Entstehung und einzellige transkriptomische Analyse von hepatozellulären Karzinom-Organoiden nach medikamentöser Behandlung

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Erzeugung von hepatozellulären Karzinom-Organoiden, zur Anwendung einer medikamentösen Behandlung und zur Durchführung einer Einzelzell-RNA-Sequenzierung vor und nach der Behandlung, um therapieassoziierte transkriptionale Veränderungen zu charakterisieren.

Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom ist weltweit eine Hauptursache für krebsbedingte Sterblichkeit und zeichnet sich durch eine ausgeprägte intratumorale Heterogenität aus, die zu variablen Behandlungsreaktionen, Tumorrückfällen und Krankheitsprogression beiträgt. Ein tieferes Verständnis darüber, wie sich Tumorzellen auf Transkriptionsebene vor und nach der Behandlung verändern, ist daher unerlässlich, um therapeutische Strategien zu verbessern. Praktische experimentelle Arbeitsabläufe, die organoidbasierte Arzneimittelbehandlung mit nachgelagertem Single-Cell-Transkriptom-Profiling verbinden, bleiben jedoch begrenzt. In dieser Studie wird ein standardisierter Workflow zur Erzeugung von hepatozellulären Karzinom-Organoiden, zur Anwendung definierter medikamentöser Behandlung und zur Durchführung von Einzelzell-RNA-Sequenzierungen an vor und nach der Behandlung entnommenen Proben entwickelt. Das Protokoll umfasst die Wiederbelebung und Expansion von Organoiden, die Qualitätsbewertung vor der Behandlung, die Medikamentenexposition, die Vorbereitung von Organoiden zur Einzelzell-Dissoziation, den Aufbau einer Bibliothek sowie eine grundlegende vergleichende Analyse einzelzelliger Transkriptomdaten. Kritische technische Vorsichtsmaßnahmen werden getroffen, um die Reproduzierbarkeit und Probenqualität zu verbessern. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht eine parallele Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung und der transkriptionellen Veränderungen im Zusammenhang mit der medikamentösen Behandlung bei hepatozellulären Karzinom-Organoiden. Das Protokoll ist robust, skalierbar und anpassungsfähig über verschiedene organoide Systeme hinweg und bietet eine praktische Plattform, um behandlungsassoziierte Genexpressionsänderungen bei Einzelzellauflösung zu untersuchen.

Introduction

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist der häufigste primäre Leberkrebs bei Erwachsenen und weltweit eine Hauptursache krebsbedingter Todesfälle ^1,2,3. Das schlechte klinische Ergebnis ist auf eine signifikante intratumorale Heterogenität zurückzuführen, die zu Behandlungsresistenz und Rückfällen^führt. Eine aktuelle Studie zeigt, dass Entwicklungsvielfalt und Zellzustandsplastizität, angetrieben durch wichtige Transkriptionsprogramme wie die FOXM1/CEBPB-Achse, zur therapeutischen Resistenz in HCC⁵

Protocol

Studien mit menschlichem Gewebe wurden von den Komitees für ethische Überprüfung der Forschung der Guangzhou Medical University überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer GYZL-2024-KY31). Alle Verfahren mit menschlichen Proben wurden gemäß den institutionellen Richtlinien für die Forschung am Menschen durchgeführt. Von allen Patienten wurde eine schriftliche informierte Zustimmung für die Verwendung ihrer klinischen Proben für medizinische Forschung eingeholt. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Dieser Arbeitsablauf umfasst die Wiederherstellung un....

Results

Abbildung 1 zeigt die Entstehung und Charakterisierung von hepatozellulären Karzinomen (HCC)-Organoiden. In Abbildung 1A wurden patientenabgeleitete Tumorgewebe verwendet, um organoide Kulturen für histologische Analysen und Behandlungsstudien herzustellen. Abbildung 1B zeigt Hellfeldbilder von Organoiden an den Tagen 1 und 6 nach der Eroberung und zeigt Überleben und Expansion unter standardmäßigen.......

Discussion

Um Reproduzierbarkeit, Effizienz und eine hochwertige Einzelzell-Transkriptomanalyse zu gewährleisten, erfordern mehrere technische Schritte in diesem Arbeitsablauf eine sorgfältige Kontrolle. Die Konsistenz während der Wiederbelebung und Expansion von patientenabgeleiteten HCC-Organoiden ist entscheidend, da Variationen in der Aussaatdichte, der Zusammensetzung der Basalmembranmatrix und dem Zeitpunkt der Kultur die Morphologie, das Wachstum und die nachgelagerten Behandlungsreaktionen .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I Mensch	Merck	G9145
1,5-mL-Mikroröhren	Merck	AXYMCT150LC
1X RBC-Lysispuffer	Thermo Fisher Scientific	00-4333-57
2,0ml Internal Thread Kryogene Fläschchen	Nist	607001
A8301 (TGFb-Inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
AFP Polyklonaler Antikörper	Proteintech	14550-1-AP
Anti-Albumin-Antikörper [ALB/2144]	abcam	ab236492
Anti-HNF-4-Alpha-Antikörper [EPR16885] - ChIP-Qualität	abcam	ab181604
Anti-Prealbumin-Antikörper [EPR3219]	abcam	ab92469
Anti-SOX9-Antikörper [EPR14335-78]	abcam	ab185966
B27-Präparat (503), ohne Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Zellwiederherstellungslösung, 100 mL	Corning	354253	Reagenz, das zur Auflösung der Basalmembranmatrix und zur Rückgewinnung von Organoiden verwendet wird, bevor sie neu vernetzt oder nachgelagert verarbeitet werden
CellTiter-Glo®   3D-Zell-Viabilitätstest	Promega	G9681
CHIR99021	Merck	SML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Bibliothek & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomik	CG000227
Corning Cell Sieb, 40 & mu; m, Blau, S, IND, 1/50	Corning	431750
Costar 24-Bohrloch, klarer flacher Boden Ultra-Low-Befestigung, Mehrfachschachtelplatten, einzeln umwickelt, steril	Corning	3473
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Typ-2-PathClear (BME)	Merck	3533-005-02	Extrazelluläre Matrix, die zur Unterstützung der dreidimensionalen Organoidkultur und Kuppelbildung verwendet wird
DMSO	Merck	C6164	Lösungsmittel, das zur Herstellung von Arzneimittellagerlösungen und zur Fahrzeugkontrolle verwendet wird
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium/Hams F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Fortgeschrittene DMEM/F-12
E7080 (Lenvatinib)	Selleck	S1164	Tyrosin-Kinase-Inhibitor wird für die Behandlung organoider Organoide und therapeutische Störungen eingesetzt
Fetal Bovines Serum Value FBS	Gibco	A5256701
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX-Ergänzungsmittel	Thermo Fisher Scientific	35050061
Hämatoxylin- und Eosin-Färbungsset	Beyotime	C0105S
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluoreszenzmotormikroskop	Leica	N/A
N2-Ergänzung (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-Acetylcystein	Merck	A0737-5MG
Nikotinamid	Merck	N0636
Nunc 15 mL konische, sterile Polypropylen-Zentrifugenröhren	Thermo Fisher Scientific	339651
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	GENOM-BIOGRAFIE	GNM20012	Puffer, der zum Waschen von Organoiden und zur Vorbereitung von Proben für die nachgelagerte Verarbeitung verwendet wird
Rekombinantes menschliches EGF	Peprotech	AF-100-15
Rekombinanter menschlicher FGF10	Peprotech	100-26
Rekombinantes menschliches HGF	Peprotech	100-39
Rekombinanter menschlicher Noggin	Peprotech	120–10°C
Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632-Dihydrochlorid	Merck	Y0503	ROCK-Inhibitor wird verwendet, um das Überleben organoider nach Auftauen oder Passaging zu verbessern
R-spodin1-konditioniertes Medium	(Broutier et al.)	N/A	Sekretion von Zelllinien
Trypan Blue Stain, 0,4 % membrangefiltert, zubereitet in 0,85 % Kochsalzlösung	Gibco	15250061
TrypLE Express Enzyme (1x), kein rotes Phenol	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin-Substitut
Wnt-3a-klimatisiertes Medium	(Broutier et al.)	N/A	Sekretion von Zelllinien