Trümmer sowie kollabierte Fragmente ausgeschlossen werden.
    2. Optionale Viabilitätsmessung
      1. Führen Sie am Behandlungsendpunkt eine dreidimensionale Lumineszenz-Viabilitätsanalyse durch, falls eine zusätzliche Bestands-Viabilitätsbewertung erforderlich ist.
      2. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Durchführung des Assays.
  3. Datenanalyse
    1. Zeichnen Sie die Wachstumskurven der organoiden Fläche über die Zeit auf.
    2. Vergleichen Sie den mittleren organoiden Durchmesser zwischen vehikel- und lenvatinib-behandelten Gruppen.
    3. Vergleichen Sie die Anzahl überlebender organoider Organismen zwischen den Behandlungsgruppen.
    4. Wenden Sie identische Bildaufnahmepläne, Organoid-Einschlusskriterien und Analyseparameter für alle Gruppen an, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

4. Herstellung von Organoiden für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

  1. Selektion und Rückgewinnung von Organoiden
    1. Prä-Dissoziationsbewertung
      1. Wählen Sie organoide Brunnen aus, die eine intakte dreidimensionale Morphologie ohne weitverbreiteten Kollaps aufweisen, ausreichend Material für den nachgelagerten Einzellfang enthalten und keine offensichtliche Kontamination aufweisen.
      2. Sammeln Sie Organoide zu übereinstimmenden experimentellen Zeitpunkten über Kontroll- und behandelte Proben.
      3. Halten Sie die identische Beschichtungsdichte, den Behandlungsplan und die Medium-Ersatzbedingungen über die Proben hinweg aufrecht.
      4. Zeichnen Sie Hellfeldaufnahmen jeder ausgewählten Personen lange vor der Dissoziation mit identischen Mikroskopeinstellungen, Vergrößerungs- und Feldauswahlkriterien auf.
    2. Entfernung der Matrix
      1. Aspiratiere das Kulturmedium vollständig aus jedem Brunnen.
      2. Waschen Sie jeden Behälter zweimal mit eiskalten PBS, um Rückstände und Schmutz zu entfernen.
      3. Fügen Sie jedem Bohrloch 1 ml Eiskaltezell-Rückgewinnungslösung hinzu.
      4. 20–30 Minuten auf Eis bebrüten.
      5. Während der Inkubation werden alle 5–7 Minuten sanft gepipettiert, um die Matrixauflösung zu erleichtern.
      6. Das gelöste Material wird in vorgekühlte Röhren mit einer breiten oder geschnittenen Pipettenspitze übertragen, um die Scherspannung zu minimieren.
      7. Die enzymatische Dissoziation wird erst dann durchgeführt, wenn die Matrix weitgehend gelöst ist und nur minimale sichtbare Gelreste übrig sind.
  2. Enzymatische Dissoziation und Einzelzell-Suspensionsvorbereitung
    1. Enzymatische Dissoziation
      1. Zentrifugieren Sie die gewonnene Organoid-Suspension bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
      2. Entfernen Sie das Überlagermittel vorsichtig, ohne das Pellet zu stören.
      3. Das Pellet wird in 1 ml rekombinantem Zelldissoziationsenzym wieder suspendiert.
      4. Inkubieren Sie bei 37 °C für 5–10 Minuten.
      5. Pipette vorsichtig 8–10 Mal alle 2–3 Minuten mit einer breiten P1000-Spitze, um die Dissoziation zu fördern.
      6. Die Verdauung wird gestoppt, wenn die meisten organoiden Fragmente in Einzelzellen verteilt sind und nur noch kleine Restcluster übrig bleiben.
      7. Vermeiden Sie eine verlängerte Verdauung, um eine verringerte Zelllebensfähigkeit, stressassoziierte Transkriptionsartefakte und eine erhöhte RNA-Kontamination in der Umgebung zu verhindern.
    2. Abschrecken und Filtration
      1. Fügen Sie 4 ml eiskaltes PBS mit 2 % fetalem Rinderserum hinzu, um die Verdauung zu stoppen.
      2. Filtern Sie die Suspension durch ein 40 μm Zellsieb.
      3. Waschen Sie einmal mit PBS, um Restenzyme, Aggregate und Ablagerungen zu entfernen.
      4. Führen Sie eine Lyse der roten Blutkörperchen durch, wenn eine Erythrozytenkontamination vorliegt, und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
    3. Zellvorbereitung und Qualitätskontrolle
      1. Zähle die Zellen mit Trypan-Blue-Ausschluss.
      2. Bestimmen Sie die Zelllebensfähigkeit vor der Vorbereitung der Bibliothek.
      3. Verwenden Sie nur Proben mit Viabilität ≥ 85 %.
      4. Stellen Sie die Endzellkonzentration auf 700–1.200 Zellen/μL an.
      5. Proben mit übermäßigem Abfall, zahlreichen toten Zellen, großen sichtbaren Aggregaten oder unvollständiger Dissoziation werden ausgeschlossen.
      6. Wiederholen Sie die Filtration vor dem Laden, wenn Zuschlagstoffe vorhanden sind.
      7. Prozesskontrolle und behandelte Proben unter identischen Bedingungen, einschließlich Dissoziationsenzym, Verdauungszeit, Pipettfrequenz, Filtrationsmethode, Zellkonzentration und Ladestrategie.
  3. Single-Cell-Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung
    1. Einzellenerfassung und Bibliotheksvorbereitung
      1. Laden Sie die vorbereitete Einzelzellenaufhängung gemäß den Anweisungen des Herstellers auf eine tropfenbasierte Einzelzellen-Fangplattform.
      2. Führen Sie Reverse-Transkription, cDNA-Amplifikation und Bibliotheksaufbau mit dem entsprechenden Einzelzell-3′-Workflow durch.
    2. Sequenzierungsparameter
      1. Sequenzbibliotheken mit einer Tiefe von mindestens 50.000 Lesevorgängen pro Zelle.
      2. Lastzellen, um eine Wiederherstellung von etwa 6.000–10.000 Zellen pro Bibliothek zu erreichen.
      3. Erfassen Sie die Sequenzchemie, die Lesestruktur und die Instrumenteneinstellungen.
  4. Qualitätskriterien für die nachgelagerte Analyse
    1. Stellen Sie sicher, dass die Endpräparierung eine hohe Zelllebensfähigkeit, minimale Ablagerungen und geringe Aggregatlast aufweist.
    2. Bestätigung der Eignung für die nachgelagerte Einzelzelltranskriptomanalyse der zellulären Heterogenität und der Zellzustandsübergänge.

5. Grundbasierte Verarbeitung und Qualitätskontrolle von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten

  1. Primärverarbeitung
    1. Erzeugung einer Zählmatrix
      1. Verarbeiten Sie Rohsequenzierungsdaten mit der empfohlenen Pipeline für die ausgewählte Plattform.
      2. Erstellen Sie eine Gen-nach-Zell-Zählmatrix.
      3. Erfassen Sie die Softwareversion, Referenzgenom-Build und Transcript-Annotationsfreigabe.
    2. Erste Qualitätsbewertung auf Bibliotheksebene
      1. Fassen Sie die Sequenzierungsmetriken für jede Bibliothek zusammen, einschließlich der Gesamtzahl der Lesungen, geschätzter Anzahl der wiedergewonnenen Zellen, mediane Gene pro Zelle, median UMIs pro Zelle und Sequenzierungssättigung (falls zutreffend).
      2. Verwenden Sie identische Referenzgenom- und Annotationseinstellungen für alle Proben.
  2. Qualitätskontrolle auf Zellebene
    1. Filterung von minderwertigen Zellen
      1. Bewerten Sie für jede Zelle die Anzahl der nachgewiesenen Gene, die Gesamtzahl der UMI, den Anteil der mitochondrialen Transkripte und den Hinweis auf Doublets oder Multiplets.
      2. Stellen Sie Zellen mit extrem niedrigen Genzahlen, extrem niedrigen UMI-Zahlen oder ungewöhnlich hohen mitochondrialen Transkriptanteilen aus.
      3. Definiere Filterschwellen basierend auf der Datensatzverteilung.
      4. Gleiche Schwellenwerte in den abgestimmten Behandlungsgruppen anwenden.
    2. Entfernung der wahrscheinlichen Dubletten
      1. Identifizieren Sie wahrscheinliche Doublets mit einer geeigneten rechnerischen Methode.
      2. Entfernen Sie Doublets mit einem plattformkompatiblen Detektionsworkflow.
      3. Wenden Sie dieselbe Doublet-Detektionsstrategie auf alle Proben an.
  3. Normalisierung, Clustering und Annotation
    1. Datennormalisierung
      1. Normalisieren Sie die gefilterte Zählmatrix mit einem standardisierten Single-Cell-RNA-Seq-Workflow.
      2. Wenden Sie identische Normalisierungsprozeduren auf allen Stichproben an.
    2. Dimensionsreduktion und Clusterbildung
      1. Führen Sie Dimensionsreduktion durch.
      2. Durchführung unüberwachter Clustering, um wichtige transkriptionelle Populationen zu identifizieren.
      3. Visualisieren Sie Zellzustände mit einer niedrigdimensionalen Einbettungsmethode wie UMAP.
    3. Markergen-Identifikation
      1. Identifizieren Sie Markergene mittels differentieller Expressionsanalyse zwischen Clustern.
      2. Weisen Sie den großen epithelialen Zellzuständen eine biologische Interpretation basierend auf der Markerexpression zu.
  4. Vergleichende Analyse der Behandlungsbedingungen
    1. Metadatenintegration
      1. Annotieren Sie jede Zelle mit der Behandlungsbedingung, der vom Patienten abgeleiteten organoiden Linie und der Verarbeitungscharge.
      2. Halten Sie eine konsistente Metadatenstruktur über alle Stichproben hinweg.
    2. Analyse behandlungsassoziierter Veränderungen
      1. Vergleichen Sie Kontroll- und behandelte Proben.
      2. Identifiziere therapieassoziierte transkriptionelle Remodellierung.
      3. Identifizieren Sie Verschiebungen in der Zellzustandszusammensetzung.
      4. Identifizieren Sie Kandidatenzellpopulationen, die mit therapeutischer Anpassung assoziiert sind.
      5. Interpretieren Sie Ergebnisse zusammen mit morphologiebasierten und Viabilitätsauswertungen.
  5. Datenanalyse-Ausgabe
    1. Erstellen Sie eine qualitätskontrollierte Gen-nach-Zell-Zählmatrix.
    2. Erzeugen Sie niedrigdimensionale Visualisierungen transkriptionell unterschiedlicher Populationen.
    3. Identifizieren Sie Markergene für große Cluster.
    4. Halten Sie Konsistenz über alle Proben im Referenzgenom, Preprocessing-Workflow, Filterkriterien, Clustering-Strategie und Annotationskriterien hinweg.
    5. Dokumentiere alle beispielspezifischen Abweichungen vom Standard-Workflow.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Entstehung und Charakterisierung von hepatozellulären Karzinomen (HCC)-Organoiden. In Abbildung 1A wurden patientenabgeleitete Tumorgewebe verwendet, um organoide Kulturen für histologische Analysen und Behandlungsstudien herzustellen. Abbildung 1B zeigt Hellfeldbilder von Organoiden an den Tagen 1 und 6 nach der Eroberung und zeigt Überleben und Expansion unter standardmäßigen...

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Diskussion

Um Reproduzierbarkeit, Effizienz und eine hochwertige Einzelzell-Transkriptomanalyse zu gewährleisten, erfordern mehrere technische Schritte in diesem Arbeitsablauf eine sorgfältige Kontrolle. Die Konsistenz während der Wiederbelebung und Expansion von patientenabgeleiteten HCC-Organoiden ist entscheidend, da Variationen in der Aussaatdichte, der Zusammensetzung der Basalmembranmatrix und dem Zeitpunkt der Kultur die Morphologie, das Wachstum und die nachgelagerten Behandlungsreaktionen ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), der Guangdong Foundation für Grundlagen- und Angewandte Grundlagenforschung (2023A1515011416) und der Guangzhou Foundation für Grundlagen- und Angewandte Grundlagenforschung (2024A04J6575) unterstützt. Einige schematische Elemente wurden mit Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) erstellt und von den Autoren angepasst. Schematische Illustrationen wurden mit Figdraw (https://www.figdraw.com) erstellt und von den Autoren angepasst.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
[Leu15]-gastrin I MenschMerckG9145
1,5-mL-MikroröhrenMerckAXYMCT150LC
1X RBC-LysispufferThermo Fisher Scientific00-4333-57
2,0ml Internal Thread Kryogene FläschchenNist607001
A8301 (TGFb-Inhibitor)Tocris Bioscience2939
AFP Polyklonaler AntikörperProteintech14550-1-AP
Anti-Albumin-Antikörper [ALB/2144]abcamab236492
Anti-HNF-4-Alpha-Antikörper [EPR16885] - ChIP-Qualitätabcamab181604
Anti-Prealbumin-Antikörper [EPR3219]abcamab92469
Anti-SOX9-Antikörper [EPR14335-78]abcamab185966
B27-Präparat (503), ohne Vitamin AThermo Fisher Scientific12587010
Zellwiederherstellungslösung, 100 mLCorning354253Reagenz, das zur Auflösung der Basalmembranmatrix und zur Rückgewinnung von Organoiden verwendet wird, bevor sie neu vernetzt oder nachgelagert verarbeitet werden
CellTiter-Glo®   3D-Zell-ViabilitätstestPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Bibliothek & Gel Bead Kit v3.110x GenomikCG000227
Corning Cell Sieb, 40 & mu; m, Blau, S, IND, 1/50Corning431750
Costar 24-Bohrloch, klarer flacher Boden Ultra-Low-Befestigung, Mehrfachschachtelplatten, einzeln umwickelt, sterilCorning3473
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Typ-2-PathClear (BME)Merck3533-005-02Extrazelluläre Matrix, die zur Unterstützung der dreidimensionalen Organoidkultur und Kuppelbildung verwendet wird
DMSOMerckC6164Lösungsmittel, das zur Herstellung von Arzneimittellagerlösungen und zur Fahrzeugkontrolle verwendet wird
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium/Hams F-12Thermo Fisher Scientific12634028Fortgeschrittene DMEM/F-12
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Tyrosin-Kinase-Inhibitor wird für die Behandlung organoider Organoide und therapeutische Störungen eingesetzt
Fetal Bovines Serum Value FBSGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscience1099
GlutaMAX-ErgänzungsmittelThermo Fisher Scientific35050061
Hämatoxylin- und Eosin-FärbungssetBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Leica DM6 B FluoreszenzmotormikroskopLeicaN/A
N2-Ergänzung (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-AcetylcysteinMerckA0737-5MG
NikotinamidMerckN0636
Nunc 15 mL konische, sterile Polypropylen-ZentrifugenröhrenThermo Fisher Scientific339651
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Phosphatgepufferte KochsalzlösungGENOM-BIOGRAFIEGNM20012Puffer, der zum Waschen von Organoiden und zur Vorbereitung von Proben für die nachgelagerte Verarbeitung verwendet wird
Rekombinantes menschliches EGFPeprotechAF-100-15
Rekombinanter menschlicher FGF10Peprotech100-26
Rekombinantes menschliches HGFPeprotech100-39
Rekombinanter menschlicher NogginPeprotech120–10°C
Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632-DihydrochloridMerckY0503ROCK-Inhibitor wird verwendet, um das Überleben organoider nach Auftauen oder Passaging zu verbessern
R-spodin1-konditioniertes Medium(Broutier et al.)N/ASekretion von Zelllinien
Trypan Blue Stain, 0,4 % membrangefiltert, zubereitet in 0,85 % KochsalzlösungGibco15250061
TrypLE Express Enzyme (1x), kein rotes PhenolThermo Fisher Scientific12604013Trypsin-Substitut
Wnt-3a-klimatisiertes Medium(Broutier et al.)N/ASekretion von Zelllinien

Referenzen

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